ソート幹細胞アッセイおよびフローの原発性脳腫瘍組織の処理

この手順の全体的な目標は、脳腫瘍開始細胞を in vitro で研究することです。これは、最初に原発ヒト腫瘍を機械的および酵素的に解離し、次に幹細胞血清を含まない培養条件で培養することによって達成されます。次の球体の形成は、3〜5日間にわたって監視されます。

次に、腫瘍球体を再び酵素的に消化し、その表面マーカーをフローサイトメトリーによって評価します。最後のステップは、さらなる特性評価のために、目的の細胞を96ウェルプレートまたはPLグリッドスライドに選別することです。最終的に、選別された集団の自己複製能力と異なる遺伝子発現は、希釈分析と単一細胞R-T-P-C-Rを制限することによって評価できます。

バルク腫瘍分析などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、脳腫瘍開始細胞またはがん幹細胞集団を前向きに分離できることです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、もともと正常な神経幹細胞に使用されていた培養条件をさまざまなヒト脳腫瘍に適用したときであり、その手順を実証する幹細胞様集団に特別に選択されたこの培養方法が、ポスドク研究員のCHITRA AL大学院生であるブラン・ヴァン・マネンとサラ・ノルテであることがわかりました。 フローサイトメトリー技術者のニコール・マクファーランドは、すべて私たちの研究室のものです。まず、200 マイクロリットルの解凍リアーゼを 15 ミリリットルの人工脳脊髄液または CSF に加え、チューブを摂氏 37 度のウォーターバスに入れます。このときも塩化アンモニウム溶液を室温に戻します。

次に、脳腫瘍組織の検体容器に 5 ミリリットルの CSF を回してすすぎ、液体からパイプで排出して赤血球を除去します。次に、組織を滅菌された100ミリメートルのペトリ皿に移し、細いはさみと鉗子を使用して組織をスラリーの粘稠度に分解します。次に、10ミリリットルの通常のピペットと鉗子を使用してサンプルを収集し、組織片を予熱したA CSFを含むチューブに移します。

リアスを使用して、チューブを30 RPMおよび摂氏37度のインキュベーターシェーカーに置きます。そして15分後、組織ライセートを7Dマイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルの円錐形チューブにろ過します。濾液を室温で280GSで5分間回転させます。

次に、スナットを慎重に取り除き、得られたペレットのサイズと色を評価します。次に、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁し、ペレットサイズと赤血球汚染に基づいて適量の塩化アンモニウム溶液を加えます。次に、室温で5分間インキュベートした後、PBSで2回目の洗浄後に細胞をスピンダウンし、ペレットを5ミリリットルの神経幹細胞完全培地に再懸濁し、細胞懸濁液を超低結合60ミリメートル組織培養プレートに移します最初の数日間。

必要に応じて1〜2ミリリットルの培地で培養物をトッピングし、色がわずかに黄色になったときにのみ培地を変更します。まず、腫瘍球状培養物を15ミリリットルの円錐形チューブに移します。2〜3ミリリットルの滅菌PBSを加えてプレートを完全にすすぎ、次に洗浄液を腫瘍スフェチューブに加えます。

細胞をスピンダウンした後、スナットを取り除き、ペレットを1〜2ミリリットルの滅菌PBSに再懸濁し、次に10マイクロリットルのリアーゼを加えます。この技術の課題の 1 つは、処理中に固形腫瘍幹細胞の生存率を維持することです。培養およびセーゼーション中の細胞の操作には、優しいタッチが必要です。

次に、チューブを摂氏37度の水浴でインキュベートします。3分後、懸濁液を取り外して目視で評価します。複数の塊が見られる場合は、1000マイクロリットルのピペットチップを使用して、細胞クラスターを穏やかに反復します。

次に、細胞を5ミリリットルの滅菌PBSで洗浄し、S上清を除去した後、ペレットを500〜1000マイクロリットルの滅菌PBSと2ミリモルEDTAに再懸濁します。最後に、トライアンブルーを使用して細胞数と生存率を評価した後、PBSとEDTAで細胞数を1ミリリットルあたり100万細胞に調整します。まず、テストごとに100マイクロリットルの細胞懸濁液を個々の12 x 75ミリメートルのフローチューブに移します。

適切な抗体を加えた後、サンプルを氷上で30分間インキュベートし、チューブあたり2ミリリットルのPBSとEDTAで結合していない抗体を洗い流します。次に、洗浄液をデカントし、チューブを吸い取り、細胞ペレットをさらに300マイクロリットルのPBSとEDTAに再懸濁します。次に、7つのA/D生存率色素を10マイクロリットル各チューブに加えます。

チューブを氷上で少なくとも15分間インキュベートした後、細胞はフローサイトメトリー分析の準備が整います。ネガティブコントロールサンプルを使用して前方散乱と横方散乱パラメータを調整した後、この代表的なトッププロットに示されているものと同様の領域を目的のセルの周囲に描画します。必要に応じて、最初の20年以内に陰性セルを配置するために使用する蛍光検出器の電圧を調整します。

次に、生存率色素7 A a dを使用して、この代表的なトッププロットに示されている領域に示されている領域と同様の死細胞を除外するための2番目の領域を作成します。次に、散乱と生細胞ゲートの両方をすべての蛍光プロットに適用し、単一の染色コントロールを使用してスペクトルの重複を差し引きます。最後に、サンプルを実行します。

解離した細胞をウェルあたりの単一細胞にさまざまな希釈で選別し、通常7日間にわたって形成されるNSC培地ニューロスフィアを含む96ウェルプレートの個々のウェルに、通常7日間にわたって形成され、培養中の過去7日間のその後の球形成の速度は、単一細胞R-T-P-C-Rについて計算できます。目的の集団から十分なグリッドスライドの反応部位に単一細胞を選別した後、各反応部位の中心に1マイクロリットルのマスターミックスを加え、すぐに各部位を5マイクロリットルの天井溶液でコーティングします。次に、十分な速度のスライドサイクラーを使用して、スライドを3つの温度サイクルでインキュベートします。

逆転写後、各反応部位に3マイクロリットルのDN aのrase遊離水を加えます。次に、混合物全体を各反応部位から個々のPCRチューブに移します。最後に、リアルタイム定量のために、BioRadサイクラーでサンプルを実行します。

この最初の図は、神経膠芽腫の代表的な患者の磁気共鳴画像スキャンを示しています。解離した腫瘍細胞は、神経表面幹細胞マーカーであるCD 1 33およびCD 15で標識し、この代表的なドットプロットに示すようにフローサイトメトリーによって分析することができます。ここでは、代表的な単一細胞R-T-P-C-R反応の増幅プロットを示します。

このようなプロットから得られたCT値を使用して、目的の遺伝子の相対的な発現レベルを計算できます。このビデオを見た後、原発性脳腫瘍組織を酵素的に解離して培養し、幹細胞集団を濃縮する方法をよく理解できるはずです。また、限定希釈分析または単一細胞R-T-P-C-Rを実行することにより、選別された幹細胞集団の自己複製能力と異なる遺伝子発現を研究する方法もわかります。