ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出

この手順の全体的な目標は、ミクログリアにおけるマイクロRNAの発現を解析することです。これは、最初に脳と脊髄を解剖し、次に中枢神経系またはCNS組織を均質化することによって達成されます。第2のステップでは、CNSからの単核細胞をコールごとの勾配で単離し、次にミクログリア集団を事実によって同定します。

次に、ミクログリアRNAを単離し、サンプルの品質を分析します。最後に、目的の特定のマイクロRNAのリアルタイムPCRが実行されます。最終的には、デルタデルタCT法を使用して、ミクログリアにおける特定のマイクロRNAの相対発現レベルを示すことができます。

一般に、この方法に不慣れな人は、CNSから十分な数の単核細胞を分離できなかったり、サンプルが汚染されたり、ミエリンや細胞の破片が付着していたりするため、苦労します。どちらの場合も、調製の品質は低くなりますが、それぞれ低濃度のRNAまたはタンパク質による汚染のいずれかになります。手順を実演するのは私とvirです。

Dr.Oフェローからすべてのマウスの灌流後、脳と脊髄を解剖します。次に、一度に1つの脳と1つの脊髄を15ミリリットルのダウンホモジナイザーに入れ、毎回5ミリリットルのPBSを組織に加えます。10〜20回の穏やかな打撃を行った後、均質なものを70ミクロンのセルストレーナーを介して個々の50ミリリットルの円錐形チューブに通し、チューブをGの834倍と摂氏4度で5〜7分間遠心分離します。

上清を廃棄した後、Resusは、コールあたり70%の5〜7ミリリットルで2〜3匹のマウスから脳と脊髄を均質に懸濁します。次に、コールあたり40%の7ミリリットルを重ね、コールあたりとセル溶液をG摂氏20度の850倍で30分間休憩なしで回転させます。損傷したセルとマイル、および破片を70%per callの上部で破棄します。

次に、コール溶液あたり70%と40%の間の界面で単核細胞を回収し、回収した細胞をPBSで少なくとも1対1の比率で希釈します。細胞をスピンダウンした後、ペレットを半ミリリットルのPBSに蘇生し、1.7ミリリットルのアイノアチューブに移します。まず、密度勾配で選別した細胞の50マイクロリットルを新しい1.7ミリリットルのeinorチューブに移し、チューブに350マイクロリットルのファックスバッファを追加します。

次に、5〜10マイクロリットルの抗FCR抗体をチューブに加えた後、細胞を氷上で10〜15分間インキュベートします。細胞サンプルを2本のアイノアチューブから1本のチューブに分割します。1マイクロリットルの抗CD11Bと2マイクロリットルの抗CD45抗体を追加します。

細胞を氷上でさらに10〜15分間インキュベートします。2 本目のチューブのネガティブコントロールにラベルを付け、氷の上に置きます。染色抗体とインキュベートした後、両方のチューブに1ミリリットルのファックスバッファーを加え、マイクロ遠心分離機で細胞を5分間、1200回スピンダウンします。

G.次に、ペレットをPBS中の1%パラホルムアルデヒドの400マイクロリットルに固定し、チューブをボルテックスして凝集を防ぎます。最後に、ネガティブコントロール細胞サンプルとBDコードを用いてフローサイトメトリーにより細胞を解析し、まず、5〜10週齢のC57ブラック6マウスのグループを150ミリグラムのMOG 35〜55ペプチドで150ミリグラムのMOG 35〜55ペプチドでEAEを誘導する。次に、百日咳毒素を0日目と予防接種後2日目に腹腔内投与します。

示したように細胞を単離して染色した後、選別直前にペレットを固定剤の代わりに400マイクロリットルのPBSに懸濁します。次に、2本の1.7ミリリットルのeinorチューブに300マイクロリットルのPBSを充填し、サンプルを収集するために10%FBSを補充します。最後に、この代表的な密度プロットに示されているゲーティング戦略を使用して、ミクログリアとマクロファージの集団を高純度に選別します。

ソーティング後、ミクログリアとマクロファージの集団を再分析して、単離された細胞サンプルの純度を決定します。選別した細胞集団をGの1200倍で微量遠心分離機で5〜7分間スピンダウンした後、上清を慎重に取り除き、細胞ペレットをドライアイスで凍結します。次に、凍結した細胞ペレットを通常の氷に移します。

解凍には、Nirvanaキットから300マイクロリットルの溶解バッファーを加え、5〜7回ピペッティングして細胞溶液を穏やかに混合します。次に、30マイクロリットルのホモジネート添加剤を加え、細胞懸濁液を30秒間ボルテックスし、次にチューブを氷上に10分間置きます。次に、300マイクロリットルの酸性フェノール、クロロホルムを追加し、チューブをさらに30秒間ボルテックスします。

次いで、細胞を9,500倍Gで5分間スピンダウンした後、水相を含む上清の上部300マイクロリットルを新しい1.7ミリリットルのeinorチューブに慎重に移す。溶液を375マイクロリットルの100%エタノールと混合します。ニルヴァーナキットからフィルターカートリッジにチューブの内容物全体を移し、カートリッジを9、500回G.Nextで1分間回転させ、バッファーを通じて流れを捨てます。

ニルヴァーナキットから700マイクロリットルの洗浄液を加え、カートリッジを洗浄した後、Gの9,500倍でさらに1分間回転させます。500マイクロリットルの洗浄液でさらに2回。ニルヴァーナキットEluteからの2つ、カートリッジからのRNAと60マイクロリットルの予熱されたヌクレアーゼフリー水。

最後に、NanoDrop分光光度計を使用して、ミクログリアおよびマクロファージサンプル中のマイクロRNAを検出するためにリアルタイムQ-R-T-P-C-Rを実行した後、RNAの純度と量を評価します。蛍光標識された MERE 1 24 および snow RNA 55 PCR 産物の P-R-T-P-C-R 曲線は、最初のグラフに示すように作成できます。ミクログリアまたは骨髄由来マクロファージから単離されたコントロールスノーRNA 55 RNAサンプルの蛍光標識特異的PCR産物の量の典型的な曲線を、PCRサイクル数と比較した

異なる細胞集団からのSnow RNA 55発現の解析のためのCT値が、グラフで緑と青の垂直線で示されているように、Q-R-T-P-C-R曲線の線形範囲の下部とベースラインとの交点でどのように決定されるかに注目してください。この2番目のグラフでは、ミクログリアまたは骨髄由来マクロファージからの実験用わずか1 24 RNAサンプルの蛍光標識特異的PCR産物の量を、PCRサイクル数と比較して示しています。異なる細胞集団からのわずか1 24の発現の解析のためのCT値が、グラフで緑と青の垂直線で示されているように、Q-R-T-P-C-R曲線の線形範囲の下部とベースラインとの交点で再び決定される方法に注目してください。

各試料のCT値を求めた後、本表に示す正常マウス及びEAEマウスからのミクログリア及びBM dmsにおけるユキRNA55及びメア124の発現について、対照のユキRNA55のCT値を減算し、実験用メア124サンプルのCT値からサンプルを差し引いて、各試料の重複毎のデルタCT値を算出する。次に、他のサンプルのデルタCT値から参照サンプルのデルタCTを減算して、デルタデルタCT値を計算します。最後に、各サンプルの発現の相対レベルは、この密度プロットに見られるように、マイナスデルタデルタCTの累乗の2として計算されます。

正常なCNSからのミクログリアの良好な単離の場合、細胞の95〜98%はCD11B陽性CD45低ミクログリアを表し、細胞懸濁液の2〜5%はCD11B陽性CD45高血管周囲マクロファージで構成され、CD11B陰性CD45高リンパ球またはCD11B陰性CD45陰性星脳膠細胞またはオリゴDROグリア細胞の1%未満または、細胞断片が悪い製剤に比較的存在します。CD 11 B、陰性CD45陰性細胞、またはアストログリアやミエリン粒子などの細胞断片には著しい汚染があり、細胞はRNA単離およびさらなる分析に適していません。さらに、CD11B陰性CD45高細胞もまた存在し得、これは不十分な灌流による血液リンパ球による汚染を示すものであり、この密度プロットでは、神経炎症中にCNSに存在する細胞の3つの集団、CD11B陽性CD45、低ミクログリアCD11B陽性CD45高マクロファージ、およびCD11B陰性CD45高リンパ球が示されている。

ゲル電気泳動によって決定されるRNAの品質は、良好な単離と不良の単離後に示されています。RNAをクリーンな方法で単離すると、RNAラダーとリボソームRNAが明らかになります 分離プロセスが不十分に行われたときに塗抹標本が不十分で、低分子量分解生成物が明らかになります。これらの最終データは、EAEおよび発生初期にマウスから単離されたミクログリアを持つマウスの正常な成体ミクログリアミクログリアにおけるわずか1.24の発現を示しています。

この最初の棒グラフでは、骨髄由来マクロファージで観察されたものと比較して、正常なCNSからのミクログリアでのわずか1 24の相対発現がはるかに大きい。同様に、EAEミクログリアを持つマウスのCNS由来のマクロファージでは、わずか1 24 RNAが増加していますが、それでもわずか1 24 RNAの5倍を発現しています。この最終的な棒グラフは、1週齢、2週齢、および4週齢のマウスの発達中のミクログリアにおけるわずか1〜24の発現レベルの変化が、成体の8週齢マウスと比較して、この方法を用いてどのように評価できるかを示しています。

十分な量と良質の単離細胞を持つことを覚えておくことが重要です。