酵素の固定化と安定化のための疎水性の塩で修飾ナフィオン

この手順の全体的な目的は、細胞内酵素の固定化および安定化のためのポリマーを合成することです。まず、Nafion懸濁液と臭化アンモニウム塩を混合し、ボルテックスミキサーで撹拌して、Nafionのプロトン化形態をアンモニウム塩に交換します。次に、得られた混合液をウェーイングボートに注ぎ、溶媒を蒸発させて、得られたポリマーを乾燥させます。

次に、余分な塩を除去するため、ポリマーを脱イオン水に12〜24時間浸します。塩の抽出後、ポリマーを水で洗浄し、蒸発させて完全に乾燥させます。最後のステップとして、ポリマーを清潔なバイアルに移し、酵素固定化に使用するために溶媒で再懸濁させます。最終的に、このマイセル酵素固定化ポリマーは、活性測定における酵素の安定性を向上させるために使用されます。

一般的に、この手法に慣れていない方は、手順が非常に単純に見えるため苦労することがありますが、機能性ポリマーの作製において乾燥工程は極めて重要です。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生が行います。Nafionを第4級アンモニウム塩で修飾する手順を開始します。Nafionポリマー上のスルホン酸基に対して3倍モルの過剰量となるアルキルアンモニウムブロミド塩を量り取ってください。

アルキルアンモニウムブロミド塩をガラスバイアルに激しく移します。5% (w/v) Nafion懸濁液のボトルを約30秒間振とうし、Nafionが溶液中に均一に懸濁していることを確認します。再懸濁したNafionを2 mLピペットで取り出し、AGUアンモニウムブロミド塩を含むガラスバイアルに加えます。

バイアルを900 RPMで10～15分間ボルテックスします。次に、粘性溶液をプラスチック製量り皿に注ぎ、バイアルに残った溶液をピペットで量り皿に移します。この例では、量り皿を部分的に覆い、実験台の上に放置することで、溶媒が完全に蒸発するまで6時間以上かけて蒸発させます。

適切な蒸発速度で全ての溶媒を完全に蒸発させると、ここで示されているように、秤量トレイの底に黄色または茶色の透明な膜が残ります。溶媒の蒸発が速すぎると、透明な膜の代わりにかさぶた状または結晶状の物質が形成され、これはポリマーのミセル構造が破壊されたことを示しています。溶媒の蒸発が遅すぎるか、あるいはアンモニウム塩を長時間反応させて水蒸気を吸収させすぎた場合は、粘着性のあるオレンジ色のゲルまたは白い結晶状物質が形成されます。

いずれの場合でも、手順を最初からやり直す必要があります。適切な蒸発速度ですべての溶媒が蒸発した後、計量トレイに18 MΩ·cmの脱イオン水を10〜20 mLまで満たし、過剰な臭化アンモニウム塩およびHBrを除去するために12〜24時間浸漬させます。12〜24時間後、水をピペットで吸い出し、トレイがいっぱいになるまで脱イオン水を加えます。ポリマーフィルムを紛失しないよう、常にフィルムから離れた位置から水を吸い出すように注意してください。

すすぎの後、合計3回洗浄します。ポリマーが完全に乾燥するまで、計量皿に蓋をせず放置してください。完全に乾燥すると、ポリマーは透明でやや脆いプラスチックフィルム状になります。

対照的に、適切に乾燥されていないポリマーは、ここで示されているように、塩抽出後に全く異なる外観になります。スパチュラを使用して、計量皿から乾燥したフィルムを注意深く取り除き、清潔なガラスバイアルに移します。2 mLのエタノールと3個のセラミックミキシングビーズを加え、ポリマーフィルムが完全に再懸濁するまで、または4時間、ボルテックスします。

アルキルアンモニウム修飾ナノ粒子溶液が完成し、酵素の固定化に使用できる状態になりました。固定化する酵素が粉末状である場合は、1.5 mLマイクロ遠心チューブに酵素を1 mg量り取り、100 mMのpH 7リン酸緩衝液を1 mL加えて、1 mg/mLの酵素溶液を作成します。この1 mg/mL酵素溶液を120 µL取り、新しいチューブに移します。

ALKアンモニウム修飾ナフィオン溶液を60 µL加え、10秒間ボルテックスします。多数のレプリケートを作成するためにこの混合物のスケールアップを行う場合は、酵素とポリマー溶液の比率を2:1に維持する必要があります。最後に、酵素ポリマー溶液60 µLを3つの独立した1 cm²キュベットの底にピペッティングし、一晩乾燥させます。

ポリマーフィルム内における酵素の安定性は、実演した酵素活性測定により評価できます。次に、このアッセイを開始するために、修飾NafionポリマーとNAD依存性脱水素酵素を共キャストしたキュベットに、以下の試薬を添加します。50 mM ピロリン酸ナトリウム 1.3 mL、調製直後の 15 mM ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD） 1.5 mL、および水 0.1 mL です。

キュベットを、波長340 nmに設定したUV-Vis分光光度計に設置し、ゼロ点調整を行います。分光光度計を用いて、キュベットに0.1 mLのエタノールを加え、ピペッティングで溶液を5回ゆっくりと吸い上げ、混ぜ合わせます。ブランクには、0.1 mLのエタノールの代わりに、0.1 mLの超純水を使用してください。試薬をキュベットに加えてから5分後に、340 nmにおける吸光度を測定します。

試薬をqveに添加してから20分後に、再度吸光度を測定します。これら2つのデータポイントをプロットして得られた傾きを用いて、固定化pqの酵素特異的活性を測定するための活性計算を行います。PQQ依存性脱水素酵素について、これらの試薬を、修飾nafionポリマーとPQQ依存性脱水素酵素と共に共鋳型化したqveにピペッティングします。1.5 millilitersのリン酸ナトリウムと、200 microlitersの600 micromolar pHメチルスルファートまたはPMSを使用します。

キュベットを波長 600 nanometers に設定した紫外可視分光光度計に設置し、ゼロ点調整を行います。分光光度計を用いて、700 microliters の 2-クロロ-5,6-ジメチルベンゾチアゾール（CDT）または DCIP と 200 microliters の目的の基質との混合液 100 microliters を添加します。ブランクとして、ピペッティングで溶液を緩やかに5回吸い上げ、混ぜ合わせます。

目的の基質の代わりに、200 µLの水を加えます。試薬を添加して5分後、600 nmにおける吸光度を測定します。

本アッセイの試薬添加から20分後に、再度吸光度を測定します。改質Nafionポリマーおよびグルコースオキシダーゼと共に共キャストしたQ VETに、以下の成分を含む溶液2 mLを添加します：0.2 M パラヒドロキシ安息香酸、0.02% アジ化ナトリウム、128 units のペルオキシダーゼ、0.3 mM 4-アミノアンチピリン、1 M リン酸カリウム、および 50 mM グルコース。

ピペッティングを5回繰り返し、溶液を調製します。Q vetを波長510 nanometersに設定したUV visible spectrophotometerに設置します。試薬をqveに添加してから5分後に測定を行います。

510ナノメートルの吸光度を測定します。その後、試薬添加から20分後に再び吸光度を測定します。この表は、固定化されたNAD依存性グルコース脱水素酵素の活性と、選択された修飾ナフィオンポリマーの分析結果を示しています。

固定化されたNAD依存性グルコース脱水素酵素は、酵素と緩衝液の溶液よりも比活性が低いことが観察されました。これは、ポリマー膜が大きな分子の輸送を低下させるためであり、アッセイの基質であるグルコースは小さいものの、補酵素であるNADが膜内外を拡散する必要があるためです。NAD依存性脱水素酵素において、ポリマーへの固定化による輸送制限は、観察される酵素活性を低下させます。

次の表は、固定化されたPQQ依存性グルコース脱水素酵素の活性および、選択された修飾ナフィオンポリマーのアッセイ結果を示しています。ここで重要なのは、緩衝液中の酵素と比較して、ほとんどのナフィオンフィルム上に固定化された酵素の活性が高いことです。PQQ依存性グルコース脱水素酵素は膜結合性タンパク質であるため、疎水性に修飾されたミセル状のナフィオンは、緩衝液よりも膜に近い環境を提供して活性を持つPQQ依存性グルコース脱水素酵素を安定化させ、その結果、酵素活性を向上させます。

最後に、グルコースオキシダーゼ比活性の代表的なアッセイ結果を示します。固定化および選別された修飾ナフィオンポリマーを表にまとめています。3種類の酵素それぞれを用いた各ポリマーの酵素アッセイにより、遊離酵素および溶液と比較した相対比活性の傾向は、酵素系によって異なることが分かります。

したがって、各酵素に必要となる正確なポリマーを最適化する必要があります。この手順を行う際は、乾燥ステップがこの特定のプロトコルにおいて極めて重要であることを忘れないでください。