Name: 膵臓腺癌組織のパラフィン包埋したスライド上のB7-H1（PD-L1）の免疫組織化学的染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学ぶ免疫組織化学染色法で膵臓腺癌組織のB7-H1（PD-L1）発現を可視化する方法です。パラフィン包埋スライドを用いて抗原抽出と抗体染色を行い、腫瘍微小環境における免疫抑制メカニズムを解析できます。

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EBは、KMB、とHXは均等に貢献しています。本研究では、消化器癌P50 CA062924、NIHのK23 CA148964、ラストガーテン財団、Viragh財団、ASCOの若手研究者賞は、NIH 5T32 CA0090701-28トレーニンググラント、ソルゴールドマン膵臓癌センター、国立膵臓FoundationのNCIの胞子によってサポートされていました。

B7-H1/PD-L1、免疫調節細胞表面タンパク質のB7ファミリーのメンバーは、プログラム死1（PD、その受容体との相互作用を介して細胞性免疫応答の負の調節に重要な役割を果たしている-1）1,2。腫瘍細胞によるB7-H1の過剰発現は、黒色腫、神経膠芽腫、肺の癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、腎細胞を含むヒトの癌の数で注目されており、抗腫瘍損なうことが示されているTシャツを細胞免疫3-8。 最近では、膵臓腺癌組織によるB7-H1の発現は、潜在的な予後マーカー9,10として同定されている。さらに、膵臓癌のマウスモデルにおいて、B7-H1の封鎖は、抗腫瘍応答11を生成することが示されている。これらのデータは、潜在的な治療標的としてのB7-H1の重要性を示唆している。抗B7-H1の封鎖抗体は、したがって、複数の人間のための臨床試験で検証されています黒色腫と肺、結腸、腎臓、胃、膵臓12の癌を含む固形腫瘍。 最終的にはB7-H1標的療法の恩恵を受ける患者を識別できるようにするためには、B7-H1およびB7-H1の封鎖抗体による処置に対する患者の応答の発現と局在の相関関係を調査することが重要です。免疫組織化学を通してヒト膵臓腺癌組織におけるB7-H1の発現を調べると、この共抑制シグナル伝達分子は、腫瘍の微小環境における腫瘍免疫の抑制に寄与する方法のより良い理解を与える。チェンと同僚によって開発された抗B7-H1モノクローナル抗体（クローン5H1）は、ヒト腫瘍組織の複数のタイプ4,8の凍結切片で信頼性の高い染色結果を生成することが示されているが、パラフィン包埋されたスライド上の染色がするまで挑戦していた最近13から18。我々は、B7-H1 stainiを開発しました膵臓腺癌組織のパラフィン包埋されたスライドのngのプロトコル。ここで説明するB7-H1染色プロトコールは少し背景に、B7-H1の一貫性のある膜と細胞質染色を生成します。 1。デparafinization <ol><li>焼く20分間55℃でスライドします。 </li><li> 10分間、キシレン中の化学フード内、浸すスライド。 </li><li> 10分間、新鮮なキシレンに浸してスライドする。 </li><li>浸し、5分間100％エタノール中でスライドします。 </li><li> 5分間、新鮮な100％エタノールでスライドを浸す。 </li><li>浸し、5分間、95％エタノールにスライド。 </li><li>浸し、5分間、80％エタノールにスライド。 </li><li> 5分間脱イオン水でスライドを浸す。 </li></ol> 2。抗原回復<ol><li>その後125℃で30秒間のTris-EDTA緩衝液（pH9.0）と圧力鍋の熱、90℃で10秒間、Cに浸しスライド。 </li><li> 60分間のクールなスライドしてみましょう。 </li><li> 5分間TBSTに浸しスライド; REPE2倍で。 </li></ol> 3。染色<ol><li>スライド上の組織の周りのソリューションを拭き取ってください。疎水性のペンで組織の周りに円をマークします。 </li><li>湿度室でスライドを置き、全体の染色プロセス全体を通して、スライド上の組織の乾燥を避ける。 5分間ペルオキシダーゼブロック内のスライドとインキュベートスライド上に疎水性の円内にペルオキシダーゼブロックの代わりに1滴（完全に組織領域をカバーする約200μl以上）。 </li><li> 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。 </li><li> 15分間インキュベートし、各スライドにブロッキングバッファーをブロックエースの代わりに一滴。 </li><li> 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。 </li><li> 15分間インキュベートし、各スライド上のアビジン溶液の代わりに一滴。 </li><li> 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。 </li><li> 15分間インキュベートし、各スライドにビオチン溶液の代わりに一滴。 </li><li> SLIすすぎTBSTでデ、その後5分間、TBSTで配置します。 </li><li> 4で200μlのTBST中κアイソタイプコントロールマウス抗B7-H1モノクローナル抗体（クローン5H1）またはマウスIgG1の1:1000希釈でスライドをインキュベート℃で22時間+ / - のC一晩 - 1時間。 TBST中で最終的な抗体濃度が2.57μg/ mLである。 </li><li> 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。二回繰り返します。 </li><li> 30分間1:500濃度（200μlの2％ヤギ血清溶液中）でビオチン結合ラット抗マウスIgG1二次抗体を用いてスライドをインキュベートする。 </li><li> 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。二回繰り返します。 </li><li> 15分間インキュベートし、各スライド上のストレプトアビジン - ビオチン複合体の場所は1滴（使用前に少なくとも30分を準備しなければなりません）。 </li><li> 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。二回繰り返します。 </li><li> 4分間インキュベートし、各スライド上の増幅試薬の代わりに1滴（TBSTで2:1に希釈したもの）。 </li><li> TとスライドをすすぐBSTは、その後5分間TBSTで配置します。二回繰り返します。 </li><li> 15分間インキュベートし、各スライド上のストレプトアビジン-H​​RPの代わりに一滴。 </li><li> 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。二回繰り返します。 </li><li>場所は1つ各スライドの3,3 - ジアミノベンジジン（DAB）基板とクロモゲンのドロップと2分間発色する。 </li><li>すぐに発色した後、1〜2分間ddH 2 Oでスライドを洗浄します。 </li><li> 90秒のヘマトキシリン​​1滴でスライドをインキュベートする。 </li><li> 1〜2分間ddH 2 Oで洗浄します。 </li><li> 1〜2分間石鹸水道水で洗ってください。 </li><li> 1〜2分間ddH 2 Oで洗浄します。 </li></ol> 4。脱水および取り付け<ol><li> 3分間80％エタノール中でスライドを浸す。 </li><li> 3分間95％エタノール中でスライドを浸す。 </li><li> 5分間100％エタノールにスライドを浸す。繰り返します。 </li><li> 5分間キシレンにスライドを浸す。繰り返します。 </li><li>一滴を追加スライドとカバースリップ場所にCytoseal 60。 </li></ol> 表1は、上記の手順で使用する試薬。

<ol><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+B7s%3A+playing+a+pivotal+role+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity.</a> J. Immunother. 30, 251-260 (2007).</li>
<li>Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1%2C+a+third+member+of+the+B7+family%2C+co-stimulates+T-cell+proliferation+and+interleukin-10+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.</a> Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).</li>
<li>Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+improves+myeloid+dendritic+cell-mediated+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity.</a> Nat. Med. 9, 562-567 (2003).</li>
<li>Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDong%2C+H+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 8, 793-800 (2002).</li>
<li>Dong, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+pathway+and+its+role+in+the+evasion+of+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity.</a> J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).</li>
<li>Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+blockade+augments+adoptive+T-cell+immunotherapy+for+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma.</a> Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).</li>
<li>Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+and+PD-1+by+monoclonal+antibodies+potentiates+cancer+therapeutic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity.</a> Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+B7-H1+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+Indicator+of+tumor+aggressiveness+and+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).</li>
<li>Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+up-regulated+expression+in+human+pancreatic+carcinoma+tissue+associates+with+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).</li>
<li>Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+regulation+of+the+costimulatory+molecule+B7-H1+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer.</a> Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).</li>
<li>Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+or+B7-DC+induces+an+anti-tumor+effect+in+a+mouse+pancreatic+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model.</a> Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).</li>
<li>Wang, S., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+cancer+therapies+targeting+CD137+and+B7-H1%2FPD-1+cosignal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).</li>
<li>Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+glycoprotein+blockade%3A+a+novel+strategy+to+enhance+immunotherapy+in+patients+with+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma.</a> Urology. 66, 10-14 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+B7-H1+is+associated+with+poor+prognosis+in+renal+cell+carcinoma+patients+with+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up.</a> Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).</li>
<li>Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+B7-H1+expression+in+clear+cell+carcinoma+of+the+kidney+for+prognostication+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy.</a> Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).</li>
<li>Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-expressed+B7-H1+and+B7-DC+in+relation+to+PD-1%2B+T-cell+infiltration+and+survival+of+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).</li>
<li>Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+%28B7-H1%29+expression+by+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+and+BCG-induced+granulomata%3A+associations+with+localized+stage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression.</a> Cancer. 109, 1499-1505 (2007).</li>
<li>Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+B7-H1+and+B7-1+expressions+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma.</a> World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).</li>
<li>Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+therapeutic+potential+of+the+programmed+death-1+ligand%2Fprogrammed+death-1+pathway+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer.</a> Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).</li>
<li>Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+inflammatory+response+with+B7-h1+expression+in+human+melanocytic+lesions+supports+an+adaptive+resistance+mechanism+of+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape.</a> Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

凍結切片上のB7-H1の免疫組織化学的染色は、癌3,4の様々な先行研究で報告されている。しかし、臨床腫瘍サンプルは、通常、パラフィン包埋ブロックの形で提供されています。 5H1モノクローナル抗体は、より最近に正常腎細胞癌、子宮頚癌、膀胱癌、悪性黒色腫13から18を含むパラフィン包埋腫瘍組織の染色に応用されてきた。パラフィン包埋9,19または他のモノクローナル抗体を用いた膵臓腺癌組織のクライオスタット20節で、B7-H1の染色も報告されている。ここでは、B7-H1へ5H1モノクローナル抗体を用いたパラフィン包埋された膵臓腺癌組織の正常な染色を示した。膵臓腺癌におけるB7-H1の発現は、メラノーマ4,21などの悪性腫瘍の多くの他のタイプと同様、不均一である。 B7-H1 arの膜と細胞質の両方の式eは腺癌細胞（ 図1と図2）を用いて観察。 B7-H1の膜式は、その生物学的機能と一貫性があります。腫瘍組織におけるB7-H1細胞の役割が検討されていない。通常の膵管上皮または腺細胞（ 図4...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> CSAシステム</td><td>ダコ</td><td> K1500 </td><td>ペルオキシダーゼブロック、ストレプトアビジン - ビオチン複合、増幅試薬、ストレプトアビジン-H​​RPおよびDAB基質とクロモゲン：プロトコルに記載されている以下の試薬が含まれています</td></tr><tr><td>アビジン/ビオチンブロッキングキット</td><td>ベクトル</td><td> SP-2001 </td><td></td></tr><tr><td>ブロックエース</td><td> Serotec社</td><td> BUF029 </td><td></td></tr><tr><td>ビオチン抗マウスIgG1 </td><td> BD </td><td> 553441 </td><td></td></tr><tr><td>マウスIgG1 Kアイソタイプコントロール</td><td> eBioscience社</td><td> 14-4714-85 </td><td></td></tr><tr><td> TBS（トリス緩衝生理食塩水）、10X </td><td> Cellgro </td><td> 46から012-CM </td><td> 10xTBSは80g / LのNaClおよび24.2 g / LのTIRを含んでいます。 洗浄用ddH2Oで1Xに希釈; </td></tr><tr><td>ツイーン20 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P1379 </td><td> 1ミリリットルはTBSTを作るために1X TBSの1Lに加え</td></tr><tr><td>ターゲット検索、20X </td><td> Celerusウェーブ</td><td> 014-3000-000 </td><td> ddH 2 Oで1倍に希釈し</td></tr><tr><td> 190プルーフエチルアルコール</td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 111000190 </td><td></td></tr><tr><td> 200プルーフエチルアルコール</td><td> Pharmo-Aaper </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td> VWR </td><td> 95057-827 </td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>リチャード·アラン·サイエンティフィック</td><td> 72804 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td>リチャード·アラン·サイエンティフィック</td><td> 8310から4 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>コー​​ニング</td><td> 2940-245 </td><td></td></tr><tr><td>湿度室</td><td>シグマ</td><td> H6644 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1試薬と機器。 </td></tr></tbody></table>

膵臓腺癌組織のパラフィン包埋したスライド上のb7-h1（pd-l1）の免疫組織化学的染色

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1、免疫調節細胞表面タンパク質のB7ファミリーのメンバーは、プログラム死1（PD、その受容体との相互作用を介して細胞性免疫応答の負の調節に重要な役割を果たしている-1）1,2。腫瘍細胞によるB7-H1の過剰発現は、黒色腫、神経膠芽腫、肺の癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、腎細胞を含むヒトの癌の数で注目されており、抗腫瘍損なうことが示されているTシャツを細胞免疫3-8。 最近では、膵臓腺癌組織によるB7-H1の発現は、潜在的な予後マーカー9,10として同定されている。さらに、膵臓癌のマウスモデルにおいて、B7-H1の封鎖は、抗腫瘍応答11を生成することが示されている。これらのデータは、潜在的な治療標的としてのB7-H1の重要性を示唆している。抗B7-H1の封鎖抗体が故にmulのための臨床試験で検証されています黒色腫と肺、結腸、腎臓、胃、膵臓癌を含む12のtipleヒト固形腫瘍。 最終的にはB7-H1標的療法の恩恵を受ける患者を識別できるようにするためには、B7-H1およびB7-H1の封鎖抗体による処置に対する患者の応答の発現と局在の相関関係を調査することが重要です。免疫組織化学を通してヒト膵臓腺癌組織におけるB7-H1の発現を調べると、この共抑制シグナル伝達分子は、腫瘍の微小環境における腫瘍免疫の抑制に寄与する方法のより良い理解を与える。チェンと同僚によって開発された抗B7-H1モノクローナル抗体（クローン5H1）は、ヒト腫瘍組織の複数のタイプ4,8の凍結切片で信頼性の高い染色結果を生成することが示されているが、パラフィン包埋されたスライド上の染色がするまで挑戦していた最近13から18。我々は、devがある膵臓腺癌組織のパラフィン包埋されたスライドの駆け落ちB7-H1染色プロトコール。ここで説明するB7-H1染色プロトコールは少し背景に、B7-H1の一貫性のある膜と細胞質染色を生成します。

B7-H1の成功した免疫組織化学的染色は、膵臓腺癌におけるB7-H1（茶色信号のDAB発色）の異種発現を実証します。他の人がB7-H1またはB7-H1（ 図2、図3）を少し表現のいずれかの主に細胞質発現を持っているのに対し、一部の膵臓腺癌細胞がB7-H1の主に膜状の発現（ 図1A）を持っています。通常の膵管上皮は少しB7-H1（ 図4）を発現する 。代わりに抗B7-H1抗体のマウスIgG1κアイソタイプコントロール抗体で染色すると、少しバックグラウンド染色（ 図1B）を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/4059/4059fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。抗B7-H1とA.免疫組織化学的染色は、クローン5H1抗体は、...

B7-H1（PD-L1）とPD-1への結合は、腫瘍の微小環境における主要な腫瘍誘発免疫抑制信号を提供します。膵臓腺癌におけるB7-H1の発現と局在を特徴付けるための免疫組織化学的染色法はここで説明されます。

膵臓腺癌組織のパラフィン包埋したスライド上のB7-H1（PD-L1）の免疫組織化学的染色

免疫調節細胞表面タンパク質のB7ファミリーの一員であるB7-H1/PD-L1は、細胞性免疫の負の調節において重要な役割を果たしており...

この手順の全体的な目的は、免疫組織化学的染色法を用いて、ヒト膵腺癌組織のパラフィン切片におけるB7-H1 (PD-L1) の発現を評価することです。まず、スライスした組織切片からパラフィンを除去し、組織を再水和させることでこれを達成します。手順の第2段階は抗原賦活化であり、圧力鍋を用いて組織を染色します。抗体染色手順の後、信号増幅およびDAB発色ステップを行います。最終ステップとして、組織の脱水と封入を行います。完了後、顕微鏡観察と画像解析を用いることで、膜および細胞質におけるB7-H1を可視化できます。これにより、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫の抑制にB7-H1/BTL1がどのように寄与しているかについての理解が深まり、膵管腺癌の研究における重要な疑問への回答に役立ちます。凍結切片による染色のなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、より入手しやすく保存が容易なことが多いパラフィン包埋組織切片での使用に最適化されている点にあります。スライド上での信頼性の高い抗体染色は、まずパラフィンを除去しなければ不可能です。したがって、パラフィン包埋組織を用いたスライドを調製するには、まずスライドを55 °Cで20分間加熱します。次に、化学薬品用フード内で、パラフィン除去のために7段階の化学処理液を使用します。まず、スライドをキシレンに10分間浸します。次に、スライドを2回目の新しいキシレン浴に10分間浸します。3番目に、スライドを100%エタノールに5分間浸します。4番目に、再度、スライドを新しい100%エタノールに5分間浸します。5番目に、スライドを95%ethanolに5分間浸します。6番目に、スライドを80%ethanolに5分間浸します。最後に、スライドを脱イオン水で5分間洗浄してきれいにします。パラフィンを除去した後、次に抗原を露出させる必要があります。まず、スライドをTris EDTA緩衝液に浸します。次に、圧力鍋を用い、2段階のプログラムでスライドを加熱します。まず、125 °Cで30秒間加熱します。次に、90 °Cで10秒間加熱します。その後、スライドを置いて室温まで冷却します。スライドを1時間冷却した後、TBSTで2回、1回につき5分間洗浄します。これで各スライドの染色が可能です。まず、組織周囲のTBST溶液を吸い取って乾燥させ、次に疎水性ペンで組織の周囲に円を描きます。この手順の間、スライドを加湿チャンバーに入れて組織の乾燥を防いでください。浸漬していないときは、スライド上の疎水性サークル内にペルオキシダーゼブロックを1滴滴下します。5分間待機し、TBSTでペルオキシダーゼを洗い流してください。次に、スライドをTBSTに5分間浸します。スライドを溶液から取り出し、余分なTBSTを軽く振り落として除去します。その後、各スライドにCEブロッキングバッファーを1滴滴下し、室温で15分間インキュベートします。スライドをTBSTでリンスし、5分間浸漬して洗浄します。次に、各スライドにVidan溶液を1滴滴下し、15分間待ちます。その後、同様のTBSTによるリンスと浸漬の手順でAVADONを除去します。次にビオチンを適用します。5分間待機した後、スライドを再度TBSTで洗浄します。その後、マウスモノクローナル抗体またはコントロール抗体の希釈液を用いてスライドをインキュベートします。TBST中で、いずれかの抗体を4°Cで22時間反応させ、結合させます。翌日、前述と同様にスライドをTBSTで3回洗浄します。各洗浄は、TBSTでのすすぎと5分間の浸漬を含みます。一次抗体を洗浄する間、この3回の洗浄工程を繰り返し行います。STR titin Bio ITIN複合体溶液を調製します。この溶液は、使用する少なくとも30分前に調製しておく必要があります。次に、スライドをビオチン標識ヤギ抗US二次抗体を含むヤギ血清溶液で30分間インキュベートします。このインキュベーション中に、DACOキットの手順に従ってDAB基質クロモゲン溶液を調製してください。この溶液は、4°Cの暗所で最大8時間まで保存可能です。インキュベーション後、TBSTで3回洗浄します。次に、ストリッピング・ビオチン複合体を1滴滴下します。各スライドを15分間インキュベートし、その後、TBSTで3回洗浄します。次に、各スライドに増幅試薬を1滴滴下します。4分間待ち、TBSTでスライドを3回洗浄します。増幅試薬を洗い流した後、各スライドにストレプトアビジンHRPを1滴加え、15分間インキュベートします。次へ進む前に、再度TBSTで3回洗浄を行います。ここからが本手順において最も繊細なステップとなります。スライドにDAB基質CHROMOGENと基質過酸化水素を1滴ずつ加え、発色を確認し始めます。これがDAB基質です。発色剤による発色時間は通常2分ですが、最適な染色を確実にするため、ルーチンとして顕微鏡下で発色状況をモニターしています。染色の各ラウンドで背景染まりを最小限に抑えるため、前回のバッチから1枚のスライドと、陽性コントロールとして扁桃腺のスライド1枚を同時に処理します。完了後、直ちにTBSTではなく水でスライドを洗浄してください。スライドにヘマチンの液滴を1滴滴下し、90秒間インキュベートします。直ちに蒸留脱イオン水でスライドを洗浄し、続いて石鹸水を混ぜた水道水、さらに再び蒸留脱イオン水で洗浄します。これで染色手順は完了です。すべてのスライドの染色が完了したら、エタノール系列を用いてスライドを脱水し、封入します。まず、スライドを80% ethanolに3分間浸します。次に、スライドを95% ethanolに3分間浸します。3回目と4回目の浸漬では、スライドを100% ethanolに5分間浸します。5回目と6回目は、スライドをキシレンに5分間浸します。最後に、各スライドに1滴の量を加え、カバーガラスをそっと被せます。これでスライドの準備が整い、B7-H1を用いた免疫組織化学的染色の顕微鏡観察が可能です。膵腺がんにおけるB7-H1の不均一な発現が示されています。これらはDAB発色により茶色に染まって見えます。膵腺がん細胞の中には、B7-H1が主に細胞膜に発現しているものもあれば、主に細胞質に発現しているもの、あるいはほとんど発現していないものもあります。正常な膵管上皮ではB7-H1の発現はわずかでした。抗B7-H1抗体の代わりにマウスIgG1 kappaアイソタイプコントロール抗体を用いて染色したところ、バックグラウンド染色はほとんど見られませんでした。この手法に習熟すれば、適切に実施した場合、22時間のオーバーナイトインキュベーションを含め、2日間で計7時間で完了させることができます。この手法により、腫瘍学分野の研究者が他の悪性腫瘍におけるB7-H1/PD-L1シグナル伝達を探索する道が開かれました。

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膵臓腺癌組織のパラフィン包埋したスライド上のB7-H1（PD-L1）の免疫組織化学的染色

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