Name: ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 学ぶリアルタイムPCRによるミクログリア内マイクロRNA検出法。Percoll密度勾配遠心とフローサイトメトリーで細胞を分離し、神経炎症時の免疫応答メカニズム解明に貢献します。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

最近大きな関心は、ミクログリアと神経炎症および神経変性に関連する多くの病態におけるこれらの細胞の関与に与えられた。さらに、免疫やがん細胞の分化におけるマイクロRNAの役割は劇的に過去数年間5,10を介して成長してきました。我々は以前通常のCNS ​​におけるミクログリアの非活性化または休止表現型の維持7でのmiR-124の役割を報告しているが、ミクログリアの表現型と活性化状態におけるマイクロRNAの他の種類の役割が発見されていない。これは、ミクログリアに特異的miRNA発現を測定するための新しい方法の開発が必要になります。 ミクログリアは、CNSからの分離後、活性化し、大幅に変更になるので、実験で扱うために困難な細胞である。通常のCNS ​​からミクログリアの分離のためのプロトコルは、以前11,12を公開しました。ただし、これらのプロトコルcouldは、RNAの分離に有用である、我々は、これらのプロトコルは、mRNAの発現のためにではなく、microRNA発現の評価に適していると信じています。ま...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> 7.2から7.4：pHは、実験室で乾燥成分から調製することができる</td></tr><tr><td> 10×PBS </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SH30258.02 </td><td> 7.2から7.4：pHは、実験室で乾燥成分から調製することができる</td></tr><tr><td> DMEM、FBS </td><td> GBCO </td><td> 11965; 10438 </td><td></td></tr><tr><td> miRVanaキット</td><td>インビトロジェン</td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td>パーコール</td><td>シグマ</td><td> P4937-500ミリリットル</td><td> 100％のパーコール100 mlの10×PBSの10mlおよびシグマからパーコールの90ミリリットルを混合して調製されています。 70％パーコールの50ミリリットルです。100％のパーコールの35ミリリットルの混合によって調製し、DMEM 15 mlの 40％の50ミリリットルパーコールは、100％のパーコールの20ミリリットルとの1X PBS 30mlを混合することによって調製された</td></tr><tr><td> 35から55のペプチドをモグ</td><td> AnaSpec株式会社</td><td> 60130から5 </td><td></td></tr><tr><td> CFA </td><td> DIFCO </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素</td><td>シグマ</td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FcRは、抗体をブロッキング</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 553142 </td><td>クローン2.4G2 </td></tr><tr><td>抗CD11b - PEモノクローナル抗体</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 553311 </td><td>異なる蛍光色素（例えば、AF488）で使用することができます</td></tr><tr><td>抗CD45-APC-Cy7 mAbを</td><td> Biolegend </td><td> 103116 </td><td>異なる蛍光色素（例えばAPC）で使用することができます</td></tr><tr><td> Paraformaldehyde（16％） </td><td> EMS社</td><td> 15710 </td><td> 1X PBSで1：15に希釈し</td></tr><tr><td> 15パーセントTBE-尿素ゲル</td><td>ライフ·テクノロジーズ·インク</td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td>のTaqMan MicroRNAの逆転写キット</td><td>ライフテクノロジーズ株式会社</td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td>のTaqManユニバーサルPCRマスターミックス</td><td>ライフテクノロジーズ株式会社</td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td>のTaqMan MicroRNAのアッセイMMU-MIR-124A </td><td>ライフテクノロジーズ株式会社</td><td> 4427975 ID 001182 </td><td></td></tr><tr><td>のTaqMan MicroRNAのアッセイsnoRNA-55 </td><td>ライフテクノロジーズ株式会社</td><td> 4427975 ID 001228 </td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>ライフテクノロジーズ株式会社</td><td> AM9937 </td><td>ヌクレアーゼフリー水</td></tr><tr><td> 384ウェルクリア光反応プレート</tD&gt; <td>ライフ·テクノロジーズ·インク</td><td> 4309849 </td><td>別のリアルタイムPCR機器で他のプレート（例えば、96ウェルプレート）で置換することができます</td></tr><tr><td>ダウンスホモジナイザー（15ミリリットル） </td><td>ウィートン科学製品。 </td><td> 358044 </td><td>テフロン/ガラス</td></tr><tr><td> 40μナイロンセルストレーナー</td><td>ファルコン</td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td>大きな遠心</td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td>ローター直径18.5センチメートル</td></tr><tr><td>小型遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5415 R </td><td>ローター直径6.5センチメートル</td></tr><tr><td>リアルタイムPCR装置</td><td>ライフ·テクノロジーズ·インク</td><td> AB 7900 HT </td><td>他の楽器で置換することができる</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td>他の楽器で置換することができる</TD&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BDバイオサイエンス</td><td> FACSAria </td><td>他の楽器で置換することができる</td></tr><tr><td>光度計分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>光度計1000年</td><td></td></tr></tbody></table>

ノーマルcnsのリアルタイムpcrによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロrnaの検出

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

ミクログリアは、中枢神経系（CNS）1に存在する骨髄系の細胞である。これらの細胞は、例えば、多発性硬化症（MS）2などの神経炎症に関連付けられている多くの疾患の病態に重要な役割を果たしている。正常な中枢神経系におけるミクログリアはマクロファージマーカーCD11bを発現し、CD45などといった活性化マーカーの低レベルを発現させることにより、安静時の表現型を示す。 CNSの病理学的イベント中に、ミクログリアは活性としてCD45のアップレギュレーションおよび他のマーカー3で決定となります。 CNSのミクログリアの表現型や機能に影響を与える要因は十分に研究されていません。マイクロRNA（miRNA）は、細胞の増殖と分化4や5のような炎症の病態として、多くの正常な生理学的プロセスに関与している保存された分子（〜22ヌクレオチドの長さ）の成長の家族です。 miRNAが結合相補的な配列によって、特定の標的遺伝子の発現をダウンレギュレートIRは、mRNAとマクロファージ6とミクログリア7を含む先天性免疫細胞の活性化に重要な役割を果たしている。ミクログリアの表現型、生物学的機能を定義し、マクロファージの他のタイプのミクログリアを区別するためのmiRNA-介在経路を調査するためには、定量的にCNS常駐ミクログリアの異なるサブセット内の特定のマイクロRNAの発現を評価することが重要である。 CNSにおけるmiRNAの発現を測定するための一般的な方法は、全体の神経組織からとin situハイブリダイゼーションの定量PCRが含まれています。しかし、全体の組織ホモジネートから定量PCRは、神経組織の細胞の唯一の5から15パーセントを表すミクログリアにおけるmiRNAの発現の評価をすることはできません。 in situでのハイブリダイゼーションは組織切片内の特定の細胞型におけるマイクロRNAの発現を評価できますが、このメソッドは完全に定量的ではありません。本報告では、定量的およびSENSを記述する通常のCNSから、または実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）、MSのマウスモデルを用いて、神経炎症時に単離されたミクログリアにおけるリアルタイムPCRによるmiRNAを検出するためのitive方法。記載された方法は、通常のCNSやMS、脳卒中、外傷、アルツハイマー病や脳の腫瘍を含む種々の病状に関連付けられている神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの発現レベルを測定することが有用であろう。

ミクログリアは中枢神経系の防衛と免疫監視の最初の行を提供するマクロファージを常駐しています。 microRNAはマクロファージの活性化と分化を含む多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす調節分子である。本稿では、ミクログリアにおけるマイクロRNAの測定方法を説明します。

ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出

ミクログリアは、中枢神経系（CNS）に存在する骨髄系細胞である1。これらの細胞は、多くの疾患の病理において重要な役割を果たしており、...

この手順の全体的な目的は、ミクログリアにおけるマイクロRNAの発現を解析することである。まず、脳と脊髄を解剖し、次に中枢神経系（CNS）組織をホモジナイズすることでこれを達成する。第二のステップでは、パーコール勾配を用いてCNSから単核細胞を分離し、その後、FACSによってミクログリア集団を同定する。次に、ミクログリアのRNAを抽出し、サンプルの品質を解析します。最後に、目的の特定のmicroRNAについてリアルタイムPCRを行います。最終的に、デルタデルタCT法を用いることで、ミクログリアにおける特定のmicroRNAの相対的な発現レベルを示すことができます。一般的に、この手法に不慣れな方は、CNSから十分な数の単核細胞を単離できないことや、サンプルに髄鞘や細胞残渣などの混入があることで、困難に直面します。どちらの場合も調製物の品質低下を招き、それぞれRNA低濃度またはタンパク質の混入という結果になります。本手順のデモンストレーションは、私とvirが行います。すべてのマウスの灌流後、脳と脊髄を摘出します。次に、脳1つと脊髄1つを15 milliliterのダウンズホモジナイザーに入れ、その都度5 milliliterのPBSを組織に加えます。10〜20回ゆっくりとストロークした後、ホモジナイザーの中身を70 micronのセルストレーナーを通して個別の50 milliliterコニカルチューブに移し、834 times G、4 °Cで5〜7分間遠心分離します。上清を捨てた後、2〜3匹のマウスから得た脳および脊髄のホモジネートを 5〜7 mL の 70% Percoll に再懸濁します。次に、7 mL の 40% Percoll を重ね、Percollおよび細胞溶液を 20 °C で 850 ×g で 30 分間、ブレーキなしで遠心分離します。70% Percoll の上層にある死細胞、ミエリン、およびデブリを廃棄します。次に、70%と40%のパーコール溶液の界面から単核細胞を回収し、回収した細胞をPBSで少なくとも1:1の割合で希釈します。細胞を遠心分離した後、ペレットを0.5 mLのPBSで再懸濁し、1.7 mLのエッペンドルフチューブに移します。密度勾配分離した細胞50 µLを新しい1.7 mLのエッペンドルフチューブに移し、そこに350 µLのFACSバッファーを加えることから始めてください。次に、5から10 µLのanti FCR抗体をチューブに加え、細胞を氷上で10から15分間インキュベートします。細胞サンプルを2本のエッペンドルフチューブに分注し、一方のチューブに1 µLのanti CD 11 Bおよび2 µLのanti CD 45抗体を加えます。細胞を氷上でさらに10〜15分間インキュベートします。2本目のチューブに「陰性対照」とラベルを貼り、氷上に置きます。染色抗体でのインキュベーション後、両方のチューブに1 mLのfaxバッファーを加え、マイクロ遠心機で1200 ×gで5分間遠心分離して細胞を回収します。G.次に、ペレットをPBSで調製した1%パラホルムアルデヒド 400 µLで固定し、凝集を防ぐためにチューブをボルテックスします。最後に、陰性対照細胞サンプルとBD com beadsを用いて、フローサイトメトリーにより細胞を解析します。まず、EAEを誘導するため、8〜12週齢のC 57 black sixマウス 5〜10匹の群に、complete frons adjuvant（4 mg/mL）で調製したMOG 35-55ペプチド 150 mgを皮下投与します。その後、免疫後0日目と2日目に百日咳毒素を腹腔内投与します。前述の手順で細胞を単離し染色した後、分取の直前に、固定液ではなく400 µLのPBSでペレットを再懸濁します。次に、サンプル回収用に、10% FBSを添加した300 µLのPBSを2本の1.7 mLエッペンドルフチューブに満たします。最後に、この代表的な密度プロットに示すゲーティング戦略を用いて、ミクログリアおよびマクロファージ集団を高純度で分取します。ソーティング後、マイクログリアおよびマクロファージ集団を再解析し、単離した細胞サンプルの純度を決定します。ソートされた細胞集団をマイクロ遠心分離機を用いて1200 ×gで5〜7分間遠心分離した後、上清を慎重に取り除き、細胞ペレットをドライアイスで凍結させます。次に、凍結した細胞ペレットを通常の氷上に移します。解凍のため、Nirvanaキットの溶解バッファーを300 µL加え、ピペッティングを5〜7回行い、細胞溶液を緩やかに混合します。次に、ホモジネート添加剤を30 µL加え、細胞懸濁液を30秒間ボルテックスし、チューブを氷上で10分間静置します。その後、酸性フェノール・クロロホルムを300 µL加え、さらに30秒間チューブをボルテックスします。次に、細胞を9,500 ×gで5分間遠心分離し、水相を含む上清の上層300 µLを新しい1.7 mLエッペンドルフチューブに慎重に移します。この溶液を375 µLの100% ethanolと混合します。チューブの内容量すべてをNirvanaキットのフィルターカートリッジに移し、9,500 ×gで1分間遠心分離します。その後、フロスルーバッファーを廃棄します。カートリッジを洗浄した後、Nirvanaキットの洗浄液1を700 µL加え、9,500 ×gでさらに1分間遠心分離します。洗浄液2を500 µL用いて、同様に2回繰り返します。あらかじめ加熱したヌクレアーゼフリーウォーターを60 µL加え、カートリッジからRNAを溶出させます。最後に、NanoDrop分光光度計を用いてRNAの純度と量を評価した後、リアルタイムQ-R-T-P-C-Rを行い、ミクログリアおよびマクロファージサンプル中のmicroRNAを検出します。蛍光標識されたmere 1 24およびsnow RNA 55のPCR産物のP-R-T-P-C-R曲線は、最初のグラフに示すように作成できます。ミクログリアまたは骨髄由来マクロファージから単離したコントロールのsnow RNA 55 RNAサンプルにおける、PCRサイクル数に対する蛍光標識特異的PCR産物量の代表的な曲線を示します。異なる細胞集団からのsnow RNA 55発現の解析におけるCT値が、グラフ上の緑色と青色の垂直線で示されているように、ベースラインとQ-R-T-P-C-R曲線の線形範囲の下部との交点で決定されていることに注目してください。この2番目のグラフでは、ミクログリアまたは骨髄由来マクロファージからの実験的なmere 1 24 RNAサンプルに対する蛍光標識特異的PCR産物の量と、PCRサイクル数との関係が示されています。異なる細胞集団からのmere 1 24発現の解析におけるCT値が、ここでも同様に、グラフ上の緑色と青色の垂直線で示されているように、ベースラインとQ-R-T-P-C-R曲線の線形範囲の下部との交点で決定されていることに注目してください。この表に示されている正常マウスおよびEAEマウスのミクログリアおよびBMdmにおけるsnoRNA 55とmiR-124の発現のように、各サンプルのCT値を決定した後、各サンプルの各デュープリケートのΔCT値を算出するため、実験群のmiR-124サンプルのCT値から対照群のsnoRNA 55サンプルのCT値を引きます。次に、他のサンプルのΔCT値から参照サンプルのΔCT値を引き、ΔΔCT値を算出します。最後に、この密度プロットに示されているように、各サンプルの相対的な発現レベルを2のマイナスΔΔCT乗として算出します。正常な中枢神経系（CNS）からミクログリアが適切に単離できた場合、細胞の95～98%がCD 11 B陽性かつCD 45 lowのミクログリアであり、細胞懸濁液の2～5%がCD 11 B陽性かつCD 45 highの血管周囲マクロファージで構成されます。一方で、CD 11 B陰性かつCD 45 highのリンパ球、あるいはCD 11 B陰性かつCD 45陰性のアストログリア、オリゴデンドログリア細胞、または細胞断片は1%未満となります。対照的に、不適切な調製では、アストログリアやミエリン粒子などのCD 11 B陰性かつCD 45陰性の細胞または細胞断片が著しく混入し、RNA単離やその後の解析に適さない状態となります。さらに、灌流不十分による血液リンパ球の混入を示すCD 11 B陰性かつCD 45 highの細胞が存在する場合もあります。この密度プロットでは、神経炎症時にCNSに存在する3つの細胞集団、すなわちCD 11 B陽性かつCD 45 lowのミクログリア、CD 11 B陽性かつCD 45 highのマクロファージ、およびCD 11 B陰性かつCD 45 highのリンパ球が示されています。適切な抽出後と不適切な抽出後のゲル電気泳動によって決定されたRNAの品質を示します。RNAが清潔に抽出された場合、RNAラダーとリボソームRNAが明確に認められますが、抽出プロセスが不適切に行われた場合は、スメアリングや低分子量の分解産物が認められます。これらの最終データは、正常な成人のミクログリア、EAEを発症したマウスのミクログリア、および発生の初期段階のマウスから単離されたミクログリアにおけるmere 1 24の発現を実証しています。この最初の棒グラフでは、正常なCNS由来のミクログリアにおけるmere 1 24の相対的発現量は、骨髄由来マクロファージで観察されたものよりも格段に高くなっています。同様に、EAEマウスのCNS由来マクロファージにおいてもmere 1 24 RNAの増加が見られますが、ミクログリアでは依然として5倍の量のmere 1 24 RNAが発現しています。この最後の棒グラフは、本手法を用いて、成体（8週齢）マウスと比較した、1週、2週、および4週齢のマウスの発生過程におけるミクログリアのmere 1 24発現レベルの変化をどのように評価できるかを示しています。実験全体で良好な結果を得るためには、十分な量と高品質の単離細胞を確保することが重要であるということを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ミクログリア生物学の成功の調査の一つの鍵は、CNS組織からの単離の間にex vivoでミクログリア免疫機能の維持である。蛍光イメージング、免疫細胞、および炎症誘発性刺激リポ多糖（LPS）とパム3 CSK 4（PAM）を用いたELISA次のミクログリアの活性化によって評価されるように、高純度と免疫機能細胞培養で回転振盪結果を経由してミクログリアを分離する。...

マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

私たちは、脳脊髄液（CSF）中のマイクロRNAをプロファイリングするリアルタイムPCRのプロトコルを記述します。 RNA抽出プロトコールを除いて、手順は他の体液、培養細胞、または組織試料から抽出したRNAに拡張することができる。...

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

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共焦点検眼鏡イメージングとマウス緑内障における細胞の形態計測：神経変性中に網膜ミクログリアの活性化のインビボダイナミクス

Microglia(脳の免疫細胞)は、ナノ粒子が神経毒性にどのように影響するかを決定するための代理バイオセンサーとして使用されます。ナノ粒子に対するミクログリアの応答と、活性化されたミクログリアからの上清への視床下部ニューロンの曝露をアッセイして神経毒性を決定するために設計された一連の実験について説明します。...

ナノ粒子神経毒性を決定するために、代理バイオセンサーとしてミクログリア

ここでは、in vitroの実験のために出生後の仔マウス（1日目）からミクログリアを分離するためのプロトコルを提示します。分離のこの即興方法は、高収率および高純度、ミクログリア生物学を解明する目的で、広範囲の実験を可能にする別の方法を超える有意な利点の両方を生成します。...

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。...

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

初代ミクログリア培養は、新しい抗炎症分子を評価するために一般的に使用されます。本プロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離するための再現可能で関連性のある方法を記載しています。...

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

本稿では、精密制御手術と二光子顕微鏡を用いて、マウス海馬CA1の静止ミクログリアをin vivo...

インビボ マウス海馬におけるミクログリアの慢性二光子イメージング

私たちは、磁気活性化セルソーティング(MACS)を使用して、マウスの視床下部(または同等の小さな脳構造)からミクログリア細胞を比較的短時間で単離するためのプロトコルについて説明します。MACSで選別された視床下部ミクログリアは、 ex vivo 分析に使用でき、 in vitro...

磁気活性化細胞選別による灌流したばかりの成体マウス脳からの視床下部ミクログリアの単離  

本論文は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて網膜におけるミクリアの運動性とシナプス後点との接触を可視化・定量化する方法を示します。...

病変マウス網膜におけるミクログリアの動態およびシナプスとの相互作用のライブイメージングおよび特徴付け

マッピングミログリアパラメータソフトウェア(MMPS)は、コーディングの専門知識を必要とせず、免疫蛍光画像から単細胞微粒細胞形態学解析を半自動化するユーザーフレンドリーな解析パイプラインです。齧歯類リポ多糖誘発神経炎症モデルで検証され、MMPSは活性化に関連する形態変化を再現性可能に検出し、標準化され拡張可能なミクログリア表現型化を可能にします。...

マッピングミクグリアパラメータソフトウェア(MMPS):定量的なミクログリア形態分析のためのオープンソースで使いやすいツール

学ぶリアルタイムPCRによるミクログリア内マイクロRNA検出法。Percoll密度勾配遠心とフローサイトメトリーで細胞を分離し、神経炎症時の免疫応答メカニズム解明に貢献します。

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