マイクロ流体デバイスの低コスト作製のためのPDMSの非プラズマボンディング
2007年11月1日
このビデオでは、プラズマの結合なしニューロンマイクロ流体デバイスを使用する方法を示します。
フォトリソグラフィーやソフトリソグラフィーを日常的に行う研究室には、通常「プラズマクリーナー」と呼ばれる装置が備わっています。プラズマクリーナーには電気コイルが搭載されており、これにより電子、イオン、中性原子、および分子からなる部分的にイオン化されたガスが生成されます。プラズマはガラスとデバイスの表面に反応性種を生成し、それらを接合させることで恒久的な結合が形成されます。
また、プラズマ処理によってデバイスの表面が親水性になり、液体の添加が容易になります。しかし、場合によっては、不可逆的な永久結合が好ましくないこともあります。さらに、多くの研究室ではプラズマクリーナーを利用することができません。
この懸念を解消するため、本日はニューロンデバイスとカバーガラスの可逆的な非プラズマ接合について実演します。PDMSとガラスの間に生じる静電引力によって、細胞培養に適した水密性の高い接合が形成されます。それでは、本日の実演を担当するKiana Leeを紹介します。
Corning社製のNo.1 24 mm × 40 mm カバーガラスを、超音波洗浄機を用いて洗浄します。カバーガラスをステンレス製のラックにセットし、脱イオン水を満たしたガラス容器に入れます。その後、このガラス容器を超音波洗浄機内に設置します。
その後、ガラススライドを30分間超音波洗浄します。超音波洗浄後、ガラス容器から脱イオン水を捨てます。ガラススライドが入ったガラス容器に70% ethanolを注ぎ、無菌状態を維持するために標準的なバイオセーフティキャビネット内に入れます。
70% ethanolで洗浄した後、ステンレス製ラックをガラス容器から取り出し、ガラススライドを数時間または一晩放置して完全に乾燥させます。次に、安全キャビネット内で、PLL溶液を満たした容器にガラススライドを浸し、PLLコーティングを行います。ガラススライドをPLL溶液に最低3時間、または一晩浸漬させます。
PLLコーティング後、ディッシュからPLL溶液を取り除き、ガラススライドを脱イオン水で十分にすすぎます。PLLコーティングしたガラスを数回水ですすいだ後、ディッシュに水を満たし、ガラススライドを数時間水に浸しておきます。脱イオン水に数時間浸した後、ディッシュから水を吸引して取り除きます。
ガラススライドを素早く洗浄した後、ディッシュから取り出してステンレス製のラックに配置し、一晩乾燥させます。バイオセーフティキャビネット内で、Neuronデバイスをキャビネット内に持ち込み、70% ethanolで十分に洗浄して滅菌します。その後、デバイス上の余分なethanolを吸引して除去します。そして、デバイスをバイオセーフティキャビネット内で一晩乾燥させ、翌日に使用します。
この滅菌済みニューロンデバイスを、洗浄・滅菌しPLL処理を施したガラスの上にそのまま配置します。PDMSがガラスとの間で可逆的な結合を形成し、液漏れのない密閉状態になります。緩やかな圧力でデバイスをガラスに接着させるか、あるいは直ちにデバイスに培地を添加します。
組み立て後、デバイスに培地または細胞を添加するまで時間を空けすぎると、液体がデバイス内に導入しにくくなる可能性があります。プラズマ処理されていないデバイスでは、プラズマ処理されたデバイスに比べて液体の導入速度が遅いことに注意してください。プラズマ処理直後のデバイスは親水性であるため、液体が容易に流入しますが、プラズマ接合されていないデバイスでの流れは大幅に遅くなります。
場合によっては、ピペットを使用して液体をデバイス内に強制的に注入する必要があるかもしれません。このビデオでは、ニューロンデバイスをカバーガラスに非プラズマ接合させる方法を示しました。これは、PDMSをガラス表面に可逆的に結合させるための効率的で安価な手法です。
このビデオが有益で役立つものであったことを願っております。John Labからは以上です。ご視聴ありがとうございました。
概要
このビデオでは、プラズマボンディングを必要とせずにニューロン用マイクロ流体デバイスを使用する方法を実演します。この手法により、デバイスとガラスの間で可逆的な接合が可能となり、細胞培養に適した環境が提供されます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- マイクロフルイディクス
- 細胞培養技術
背景
- 材料間の恒久的な接合を形成するために、研究室では一般的にプラズマボンディングが用いられています。
- 多くの研究室ではプラズマクリーナーを利用できないため、代替法の検討が必要となります。
- 可逆的なボンディング技術を用いることで、デバイスの操作が容易になります。
- このニューロン用マイクロ流体デバイスは、細胞培養アプリケーション向けに設計されています。
研究の目的
- プラズマ処理を行わずに、ニューロンデバイスをガラスに可逆的に接着する方法を実演すること。
- プラズマ接着装置を保有していない研究室向けに、費用対効果の高いソリューションを提供すること。
- 接着部が水密であり、細胞培養に適していることを確認すること。
使用した手法
- ウォーターバスソニックレーターを用いたガラススライドの洗浄。
- 接着性を高めるためのポリ-L-リシン（PLL）によるガラススライドのコーティング。
- 静電力を利用したPDMSとガラス間の可逆的な結合の形成。
- 無菌状態を維持するためのバイオセーフティキャビネット内での組み立てプロセスの実演。
主な結果
- 非プラズマボンディングニューロンデバイスは、ガラスとの間で水密シールを形成します。
- プラズマ処理されたデバイスと比較して、デバイスへの液体の浸入速度は遅くなります。
- 最適な結果を得るために、組み立て直後に細胞または培地を添加することが可能です。
- この手法は効率的であり、高価な装置を必要としません。
結論
- 実演した手法は、プラズマボンディングに代わる有効な代替手段となります。
- ほとんどの研究室で利用可能な簡易的な技術を用いて、可逆的なボンディングを実現できます。
- このアプローチは、細胞培養におけるマイクロ流体デバイスを扱う研究者にとって有益です。
よくある質問
産業界における重要性
本手法は、神経科学研究におけるマイクロ流体デバイス向けに、コスト効率が高く可逆的な接合アプローチを提供し、プラズマ洗浄装置に依存することなく細胞培養への応用を可能にします。本手法は、神経細胞培養に適した水密シールを提供することで、初期段階のターゲットバリデーションおよびアッセイ開発を支援し、同時にリソースの限られた研究室におけるアクセス上の障壁を解消します。また、培養後にデバイスを取り外して免疫染色や顕微鏡観察などのダウンストリーム解析が行えるため、トランスレーショナルな継続性を向上させます。
バイオ医薬品の研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： デバイスを恒久的に固定することなく、マイクロ流体環境におけるニューロンの成長および経路ダイナミクスの解析を可能にする。
- 運用上の価値： 可逆的な接合をサポートし、ターゲットバリデーションのワークフローにおいて、反復的な実験およびデバイスの再利用を実現する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：化合物曝露および神経細胞アッセイにおける生細胞イメージングに適した、液密性のマイクロ流体環境を提供します。
- 運用の価値：コーティングされたガラス基板へのデバイスの可逆的な取り付けにより、アッセイの標準化を促進します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：疾患に関連する神経細胞培養条件を維持しつつ、バイオマーカー分析や免疫染色のためのアッセイ後のデバイス回収を可能にする。
- 実用的価値：エタノールによる洗浄とバイオセーフティキャビネット内での操作により無菌性を確保し、再現性のある前臨床ワークフローをサポートする。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ニューロン培養用のマイクロ流体デバイスの無菌的かつ可逆的なアセンブリを可能にすることで、標的バリデーションから機能的スクリーニングへの移行を支援し、初期の創薬ワークフローに組み込むことができます。
- 探索生物学： 限定された微小環境における軸索誘導およびシナプス接続の仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： キャピラリー内での流速は緩やかですが、ニューロンを用いたアッセイにおいて、再現性のある化合物投与および培地交換を可能にします。
- 分析： 制御された流体条件下におけるニューロンの成長および試薬への反応に関する定量的なリードアウトを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： デバイスの除去による免疫染色やイメージングを通じて、探索段階のニューロン培養から下流のバリデーションへと繋げます。
- 企業での再利用： PDMSとガラス界面を用いた、複数のマイクロ流体デバイス設計に適用可能な可逆的接合プロトコルを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：プラズマによる表面変化を伴わずに制御された流体環境を提供することで、神経細胞培養におけるメカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：プラズマクリーナーへの依存を排除し、設備コストを削減して、さまざまな研究拠点でのアクセシビリティを向上させます。
- 戦略的価値：デバイスの可逆的な使用を可能にし、マイクロ流路ワークフローにおける消耗品廃棄物を削減することで、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：ターゲットバリデーションにおけるゴー/ノーゴー判定のための再現性のある神経細胞培養データを生成し、リスク調整後の進展をサポートします。
実施上の注意点
- 滅菌および取り扱いのために、無菌操作技術とバイオセーフティキャビネットの使用が必要です。
- 可逆的な接合効率を確保するために、ガラススライドの適切な超音波処理およびPLLコーティングに依存します。
- プラズマを用いない接合では滅菌されないため、エタノール洗浄によるPDMSデバイスの事前滅菌が必要です。
- 疎水性表面のため液体の浸入が遅くなることを考慮する必要があり、ピペットを用いた培地の導入が必要になる場合があります。
- 水密性はあるが可逆的なシールで十分なアプリケーションに限定され、高圧環境や長期的な不透過性接合が必要な用途には適していません。
