細胞侵襲DISC1タンパク質種の生成、精製とキャラクタリゼーション

次の手順の全体的な目的は、精製されたディスクを生成することです。1つはレシピエント細胞に侵入できる凝集体です。この目標を達成するための 2 つの異なる方法を、最初の方法で示します。

アソーム形成蛍光タンパク質ディスク1融合タンパク質は、NLFヒト神経芽腫ドナー細胞で過剰発現しています。次に、細胞を回収したPBSで洗浄し、洗剤を使用せずに横たわらせます。DNAは消化され、アグロゾーンはショ糖勾配システムを使用して精製されます。

この方法で精製されたアグリオスは、細胞浸潤効率が低くなります。別のアプローチは、大腸菌の組換えディスク1タンパク質のアミノ酸5 98〜7 85を過剰発現させることです。次に、タンパク質フラグメントをDITE 5 94で標識し、透析し、NI NTAマトリックスを使用して精製し、残りの未結合色素マルチメリックディスクを除去します。

この方法で作製したフラグメントの1つは、宿主細胞の浸潤を評価するための高い細胞浸潤効率を示します。精製された蛍光タンパク質ディスク、1つのリソーム、または標識された組換えディスクのいずれか。1つのフラグメントを目的のレシピエント細胞とインキュベートします。

次に、細胞外蛍光を消光するためにトライアンブルーを添加し、共焦点顕微鏡で浸潤を可視化します。これまで、タンパク質凝集は統合失調症のような慢性精神疾患の認識された特徴ではありませんでした。統合失調症で破壊された場合、1つのタンパク質が候補細胞であるタンパク質凝集体の浸潤性は、タンパク質確認疾患の顕著な特徴です。

ここでは、ディスク1タンパク質凝集体が細胞侵襲性であり、したがってディスク1関連障害またはディスク1神経障害がタンパク質確認障害であることを2つの方法で示します。2つの方法は、第一に、神経芽腫細胞株からの全長椎間板の精製、1つはASOS、第二に、C末端多量体ディスクの発現です。大腸菌の1つのフラグメント、および蛍光色素による精製および標識。

最初の方法では、精製されたミクロソームを取り込む細胞のOH0.3%の低効率の細胞浸潤をもたらすだけですが、PUR組換えタンパク質フラグメントは、曝露された細胞の最大20%に感染します。ここで説明する方法は、アクロソーム形成または多量体集合が説得力を持って実証されている他のタンパク質に転移可能であるべきです。10センチの皿10のそれぞれに。

補充したRPMI 1640培地で6つのヒト神経芽腫およびLF細胞に1.5倍10の播種を行い、一晩で増殖させます。翌日の細胞は、PC DNA 3.1 MRFPおよびEGFPプラスミドのみによるトランスフェクションのためにEGFPタグ付きヒト全長ディスク1および5をトランスフェクションするための5皿を70〜80%コンフルエントラベルする必要があります。10センチメートルの皿ごとに、15マイクログラムのプラスミドDNAを30マイクロリットルの影響を与えるものと750マイクロリットルを組み合わせます。

Opti MEMをマイクロ遠心チューブに入れ、ピペッティングで上下させて、室温で20分間インキュベートします。次に、細胞をトランスフェクションするために、DNAトランスフェクション試薬溶液を細胞に滴下し、トランスフェクションの48時間後に5%CO2で摂氏37度で細胞をインキュベートし、MRFP全長ディスク1の発現を監視し、蛍光顕微鏡下でアグロゾーンの形成を確認しました。一部の細胞は、ここに示すように大量の蛍光タンパク質封入体を保持しています。

このプロトコルは、脳組織からレビー小体を精製する方法と、より大きな凝集体またはアグロゾーンを分離するプロトコルを組み合わせたものです。既存の方法は界面活性剤の使用に基づいているため、細胞侵襲性アッセイへの適用のための界面活性剤を含まないタンパク質の単離が重要です。次に、PBSで培地洗浄液を吸引し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む400マイクロリットルのPBSを追加します。次に、細胞をこすり落とし、1ミリリットルの細胞懸濁液と10個のセラミックビーズを2ミリリットルの溶解チューブに加えます。

プレセル lyse 24 ホモジナイザーで 3 つの 62nd パルスを使用して細胞を溶解します。このプロセスの機械的な力により、サンプル内の温度が摂氏37度以上に上昇する可能性があります。したがって、サンプルを氷上で冷却するように注意する必要があります溶解手順の後、氷上で細胞を冷却した後、10ミリモル塩化マグネシウム40単位/ミリリットルDNAを加え、振とうしながら摂氏37度で60分間インキュベートします。

PBSで容量あたり80%50%と20%のスクロース重量をそれぞれ10ミリリットル調製します。次に、15ミリリットルの円錐管で、2ミリリットルの80%スクロースから始めて、2ミリリットルの50%と20%のスクロース2ミリリットルからスクロース勾配を準備します。グラデーションをゆっくりと注ぎ、すでに注がれたレイヤーを邪魔しないように注意してください。

次に、消化したライセートをグラジエントの上に重ね、摂氏4度でGの1000倍で15分間遠心分離します。ブレークオフで、50〜80%のスクロース層間の界面をピペットで慎重に収集し、5容量の15ミリリットルの円錐管遠心分離機と15分間、摂氏4度でGの1000倍で混合します。上澄みを慎重に取り除き、ペレットを含むアグリゾーンを保持します。

このインターフェースでさらに2回の洗浄を繰り返します。アグリゾーンは蛍光性があり、最後の洗浄後にUV光の下で顕微鏡で視覚化でき、上清を廃棄し、ペレットを250〜500マイクロリットルのPBSに再懸濁します。このペレットには、精製されたアグロゾーンが含まれています。

10マイクロリットルのMRFPディスク、1つのasome懸濁液を、SHSY 5 Yヒト神経芽腫細胞を含む24ウェルプレートの各ウェルに加えます。可溶性GFPディスクを滅菌ガラスカバー上に1つのC末端に構成的に発現させ、インキュベーション後48〜72時間インキュベートします。細胞をPBSで3回洗浄し、0.04%トライアンブルーで細胞外蛍光を5分間クエンチします。

その後、PBSで洗ってトライアンブルーを取り除きます。次に、皿を氷の上に置き、4%PFAとPBSを10分間加えて細胞を固定します。次に、滅菌水で一度洗浄し、カバースリップをDPI封入剤で長時間の金でスライドガラスに取り付けます。

外因性の侵入における取り込みを確認します。Zack画像でレシピエント細胞によって発現されたリクルートされたタンパク質との共局在化により、アグロゾーンを適用しました。このザックは、深さが約6マイクロメートルです。

200ナノメートル刻みで撮影された24枚の写真。赤で示されているMRFPディスク1アグリゾーンの蛍光は、細胞質GFPC末端ディスクを動員します。緑色の共局在で示された1つのフラグメントは黄色で表示され、アグリゾーンがレシピエントのサイトゾルに入り、以前は可溶だったディスク1タンパク質を動員したことを示しています。

プロトコルのこの部分では、ヒトディスク1はDITE 5 94とラベル付けされます。このDにより、追加の免疫染色を必要とせずに、組換えタンパク質を直接モニタリングできます。添付文献に記載されているように調製したタンパク質をビームメルカプトエタノールから解放することから始め、2リットルのPBSで1〜2000の希釈で3回透析します。

次に、1ミリグラムのディスクを1枚にDITE 5 94 IDEでラベル付けし、1ミリグラムあたり1ミリグラムのタンパク質をPBSに溶解し、5ミリモルTCEPを添加して遊離TH基を回収し、DMF溶解色素を20マイクロリットルの反応に加え、分子量カットオフ10のSLI透析カセットを使用して室温で2時間インキュベートします。 000. ダルトンは、PBSでタンパク質を1対2000の割合で3回、毎回2時間透析します。次に、標識タンパク質の純度をさらに高めます。

NI NTAカラムでヒスタグベースのアフィニティー精製を行います。1ミリリットルのNI NTAマトリックスを10ミリリットルで洗います。次に、PBSは標識された透析タンパク質をカラムに適用し、カラム上を泳動させます。

ゆっくりと、溶液はタンパク質のNTAマトリックスへの結合により青色の一部を失い、標識されていない遊離色素はフロースルーに残ります。タンパク質溶液が入力されたら。このカラムは、カラムに500ミリモルオールを含有するPBSを2ミリリットル加えてタンパク質を溶出するために、20ミリリットルのPBSでカラムを3回洗浄する。

バルブを低速に設定し、滴下しながら、N NI NTAカラムの色付きバンドを監視します。言及するために、溶出液のこの着色画分は、標識組換えタンパク質を含有し、EITをSLI透析カセットに移し、EITを1〜2000の希釈で1〜2000の希釈で3回、透析後2リットルでそれぞれ2時間透析する。滅菌済みの0.45マイクロメートルシリンジフィルターにEITを押し込み、100マイクロリットルのサンプルを5倍分し、液体窒素で凍結します。

タンパク質の総量は、100マイクロリットルのアリコートごとに1ミリリットルあたり0.5〜1マイクログラムである必要があります。タンパク質の浸潤性を評価するために、レシピエントSH SY 5 Yヒト神経芽腫細胞を含む24ウェルプレートの各ウェルに、1ミリリットルあたり5〜10マイクログラムの標識組換えディスク1タンパク質を含有する培地を添加する。無菌ガラスカバースリップ上の可溶性GFPタグディスク1C末端を成分発現させ、48〜72時間インキュベートします。

アグリゾーンで処理された細胞に対して行われたように、細胞をクエンチ、細胞外蛍光、固定、およびマウントすると、Zack Imagingによって外因的に適用された組換えタンパク質の浸潤が確認されます。標識されたタンパク質が取り込まれると、共焦点顕微鏡で生成された画像でレシピエント細胞の周囲で検出されます。このザックは、220ナノメートルの24ステップで約5マイクロメートルの深さを網羅しています。

ここで、赤で示された組換えディスク1断片5、98〜7、85は、緑色で示された可溶性C末端GFPタグ付きディスク1を発現するレシピエント細胞に取り込まれ、ディスクの浸潤性を決定する。1つのタンパク質は、MRFPタグ付き全長ディスクからなるアグロゾーンを凝集し、NLF細胞から精製し、この写真に示すように、この写真に示すように、レシピエントSH SY 5Y細胞に適用しました。A-M-R-F-Pタグ付きディスク1は、アクロソームがヒト神経芽腫SH SY 5 Y細胞に浸潤し、可溶性GFPタグ付きC末端ディスク1を発現しました。

さらに、MRFPタグ付きディスク1asomeは、可溶性GFPタグ付きディスク1を不溶性凝集体に動員することができ、DIA光標識組換えディスク1の侵襲性を決定することができ、ここに示すように、可溶性GFPディスク1を発現するSH SY 5Y神経芽腫細胞に適用されました。赤で示された組換えディスク1タンパク質のモルターは、レシピエント細胞に侵入し、黄色の点は、可溶性GFPタグ付きC末端ディスク1の細胞をラベル付けされた凝集体に動員し、遺伝子組換えディスク1を発現し、大腸菌から精製したが、多量体タンパク質をラットの内側前頭前皮質に定位的に注入したときに、生体内でニューロンに細胞浸潤性であったことを示している。Zackイメージングは、ニューロン核に対する抗体で染色されたラット皮質ニューロンにおける組換えディスク1タンパク質の存在を確認します。

、細胞浸潤を研究するためのディスク1凝集体を生成する2つの方法を紹介しました。これらの方法のいずれかを使用して、外来DNAのトランスフェクションによる組換え遺伝子発現の潜在的に交絡変数なしに、ディスク1凝集体の取り込みの細胞への影響を調べることができます。これらの技術は、ディスク1タンパク質の病理の生物学的影響をin vitroで細胞内で、およびin vivoで脳内接種または動物モデルでの他の投与によって調査するために適用できます。

これらの技術は、各特定のタンパク質に採用されたプロトコルにわずかな変更を加えることで、最終的には他のタンパク質凝集体にも移行できると確信しています。この手順を行うときは、共焦点顕微鏡画像の入念な分析に時間を割くようにしてください。