ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出

この手順の全体的な目的は、ミクログリアにおけるマイクロRNAの発現を解析することである。まず、脳と脊髄を解剖し、次に中枢神経系（CNS）組織をホモジナイズすることでこれを達成する。第二のステップでは、パーコール勾配を用いてCNSから単核細胞を分離し、その後、FACSによってミクログリア集団を同定する。

次に、ミクログリアのRNAを抽出し、サンプルの品質を解析します。最後に、目的の特定のmicroRNAについてリアルタイムPCRを行います。最終的に、デルタデルタCT法を用いることで、ミクログリアにおける特定のmicroRNAの相対的な発現レベルを示すことができます。

一般的に、この手法に不慣れな方は、CNSから十分な数の単核細胞を単離できないことや、サンプルに髄鞘や細胞残渣などの混入があることで、困難に直面します。どちらの場合も調製物の品質低下を招き、それぞれRNA低濃度またはタンパク質の混入という結果になります。本手順のデモンストレーションは、私とvirが行います。

すべてのマウスの灌流後、脳と脊髄を摘出します。次に、脳1つと脊髄1つを15 milliliterのダウンズホモジナイザーに入れ、その都度5 milliliterのPBSを組織に加えます。10〜20回ゆっくりとストロークした後、ホモジナイザーの中身を70 micronのセルストレーナーを通して個別の50 milliliterコニカルチューブに移し、834 times G、4 °Cで5〜7分間遠心分離します。

上清を捨てた後、2〜3匹のマウスから得た脳および脊髄のホモジネートを 5〜7 mL の 70% Percoll に再懸濁します。次に、7 mL の 40% Percoll を重ね、Percollおよび細胞溶液を 20 °C で 850 ×g で 30 分間、ブレーキなしで遠心分離します。70% Percoll の上層にある死細胞、ミエリン、およびデブリを廃棄します。

次に、70%と40%のパーコール溶液の界面から単核細胞を回収し、回収した細胞をPBSで少なくとも1:1の割合で希釈します。細胞を遠心分離した後、ペレットを0.5 mLのPBSで再懸濁し、1.7 mLのエッペンドルフチューブに移します。密度勾配分離した細胞50 µLを新しい1.7 mLのエッペンドルフチューブに移し、そこに350 µLのFACSバッファーを加えることから始めてください。

次に、5から10 µLのanti FCR抗体をチューブに加え、細胞を氷上で10から15分間インキュベートします。細胞サンプルを2本のエッペンドルフチューブに分注し、一方のチューブに1 µLのanti CD 11 Bおよび2 µLのanti CD 45抗体を加えます。

細胞を氷上でさらに10〜15分間インキュベートします。2本目のチューブに「陰性対照」とラベルを貼り、氷上に置きます。染色抗体でのインキュベーション後、両方のチューブに1 mLのfaxバッファーを加え、マイクロ遠心機で1200 ×gで5分間遠心分離して細胞を回収します。

G.次に、ペレットをPBSで調製した1%パラホルムアルデヒド 400 µLで固定し、凝集を防ぐためにチューブをボルテックスします。最後に、陰性対照細胞サンプルとBD com beadsを用いて、フローサイトメトリーにより細胞を解析します。まず、EAEを誘導するため、8〜12週齢のC 57 black sixマウス 5〜10匹の群に、complete frons adjuvant（4 mg/mL）で調製したMOG 35-55ペプチド 150 mgを皮下投与します。その後、免疫後0日目と2日目に百日咳毒素を腹腔内投与します。

前述の手順で細胞を単離し染色した後、分取の直前に、固定液ではなく400 µLのPBSでペレットを再懸濁します。次に、サンプル回収用に、10% FBSを添加した300 µLのPBSを2本の1.7 mLエッペンドルフチューブに満たします。最後に、この代表的な密度プロットに示すゲーティング戦略を用いて、ミクログリアおよびマクロファージ集団を高純度で分取します。

ソーティング後、マイクログリアおよびマクロファージ集団を再解析し、単離した細胞サンプルの純度を決定します。ソートされた細胞集団をマイクロ遠心分離機を用いて1200 ×gで5〜7分間遠心分離した後、上清を慎重に取り除き、細胞ペレットをドライアイスで凍結させます。次に、凍結した細胞ペレットを通常の氷上に移します。

解凍のため、Nirvanaキットの溶解バッファーを300 µL加え、ピペッティングを5〜7回行い、細胞溶液を緩やかに混合します。次に、ホモジネート添加剤を30 µL加え、細胞懸濁液を30秒間ボルテックスし、チューブを氷上で10分間静置します。その後、酸性フェノール・クロロホルムを300 µL加え、さらに30秒間チューブをボルテックスします。

次に、細胞を9,500 ×gで5分間遠心分離し、水相を含む上清の上層300 µLを新しい1.7 mLエッペンドルフチューブに慎重に移します。この溶液を375 µLの100% ethanolと混合します。チューブの内容量すべてをNirvanaキットのフィルターカートリッジに移し、9,500 ×gで1分間遠心分離します。その後、フロスルーバッファーを廃棄します。

カートリッジを洗浄した後、Nirvanaキットの洗浄液1を700 µL加え、9,500 ×gでさらに1分間遠心分離します。洗浄液2を500 µL用いて、同様に2回繰り返します。あらかじめ加熱したヌクレアーゼフリーウォーターを60 µL加え、カートリッジからRNAを溶出させます。

最後に、NanoDrop分光光度計を用いてRNAの純度と量を評価した後、リアルタイムQ-R-T-P-C-Rを行い、ミクログリアおよびマクロファージサンプル中のmicroRNAを検出します。蛍光標識されたmere 1 24およびsnow RNA 55のPCR産物のP-R-T-P-C-R曲線は、最初のグラフに示すように作成できます。ミクログリアまたは骨髄由来マクロファージから単離したコントロールのsnow RNA 55 RNAサンプルにおける、PCRサイクル数に対する蛍光標識特異的PCR産物量の代表的な曲線を示します。

異なる細胞集団からのsnow RNA 55発現の解析におけるCT値が、グラフ上の緑色と青色の垂直線で示されているように、ベースラインとQ-R-T-P-C-R曲線の線形範囲の下部との交点で決定されていることに注目してください。この2番目のグラフでは、ミクログリアまたは骨髄由来マクロファージからの実験的なmere 1 24 RNAサンプルに対する蛍光標識特異的PCR産物の量と、PCRサイクル数との関係が示されています。異なる細胞集団からのmere 1 24発現の解析におけるCT値が、ここでも同様に、グラフ上の緑色と青色の垂直線で示されているように、ベースラインとQ-R-T-P-C-R曲線の線形範囲の下部との交点で決定されていることに注目してください。

この表に示されている正常マウスおよびEAEマウスのミクログリアおよびBMdmにおけるsnoRNA 55とmiR-124の発現のように、各サンプルのCT値を決定した後、各サンプルの各デュープリケートのΔCT値を算出するため、実験群のmiR-124サンプルのCT値から対照群のsnoRNA 55サンプルのCT値を引きます。次に、他のサンプルのΔCT値から参照サンプルのΔCT値を引き、ΔΔCT値を算出します。最後に、この密度プロットに示されているように、各サンプルの相対的な発現レベルを2のマイナスΔΔCT乗として算出します。

正常な中枢神経系（CNS）からミクログリアが適切に単離できた場合、細胞の95～98%がCD 11 B陽性かつCD 45 lowのミクログリアであり、細胞懸濁液の2～5%がCD 11 B陽性かつCD 45 highの血管周囲マクロファージで構成されます。一方で、CD 11 B陰性かつCD 45 highのリンパ球、あるいはCD 11 B陰性かつCD 45陰性のアストログリア、オリゴデンドログリア細胞、または細胞断片は1%未満となります。対照的に、不適切な調製では、アストログリアやミエリン粒子などのCD 11 B陰性かつCD 45陰性の細胞または細胞断片が著しく混入し、RNA単離やその後の解析に適さない状態となります。さらに、灌流不十分による血液リンパ球の混入を示すCD 11 B陰性かつCD 45 highの細胞が存在する場合もあります。この密度プロットでは、神経炎症時にCNSに存在する3つの細胞集団、すなわちCD 11 B陽性かつCD 45 lowのミクログリア、CD 11 B陽性かつCD 45 highのマクロファージ、およびCD 11 B陰性かつCD 45 highのリンパ球が示されています。

適切な抽出後と不適切な抽出後のゲル電気泳動によって決定されたRNAの品質を示します。RNAが清潔に抽出された場合、RNAラダーとリボソームRNAが明確に認められますが、抽出プロセスが不適切に行われた場合は、スメアリングや低分子量の分解産物が認められます。これらの最終データは、正常な成人のミクログリア、EAEを発症したマウスのミクログリア、および発生の初期段階のマウスから単離されたミクログリアにおけるmere 1 24の発現を実証しています。

この最初の棒グラフでは、正常なCNS由来のミクログリアにおけるmere 1 24の相対的発現量は、骨髄由来マクロファージで観察されたものよりも格段に高くなっています。同様に、EAEマウスのCNS由来マクロファージにおいてもmere 1 24 RNAの増加が見られますが、ミクログリアでは依然として5倍の量のmere 1 24 RNAが発現しています。この最後の棒グラフは、本手法を用いて、成体（8週齢）マウスと比較した、1週、2週、および4週齢のマウスの発生過程におけるミクログリアのmere 1 24発現レベルの変化をどのように評価できるかを示しています。

実験全体で良好な結果を得るためには、十分な量と高品質の単離細胞を確保することが重要であるということを忘れないでください。