Name: 細胞侵襲DISC1タンパク質種の生成、精製とキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: 学ぶDISC1タンパク質凝集体の生成・精製法。神経芽細胞を用いた2種類の細胞侵襲アッサイを比較し、タンパク質構造病のメカニズム解明に貢献する技術を紹介します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

デュッセルドルフ大学医学部のForschungskommissionの助成金によってサポートされていますCKVBに、この作品は、CKとJPH、DFG（GRK1033コ1679/3-1）にニューロンERANET DISCOVER（BMBF 01EW1003）によって賄われていた。

1。 Aggresomeドナー細胞の調製モノマー赤色蛍光タンパク質（MRFP）または強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）タグ付きヒト完全長（FL）のDISC1のトランスフェクション<ol><li>シード1.5×10 6/10センチメートルディッシュヒト神経芽細胞腫のNLF（NLF、フィラデルフィアの小児病院、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）10 10cmディッシュ内の細胞と一晩増殖。 NLFの細胞は、L-グルタミン、ペニシリン/ Strepomycin、10％FBSを添加したRPMI-1640培地で培養される。翌日、細胞は70〜80％コンフルエントになっているはずです。 </li><li>一時的に15μgのプラスミドDNAとMetafecteneトランスフェクション試薬（Biontex、Martinsried、Germany）でそれぞれ10cmディッシュをトランスフェクション。簡単に説明すると、10cm皿に、15μgのプラスミドDNAと30μlのMetafecteneは、750μlののOpti-MEMに添加し、混合し、室温で20分間インキュベートした。 5皿をpcDNA3.1 mRFPを/ EGFPプラスミド単独でのeGFPタグ付きヒト（フロリダ州）のDISC1と5皿でトランスフェクトした。 </li></ol> 2。 Aggresomeトランスフェクトされたドナー細胞からの精製ここで説明されたプロトコルは、脳組織13と大きな凝集体とアグレソーム14を単離するためのプロトコルからレヴィー·ボディを浄化するための方法を組み合わせたものです。すでに既存の方法は、洗剤の使用量に基づいているので、細胞浸潤アッセイのアプリケーションのための界面活性剤を含まないタンパク質の分離は非常に重要です。 <ol><li>トランスフェクションの48時間後には、eGFPおよびmRFP/eGFP-DISC1の発現をモニターし、蛍光顕微鏡（ 図1）に基づくアグレソームの形成を確認します。 </li><li> 1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを追加（ロシュ、インディアナポリス、インディアナ州）とPrecellys24ホモジナイザー（ベルタン技術、フランス）を用いて細胞を破壊し、PBS pHは7.4、400μlのPBSそれぞれとスクレープで細胞を洗浄します。簡単に言えば、2 mlの溶解チューブに1 mlの細胞懸濁液を加え、10セラミックビーズを追加します。 3×60秒パルスで細胞を溶解します。プロセスの機械的な力かもしれない37前述のサンプル内の温度を上げる℃のような注意が溶解処理後のサンプルを氷上に寒さに注意する必要があります。 </li><li>氷の上のセルを冷却し、37℃で60分間、10mMのMgCl 2、40 U / mlのDNaseとインキュベートを追加°C </li><li> 80％、50％、PBSのpHは7.4（各10ml）中の20％スクロース（w / v）の溶液を調製する。 </li><li> 50パーセントと20パーセント、続いて2ミリリットル80％スクロースを皮切りに、15mlファルコンチューブにショ糖勾配を準備します。徐々に勾配を注ぎ、既に注ぎ層を乱さないように注意してください。 4℃で1000×gで15分間、遠心勾配の上の層消化ライセートを℃に</li><li>慎重に、PBS pH7.4の5倍量とピペットとミックスで50〜80％のショ糖層との間​​の相間を収集します。 4℃、1000×gで15分間遠心さらに2回洗浄を繰り返します。この中間期では、アグレソームは蛍光であり、紫外線下で顕微鏡で可視化することができる。 </li><li>上清を捨て、250から500μLのPBS（pH7.4）中でペレットを再懸濁します。このペレットは、精製アグレソーム（ 図2）が含まれています。 </li></ol> 3。 mRFP/eGFP-DISC1アグレソームと受信者のSH-SY5Y細胞の治療<ol><li>シード5×10 4個の受信者のSH-SY5Yヒト神経芽腫細胞恒常的に24ウェルプレートの各ウェル中の滅菌カバーグラス上のGFP-DISC1（598から854）を発現する。 SH-SY5Y細胞は、ペニシリン/ストレプトマイシン、非必須アミノ酸（NEAA）および10％FBSを添加したDMEM/F-12培地で培養される。 </li><li> 24時間後、各ウェルに10μlを加えると48〜72時間インキュベートする。 </li><li> PBSのpHは3×7.4細胞を洗浄し、5分間は0.04％トリパンブルーで細胞外の蛍光を消光する。 </li><li>氷上で10分間PBS pH7.4中4％PFAで細胞を固定し、DAPIマウント培地（Invitrogen、米国）とゴールドを長引かせると滅菌H 2 Oで1回洗浄し、ガラススライド上にカバースリップをマウントします。 </li><li> /取り込みを確認するZスタック画像に受容細胞によって発現募集タンパク質との共局在化によって外因的に適用アグレソームの侵攻。 </li></ol>まだ、外因性タンパク質の取り込み/侵入は基本的に宿主細胞タンパク質の募集と並行して検出されないことがあります。私たちの例では、mRFPをタグ付きDISC1アグレソームリクルート可溶性GFPタグDISC1（598から854）は、宿主細胞（ 図3を参照）によって発現されたタンパク質を。写真はツァイスLSM 510共焦点またはツァイスAxioVisionのApotome2顕微鏡で撮影した。 4。組換えDISC1の世代（598から785） 前の刊行物では、自己会合ドメインの存在に基づいて、自己の対話への様々なDISC1タンパク質断片の能力を分析した。最強多量性向4（ 図4）表示されているすべてのタンパク質の中でテストした人間のDISC1（598から785）を断片化します。従って、ヒトDISC1（598から785）は、（いいえpET15bにクローニングした大腸菌で発現し、N末端​​6 -ヒスチジンタグを含むvagen、マディソン、ウィスコンシン州）、 大腸菌 BL21-（lDE3）はロゼッタ（Novagen社製、米国）、および4に記載されているように 8モル/ l尿素で変性条件下で精製した。要するに、プロトコルは以下の通りです。 <ol><li> BL21-（IDE3）ロゼッタE.大腸菌を OD 600に5mMの5 MM-アルギニン塩酸、硫酸マグネシウム、100μg/ mlのcarbencillin、35μg/ mlのクロラムフェニコールを含む2×500ミリリットル2YTで増殖させた：0.6から0.8とDISC1（598から785）の発現を誘導した1mMのIPTGで。 </li><li> DISC1（598から785）を37℃で4時間発現させ、発現は、遠心分離により菌体を収穫によって終了されました。 </li><li>細菌ペレットを50mlのTE緩衝液（50mMのトリス-HCl pH 8.0、5mMのEDTA）と2mMのPMSF、1％TX-100、250μg/ mlのリゾチーム、20mMのMgCl 2および400 U/50 mlに再懸濁した完全な溶解を確実にするためにDNアーゼIは、反応が穏やかに攪拌しながら室温で30分間インキュベートした。 </li><li> 10mMのβ-mercaptを追加さらに30分間oethanol（ME）と500mMのNaClとインキュベートする。 </li><li> 4℃で30分間20.000グラムで細菌封入体をスピンダウン</li><li> 50mMのトリスpH8.0、5mMイミダゾール、500mMのNaCl、8M尿素および10mMのβ-MEを含む、4℃で30分間20.000グラムで遠心分離して破片を除去し、50mlの抽​​出バッファーでペレットを再懸濁し℃、 </li><li>抽出バッファーでNi-NTAアガロースマトリックスを洗う。室温で2時間、Ni-NTAマトリックスを用いて再懸濁し、preclearedタンパク質抽出物をインキュベートする。 </li><li> 12mMのイミダゾールを含有する抽出バッファーでNi-NTAマトリックスを洗う。 </li><li> 50mMトリス、500mMのNaCl、300 mMイミダゾール、8M尿素、1mMのPMSF、5mMのEDTAおよび10mMのβ-MEを含む15mlの溶出緩衝液でゆっくりタンパク質を溶出する。 </li><li> 10mMのβ-MEを含むPBS pH7.4に段階的にタンパク質を透析する。 </li></ol> 1リットルの細菌培養液から始まるそれは、組換えDISC1（598から785）protの50 mgまで単離することが可能であるEIN。 α-シヌクレインのリフォールディング α-シヌクレインを用いた実験のために、組換えタンパク質500μgの（Sigma-Aldrich社製、米国）を1 mg / mlの濃度でPBSに溶解した。オリゴマーを得るためには、フォールディング℃で、前の出版物10で説明した37℃で一晩行った。 5。 DyLight594有する組換えDISC1（598から785）のラベリング<ol><li>前に後続のラベリング処理、DISC1（598から785）タンパク質が、β-MEから解放されました。したがって、タンパク質は1:2,000の希釈で、PBS pH7.4に3回透析する。 </li><li>ラベル1、製造業者の使用説明書に従ってDyLight 594マレイミド（サーモサイエンティフィック社、米国）とMG DISC1（598から785）。短期では、PBS（pH7.4）に1 mg / mlのタンパク質を分解し、遊離チオール基を回収するの5mM TCEPを追加します。室温で2時間反応し、インキュベートをDMF溶解染料の20μlを添加する。 </li><li> PBSのpHにタンパク質3 xを透析2時間ごとに1:2000の割合で7.4。 </li></ol>実行されたNi-NTAカラムでアフィニティー精製の​​His 6 -タグベースの標識タンパク質の純度を一層高めるために。 <ol start="4"><li> 10mlのPBS pH7.4で1ミリリットルNi-NTAマトリックス（Qiagen、ドイツ）を洗浄します。 </li><li>列に標識し、透析タンパク質を適用し、それが徐々に列の上に走らせた。 </li><li> 3×20 mlのPBS pH7.4でタンパク質を洗う</li><li>溶出液量を減らすために、Ni-NTAカラムに色のバンドを監視しながら、PBS pH7.4の500mMイミダゾール滴下してタンパク質を溶出する。 </li><li> 2時間ごとに1:2000の希釈の10mM NAPI pH7.4に溶出液3 xを透析する。 </li><li>溶出液は、液体窒素中で5×100μlのサンプルとスナップ凍結でアリコートをフィルタ処理するためのフィルタ滅菌0.45μmのシリンジを使用しています。各100μlアリコートで1μg/ mlの - タンパク質の総量は0.5であるべきです。 </li></ol> オプションconcentrationステップ<ol start="10"><li> stereotacticalラットの注射のために、タンパク質は、速度-VAC（エッペンドルフコンセントレータ5301）で10倍に濃縮した。最終バッファ条件は100mMのNAPIだった。 </li></ol> α-シヌクレインのラベリング組換えα-シヌクレインのラベリングと精製は、ニッケル（Ni-NTAカラム）DISC1（598から785）に平行して行われました。合計出発材料は、500μgの代わりにDISC1（598から785）は1 mgであった。 6。ラベル付けされた組換えDISC1（598から785）タンパク質と受信者のSH-SY5Y細胞の治療<ol><li>シード5×4受信側のSH-SY5Yヒト神経芽腫細胞は恒常的に24ウェルプレートの各ウェル中の滅菌カバーグラス上のGFP-DISC1（598から854）を発現する。 </li><li> 5から10μg/ mlの濃度で細胞培養培地に標識タンパク質を追加し、48〜72時間インキュベートする。 </li><li> PBSのpHは3×7.4細胞を洗浄し、抽出が渇きを5分では0.04％トリパンブルーでellular蛍光。 </li><li>氷上で10分間PBS pH7.4中4％PFAで細胞を固定し、DAPIマウント培地（Invitrogen、米国）とゴールドを長引かせると滅菌H 2 Oで1回洗浄し、ガラススライド上にカバースリップをマウントします。 </li><li>レーザー共焦点顕微鏡を走査することによって生成されたZスタック画像に受容細胞によって発現募集タンパク質と共局在して外因的に適用組換えタンパク質の取り込み/侵攻を確認します。しかし、内因性のタンパク質の募集は基本的に宿主細胞タンパク質の侵攻と並行して検出されないことがあり、Zスタック画像はまだタンパク質の侵襲的な性質を確認することができます。 </li></ol>私たちの例のRECに。 DISC1（598から785）*少なくとも一部の新兵に可溶性DISC1（598から854）は、宿主細胞（ 図5Aを参照）によって発現されたタンパク質をGFPタグ付き。組換えα-シヌクレインの侵略が、ノー募集のため（ 図5B）が示されている。写真を撮ったツァイスLSM 510共焦点上またはツァイスAxioVisionのApotome2顕微鏡。 濃縮の注射でさえ動物の灌流後に検出することができる注射部位の周りにタンパク質の拡散でMPFC結果にDISC1（598から785）*を標識した（2.5μg/μLのの約4μl）を、ローダミンのfiltersetを含むPBS pH7.4中4％PFA。今回の例ではDISC1（598から785）はニューロンの異なる数によって巻き取られると、Zスタック画像（ 図6）を使って監視できます。 一般的には、他のタンパク質の注射は、次にここで使用されているものは、必ずしも細胞浸潤につながらない。侵入イベントがタンパク質の性質上基本的に依存している、それにもかかわらず、きれいな精製は、さらなる分析のための前提条件です。 7。代表的な結果 NLFの細胞から精製された組換えフロリダDISC1-EGFPから成るアグレソームは、受取人、SH-SY5Y CEを侵略共焦点顕微鏡（ 図3）との共局在化によって見られるように、低効率でLLS（約0.3％5）。既報の通り、DISC1（598から785）が発現し、 大腸菌から精製4多量に形成された大腸菌は、ポジティブコントロール（ 図5B）のように並列で使用されていたα-シヌクレインと同様の約20％5（ 図5A）の効率で均等に細胞侵襲的であった。標識された組換えDISC1（598から785）、Eから発現させ、精製し多量体タンパク質は、定位的にラットの内側前頭前野（; PUM、ベイダー、ヒューストン、Korth、未発表の図6）に注入したときに大腸菌は in vivo においてもニューロンに細胞侵襲的であった。 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="図1" /> 図1のNLF神経芽細胞は一過性のFP-DISC1（赤色）を発現する。赤色蛍光アグレソームはdeteすることができます細胞内CTED。 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="図2" /> ショ糖勾配で精製後2。精製mRFPをタグ付きDISC1アグレソーム図 。 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="図3" /> 図3に侵攻アグレソームの蛍光画像。 mRFPをタグ付きflDISC1アグレソームはDISC1には、（598から854）を過剰発現する可溶性のGFPタグSH-SY5Y神経芽腫細胞を用いて精製し、インキュベートした。ラベル付きアグレソームの取り込みはレーザースキャン顕微鏡（Zeiss LSM 510）上のZ-スタックイメージングによって監視されています。 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="図4" /> 図4 recのSEC-プロファイル。 S704とC704の一塩基多型（SNP）を含むDISC1（598から785）。両方の変異体は、順序付けられたオリゴマーの中断および高分子量MULTの形成を示すimers（赤矢印）。この写真はLeliveld らの出版物。、生化学、2009年から変更されています。 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。侵襲DyLight標識組換えDISC1（598から785）の蛍光Zスタック画像。水溶性のGFP-DISC1を（598から854）を発現するSH-SY5Y神経芽細胞は、5μg/ mlの濃度で標識された組換えタンパク質とともにインキュベートした。 （A）は赤の集計はRECの侵略を示しています。 DISC1（598から785）タンパク質と黄色のドットの集合体に水溶性のGFP-DISC1（598から854）の動員を示す。 （b）組換えα-シヌクレイン（赤）が約20％の頻度で募集せずに細胞に侵入する。 <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="図6" /> 図6の免疫蛍光画像注入されたラベルが付いた組換えDISC1（598から785）タンパク質。 Z-スタックイメージングは​​RECの存在を確認する。 DISC1（598から785）の神経核（NeuN、緑）に対する抗体で染色したラット皮質ニューロンにおけるタンパク質。

<ol><li>Millar, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li>
<li>St Clair, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+within+a+family+of+a+balanced+autosomal+translocation+with+major+mental+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness.</a> Lancet. 336, 13-16 (1990).</li>
<li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insolubility+of+disrupted-in-schizophrenia+1+disrupts+oligomer-dependent+interactions+with+nuclear+distribution+element+1+and+is+associated+with+sporadic+mental+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease.</a> J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).</li>
<li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomer+assembly+of+the+C-terminal+DISC1+domain+%28640-854%29+is+controlled+by+self-association+motifs+and+disease-associated+polymorphism+S704C%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C.</a> Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).</li>
<li>Ottis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+two+independent+mental+disease+genes+on+the+protein+level%3A+recruitment+of+dysbindin+to+cell-invasive+disrupted-in-schizophrenia+1+aggresomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes.</a> Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).</li>
<li>Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+induction+of+cerebral+beta-amyloidogenesis+is+governed+by+agent+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host.</a> Science. 313, 1781-1784 (2006).</li>
<li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).</li>
<li>Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+diversity+of+wild-type+Tau+fibrils+specified+by+templated+conformation+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change.</a> J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).</li>
<li>Clavaguera, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+and+spreading+of+tauopathy+in+transgenic+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain.</a> Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).</li>
<li>Desplats, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+formation+and+neuronal+cell+death+through+neuron-to-neuron+transmission+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).</li>
<li>Ren, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+penetration+and+persistent+infection+of+mammalian+cells+by+polyglutamine+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates.</a> Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).</li>
<li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).</li>
<li>Iwatsubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+Lewy+bodies+from+the+brains+of+patients+with+diffuse+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease.</a> Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).</li>
<li>Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+aggresomes+and+other+large+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of aggresomes and other large aggregates.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).</li>
<li>Korth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DISCopathies%3A+brain+disorders+related+to+dysfunctional+DISC1%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1.</a> Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

本研究では、トランスフェクトされた神経芽腫細胞株、組換えDISC1タンパク質種の準備とラベリングし、in vitro および in vivo での受容細胞の細胞侵入実験でそれぞれのアプリケーションからmRFP/eGFP-DISC1アグレソームの精製について説明します。 ネイティブmRFP/eGFP-DISC1アグレソームの精製は、レビー小体のような構造と大きな凝集体13,14を分離するためのプロトコルから開発されたが、洗剤の使用を回避し、発生する可能性の細胞浸潤、偽陽性のリスクを最小限にするように変更されました洗剤促進性膜浸透に起因する。 一つの可能​​な将来の改善がさらに完全にアグレソームから残っている膜と細胞骨格を分離するために、超音波処理によってアグレソームの純度を高めるためにあるかもしれない。 、大アグレソームミリアンペアのために記録合計侵攻イベントの数を全体の純度を高めることによりyは5を増加させること。私たちが提案した3相スクロースの限られた定義は、他のタンパク質種のアグレソームために十分であるかどうかをテストする必要があり、この意味では、プロトコルがここに概説さは、個々の最適化のための出発点として考慮されるべきである。精製アグレソームは、スクロースの痕跡が著しく全体の収率を低下させなかった排除するために、追加の洗浄工程（洗剤なしで）、私たちの手の中に非常に堅牢であることが判明した。 前の刊行物では、DISC1のオリゴマーアセンブリはC末端4（ 図4）に明確な多量体化ドメインに依存していることを説明した。我々は、 大腸菌での組換え可溶性発現のために、この断片を選択しました大腸菌および後続とNi-NTA精製。その多量体化を監視するには、α-シヌクレインのように記載される細胞侵襲性のタンパク質とその細胞の浸潤を比較するために、我々は、蛍光色素DyLight594とDISC1（598から785）を標識し、比較してその均等に標識したα-シヌクレインのそれと細胞浸潤。組換えDISC1断片の細胞浸潤は劇的ネイティブ、全長DISC1アグレソームを、おそらくそれより小さいサイズとはるかに高い純度のためのそれに比べて増加した。繰り返しになりますが、純度は細胞浸潤に決定的な役割を果たしているように見える。 今回の例では侵襲アグレソームは、組換え可溶性、 すなわち細胞分散された形態で発現させた標的細胞株の可溶性ホモログタンパク質を募集した。それがZ-スタックイメージング経由受容細胞の制限内に侵襲アグレソームと組換えタンパク質の共局在化を可能にするので、レシピエント細胞ラインの蛍光タンパク質（ 例えば、GFPまたはRFP）の発現が利点です。 大腸菌から発現および精製された細胞侵襲性DISC1のアグレソームおよび多量の断片大腸菌は、DISC1、DIに関連するタンパク質コンフォメーション病の決定的な特徴かもしれませんSC1opathies 15。 トラブルシューティング： ショ糖勾配精製後の低aggresome収率： このプロトコルで導入されたショ糖勾配はeGFP/mRFP-DISC1（フロリダ州）アグレソームでうまく動作します。他のタンパク質からなるアグレソームは変数の次元があるかもしれない従ってスクロース濃度は、他のユーザによって最適化されるべきである。 組換えタンパク質の精製が不十分： 組換えタンパク質の精製プロセスの任意の細菌汚染は、プロトコルの後の手順でラベル付けされます。汚染を避けるために、SDS-PAGEでタンパク質を実行し、組換えタンパク質は、クーマシーブルーで染色することにより、純粋な少なくとも95％であることを確認します。最高の品質と収量を確保するために、プロトコルは、個々の蛋白質のために最適化する必要があります。 低ラベリングEF組換えタンパク質のFICIENCY： 遊離SH基を含む任意の汚染は、タンパク質の効率的な標識を減少させるであろう。したがって、大規模な透析とNi-NTAベースの浄化は必須です。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11875-093 </td><td>培地は、宿主細胞系に依存しています。最適なレシピエント細胞株は、ユーザによって決定されるべきである。 </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11320-033 </td><td>培地は、レシピエント細胞株に依存しています。最適なレシピエント細胞株は、ユーザによって決定されるべきである。 </td></tr><tr><td> PBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td>他のトランスフェクション試薬は、同様に動作するかもしれないが、我々のプロトコルでテストしていません。 </td></tr><tr><td> Ni-NTAアガロース</td><td>キアゲン</td><td> 30210 &lt;/ TD&gt; <td>実験はQiagenからNi_NTAアガロースを用いて行われた、他のサプライヤーも同様に動作するはずです。 </td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td>ロッシュ</td><td> 04716728001 </td><td>アグレソーム精製の過程でRNaseフリーのDNaseの必要は全くありません。 </td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td>のOpti-MEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 31985-062 </td><td>無血清培地は、同様に動作します</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140122 </td><td> SH-SY5YとNLFの媒体のためのサプリメント</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸（NEAA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M7145 </td><td> SH-SY5Y媒体のためのサプリメント</td></tr><tr><td>トリパンブルー0.4パーセント</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T8154 </td><td>有毒な試薬</td></tr><tr><td> DyLight 594マleimide </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 46608 </td><td>安定なチオエーテル結合を形成するシステイン反応性染料を削減しました。また、他の色で利用できる。 </td></tr><tr><td> DAPIで金を延ばす</td><td>インビトロジェン</td><td> P36935 </td><td>この退色液体封入は我々の手で最高の結果をもたらしてくれた。 </td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロッシュ</td><td> 11873580001 </td><td> 100Xソリューションの500μlのH 2 Oに1テーブルを溶かす。 </td></tr><tr><td>合成α-シヌクレイン</td><td>シグマ</td><td> S7820 </td><td>フォールディングなどのテキストで説明しています。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 特定の試薬 ​​のテーブル。 </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td>ベルタンテクノロジーズ</td><td> 03119.200.RD000 </td><td>我々は、他の機械的な均質をテストしていませんこれ以外nizers。他の洗剤フリー均質化法は、同様に動作するかもしれないが、このプロトコルのためにテストされていません。 </td></tr><tr><td> 5301コンセントレータ（speedvac） </td><td>エッペンドルフ</td><td> 5301 000.210 </td><td>タンパク質を濃縮する必要がある場合にのみ必要。 </td></tr><tr><td> LSM 510とAxioVisionのApotome2 </td><td>ツァイス</td><td>メーカーカタログを参照してください。 </td><td>両方の顕微鏡は、Z-スタックイメージングを実行する能力を抱く。これは、侵入イベントの固体と深刻な評価をするための前提条件です。 </td></tr><tr><td>細胞培養用プラスチック材料</td><td>ヌンク</td><td> 10cmの皿＃172958、24ウェルプレート＃142475 </td><td>異なるプラスチック材料の使用は、組換えタンパク質またはアグレソームおよびプラスチック表面との相互作用に影響を及ぼす可能性がある。我々は、ここで説明されたもの以外の材料をテストしていません。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 特定の材料および装置のテーブル。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 数 </td><td> バッファ名 </td><td> コンテンツ </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 1。 </td><td>細菌増殖培地</td><td>硫酸マグネシウム5mMの16グラム/ lバクトトリプトン、10g / lのバクト酵母エキス、5g / LのNaCl、5mM-アルギニン-HCl、100μg/ mlのcarbencillin、35μg/ mlのクロラムフェニコール</td><td> OD 600まで細菌を培養：0.6から0.8は、1mMのIPTGで発現を誘導する。 </td></tr><tr><td> 2。 </td><td>細菌の懸濁緩衝液</td><td> 50mMのトリス-HCl pH 8.0、5mMのEDTA、2mMのPMSF、1％TX-100、250μg/ mlのリゾチーム、20mMのMgCl 2および400 U/50ミリリットルのDNase I </td><td>オベ1 Lから細菌ペレットをResupend50mlの懸濁緩衝液でrnight文化。 </td></tr><tr><td> 3。 </td><td>タンパク質抽出バッファー</td><td> 50mMのトリスpH8.0、5mMイミダゾール、500mMのNaCl、8M尿素及び10mMのβ-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4。 </td><td> Ni-NTAカラムの洗浄​​緩衝液</td><td> 50mMのトリスpH8.0、5mMイミダゾール、500mMのNaCl、8M尿素及び10mMのβ-ME、12 mMイミダゾール</td><td> 12 mMイミダゾールを有する変性抽出バッファーが追加されました。 </td></tr><tr><td> 5。 </td><td> Ni-NTAカラム溶出バッファー</td><td> 50mMトリス、500mMのNaCl、300 mMイミダゾール、8M尿素、1mMのPMSF、5mMのEDTAおよび10mMβ-ME </td><td>溶出緩衝液は、後に透析し、10mMのβ-MEを含んでいます。 </td></tr><tr><td> 6。 </td><td> PBS </td><td>は8g / lのNaCl、0.2g / LのKCl、1.44g / LのNa 2 HPO 4、0.24グラム/ L KH 2 PO 4、pH7.4に調整</td><td></td></tr><tr><td>7。 </td><td>バッファのラベリング</td><td> 5mMのTCEPを含むPBS </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> レシピのテーブル。 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

細胞侵襲disc1タンパク質種の生成、精製とキャラクタリゼーション

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

タンパク質凝集は、アルツハイマー病（Aβ、タウ）、パーキンソン病（α-シヌクレイン）、ハンチントン病（ポリグルタミン、チンチン）、および他の神経変性疾患、例えば、変性脳の条件が好きで、慢性の一般的特質として見られている。タンパク質の凝集が妨げproteostasisが原因で発生すると考えられ、発生したと誤って折り畳まれたタンパク質の分解との間の不均衡、 すなわち 。注目すべきは、同じタンパク質が家族性の稀少変異の変異であるこれらの疾患の散発型に集約発見されています。 統合失調症は、多くの場合、永久的で不可逆的な認知障害と一緒に行くの慢性進行性の脳の状態です。候補遺伝子アプローチでは、混乱·イン·統合失調症1（DISC1）、慢性の精神疾患1、2へのリンケージとスコットランドの家族の中でクローニングされた遺伝子が、BRAIに不溶性の凝集体として見つけることができるかどうかを検討nは統合失調症3の散発例。 SMRI CCを使用して、我々はCMDで例約20％で同定が、生化学的分画後の神経変性疾患ではない通常のコントロールや患者がサルコシル不溶性DISC1の免疫反応。 in vitroでのその後の研究は、DISC1の凝集傾向を疾患関連多型S704C 4の影響を受けていたことを明らかにし、in vitro で生成されたDISC1アグレソームはAβ6に示されていたものと同様の5、タウ7-9、α細胞侵襲的であったこと-シヌクレイン10、ポリグルタミン11、SOD1凝集体12。これらの知見は、私たちは、CMDを持つケースの少なくとも一部、集約されたDISC1とのそれらは、タンパク質立体配座の疾患かもしれないことを提案するように求められます。 ここで我々は、哺乳動物細胞におけるDISC1アグレソームを生成する方法を説明し、ショ糖密度勾配上でそれらを浄化し、細胞浸潤のストゥディのためにそれらを使用するES。同様に、我々は我々が独占的に多量のC末端フラグメントDISC1、ラベルを生成し、細胞浸潤の研究のためにそれを浄化する方法を説明します。 DISC1の組換え多量体を用いて、我々は同様に標識合成α-シヌクレインフラグメントの場合と同様の細胞浸潤能を実現しています。我々はまた、定位レシピエント動物の脳に注入する場合は、このフラグメントを in vivo で取り上げられていることを示している。

細胞培養液からの細胞内、細胞質の全長DISC1タンパク質のアグレソームのとで標識し、多量換えDISC1タンパク質断片の生成、精製および細胞浸潤<em&gt; E大腸菌の</em&gt;記載されています。細胞の浸潤は、細胞培養とニューロンの受容細胞のために示されて<em生体内で&gt;</em&gt; stereotactical脳接種後。

細胞侵襲DISC1タンパク質種の生成、精製とキャラクタリゼーション

タンパク質凝集は、例えばアルツハイマー病（Aβ、tau）、パーキンソン病（α-シヌクレイン）、ハンチントン病（ポリグルタミン、ハンチンチン）などの神経変性疾患に見られるような、慢性的かつ変性的な脳疾患の一般的な特徴であると考えられている。タンパク質凝集は、プロテオスタシスの破綻、すなわちミスフォールドしたタンパク質の生成と分解のバランスが崩れることによって起こると考えられている。注目すべき点として、家族性の稀な変異体において変異しているものと同じタンパク質が、これらの疾患の孤発例においても凝集した状態で発見されている。統合失調症は、多くの場合、永続的かつ不可逆的な認知機能欠損を伴う慢性進行性の脳疾患である。我々は候補遺伝子アプローチを用いて、慢性の精神疾患との連鎖が認められたスコットランドの家系でクローニングされた遺伝子であるDisrupted-in-schizophrenia 1（DISC1）が、孤発例の統合失調症患者の脳内で不溶性凝集物として存在するかどうかを調査した。SMRI CCを用いた結果、生化学的分画後、正常対照群や神経変性疾患患者では認められなかったが、慢性の精神疾患（CMD）例の約20％においてサルコシル不溶性のDISC1免疫反応性を同定した。その後のin vitro研究により、DISC1の凝集傾向は疾患関連ポリモーフィズムS704Cの影響を受けること、およびin vitroで生成されたDISC1アグリソームは、Aβ、tau、α-シヌクレイン、ポリグルタミン、あるいはSOD1凝集物で示されていたのと同様に、細胞侵入性を有することが明らかになった。これらの知見に基づき、我々はCMD症例の少なくとも一部、すなわちDISC1凝集物を有する症例は、タンパク質コンフォメーション病である可能性を提案した。本稿では、哺乳類細胞におけるDISC1アグリソームの生成方法、ショ糖密度勾配による精製方法、およびそれらを用いた細胞侵入性研究について述べる。同様に、多量体のみからなるDISC1 C末端断片の生成、ラベル化、および細胞侵入性研究のための精製方法についても述べる。リコンビナントDISC1多量体を用いることで、同様にラベル化した合成α-シヌクレイン断片と同等の細胞侵入性を達成した。また、この断片を受容動物の脳に定位的に注入した際、in vivoで取り込まれることも示す。

以下に述べる手順の全体的な目的は、精製されたディスクを生成することです。1つは受容細胞に侵入可能な凝集塊です。この目的を達成するための2つの異なる方法のうち、まず最初の方法について実演します。アポトーシス形成蛍光タンパク質Disc1融合タンパク質を、NLFヒト神経芽細胞腫ドナー細胞で過剰発現させます。その後、細胞をPBSで洗浄して回収し、界面活性剤を用いずに溶解させます。DNAを消化し、ショ糖密度勾配システムを用いてアグロゾームを精製します。この方法で精製されたAgriosは、細胞侵入効率が低くなります。代替アプローチとして、組換えdisc oneタンパク質の5 98から7 85のアミノ酸をe coliで過剰発現させます。その後、タンパク質断片をDITE 5 94で標識し、透析を行い、NI NTAマトリックスを用いて精製することで、未結合の色素や多量体discを除去します。この方法で生成された断片は、宿主細胞への侵入能を評価するための高い細胞侵入効率を有しています。精製された蛍光タンパク質ディスク、リボソーム、または標識されたリコンビナントディスクのいずれかを用い、断片を目的の受容細胞とともにインキュベートします。その後、細胞外の蛍光を消去するためにトリパンブルーを加え、共焦点顕微鏡で浸潤を可視化します。これまで、統合失調症のような慢性精神疾患において、タンパク質凝集は認識された特徴ではありませんでした。統合失調症で破綻しているあるタンパク質が候補となりますが、タンパク質凝集体の細胞浸潤性は、タンパク質構造異常疾患の顕著な特徴です。本研究では、2つの手法を用いて、disc oneタンパク質凝集体が細胞浸潤性であることを示し、したがってdisc one関連疾患またはdisc oneニューロパチーがタンパク質構造異常疾患であることを示します。2つの手法とは、第一に神経芽細胞腫細胞株からのフルレングスdisc one ASOSの精製、および第二に、E. coliにおけるC末端マルチメリックdisc oneフラグメントの発現、ならびにその精製と蛍光色素による標識です。最初の方法は、精製されたマイクロソームを取り込む細胞の浸潤効率が約 0.3% と低くなるだけでしたが、精製組換えタンパク質断片は、曝露された細胞の最大 20% に感染します。ここで説明した方法は、アクロソーム形成またはマルチマー会合が十分に実証されている他のタンパク質にも転用できるはずです。10 cm ディッシュ 10 枚ずつのそれぞれにおいて。補完されたRPMI 1640培地に1.5 × 10⁶個のヒト神経芽細胞腫およびLF細胞を播種し、一晩培養します。翌日、細胞のコンフルエンシーが70〜80%に達していることを確認します。5枚のディッシュにPC DNA 3.1 MRFPおよびEGFPタグ付きヒト全長disc1をトランスフェクションするためのラベルを付け、別の5枚にEGFPプラスミド単独をトランスフェクションするためのラベルを付けます。10 cmディッシュ1枚につき、15 µgのプラスミドDNA、30 µLのmet affecting、および750 µLを混合します。マイクロ遠心チューブにOpti MEMを入れ、ピペッティングで混和させた後、室温で20分間インキュベートします。次に、細胞にトランスフェクションさせるため、DNAトランスフェクション試薬溶液を細胞に滴下し、37 °C、5% CO₂条件下でインキュベートします。トランスフェクションから48時間後、MRFP full length disc oneの発現をモニターし、蛍光顕微鏡下でaggresomeの形成を確認しました。ここに示すように、一部の細胞には大量の蛍光タンパク質封入体が認められます。本プロトコルでは、脳組織からレビー小体を精製する方法と、より大きな凝集塊またはアグロゾーンを単離するプロトコルを組み合わせています。既存の手法は界面活性剤の使用に基づいているため、細胞侵入能アッセイに適用するための界面活性剤フリーのタンパク質を単離することが重要です。次に、培地を吸引し、PBSで洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むPBSを400 µL添加します。その後、細胞をスクレイピングし、細胞懸濁液1 mLとセラミックビーズ10個を2 mLライシスチューブに加えます。Pre-cell lyse 24ホモジナイザーを用いて、62ndパルスを3回行い細胞を溶解します。この工程による機械的な力で、サンプル内の温度が37 °C以上に上昇する可能性があります。そのため、サンプルを氷上で冷却するように注意してください。溶解工程の後、細胞を氷上で冷却し、10 mM 塩化マグネシウムと40 units/mL DNAAを加え、37 °Cで振盪しながら60分間インキュベートします。PBSを用いて、80%、50%、20%（w/v）のスクロース溶液をそれぞれ10 mL調製します。次に、15 mLのコニカルチューブに、まず80%スクロースを2 mL、次に50%スクロースを2 mL、最後に20%スクロースを2 mLの順に加えて、スクロース密度勾配を作成します。勾配を作成する際は、既に注入された層を乱さないよう、ゆっくりと注いでください。次に、消化したライセートをグラジエントの上に重層し、4°Cで1000 ×gで15分間遠心分離します。ブレーキを切った状態で、ピペットを用いて50〜80% sucrose層の界面を慎重に回収し、5倍量の緩衝液とともに15 mLコニカルチューブに入れ、4°Cで1000 ×gで15分間遠心分離します。上清を慎重に取り除き、ペレットを含むアグリゾーンを回収します。この界面で洗浄をさらに2回繰り返します。Agri zoneは蛍光を発するため、最後の洗浄後に顕微鏡のUV光下で可視化できます。上清を捨て、ペレットを250から500 µLのPBSで再懸濁してください。このペレットに精製されたagro zoneが含まれています。SH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞を滅菌済みガラスカバースリップ上に播種した24ウェルプレートの各ウェルに、可溶性GFP-disc1 C末端を恒常的に発現させたMRFP-disc1some懸濁液を10 µLずつ添加し、48～72時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、0.04%トリパンブルーを用いて細胞外蛍光を5分間クエンチします。その後、PBSで洗浄してトリパンブルーを除去します。次に、ディッシュを氷上に置き、4% PFAとPBSを加えて10分間細胞を固定します。その後、滅菌水で一度洗浄し、ProLong Gold DPI封入剤を用いてカバーガラスをガラススライドに封入します。受容細胞によって発現し、動員されたタンパク質との共局在をZスタック画像で確認することで、外因的に投与されたアグロゾーンの侵入における取り込みを確認します。このZスタックは約6 µmの深さをカバーしています。200 nanometersの間隔で撮影された24枚の画像。赤色で示されたMRFP disc one agri zoneの蛍光が、細胞質にあるGFPC terminal discをリクルートしている。緑色で示されたある断片の共局在は黄色として現れており、これはagri zoneがレシピエントの細胞質に進入し、以前は可溶性であったdisc oneタンパク質をリクルートしたことを示している。プロトコルのこのパートでは、human disc oneをDITE 5 94で標識します。これにより、追加の免疫染色を行うことなく、組換えタンパク質を直接モニタリングすることが可能になります。まず、付属文書の記載に従って調製したfreeing proteinを、2 LのPBSを用いて1:2000の希釈倍率で3回透析し、β-mercaptoethanolを除去することから始めてください。次に、1 mgのディスク1をDITE 5 94 IDEでラベル化します。1 mg/mLのタンパク質をPBSに溶解し、遊離TH基を回収するために5 mMのTCEPを添加します。DMFに溶解した色素20 µLを反応液に加え、室温で2時間インキュベートします。分子量カットオフ10,000 DaltonsのSLI透析カセットを用い、タンパク質をPBSで1:2000の比率で3回、各回2時間ずつ透析します。次いで、ラベル化されたタンパク質の純度をさらに高めます。Ni-NTAカラムを用いたHisタグベースのアフィニティー精製を行います。1 mLのNi-NTAマトリックスを10 mLのPBSで洗浄し、その後、ラベル付けして透析したタンパク質をカラムにアプライして流します。タンパク質がNTAマトリックスに結合するため、溶液の青色が徐々に薄くなります。ラベルされていない遊離色素は、フロースルーとして排出されます。タンパク質溶液をカラムに導入した後、20 millilitersのPBSでカラムを3回洗浄します。タンパク質を溶出させるために、500 millimolar imidazoleを含む2 millilitersのPBSをカラムに加えます。バルブを低速に設定し、Ni-NTAカラム上の着色バンドをモニターしながら、滴下して溶出させます。この溶出液の着色分画には、標識された組換えタンパク質が含まれています。溶出液をSLI透析カセットに移し、10 mM NAPIに対し1:2000の希釈率で、2 Lの溶液を用いて2時間ずつ3回透析します。透析後、溶出液を滅菌済みの0.45 µmシリンジフィルターでろ過し、100 µLずつ5つのサンプルに分注して、液体窒素で急凍結させます。各100 µLのアリコートに含まれる総タンパク質量は0.5〜1 µg/mLである必要があります。タンパク質の浸潤性を評価するため、受容体であるSH SY five Yヒト神経芽細胞腫細胞を播種した24ウェルプレートの各ウェルに、5〜10 µg/mLの標識リコンビナントdisc oneタンパク質を含む培地を添加します。可溶性GFPタグ付きdisc one C末端を恒常的に発現させた滅菌済みガラスカバースリップ上で、48〜72時間インキュベートします。細胞外の蛍光をクエンチし、agri zone処理細胞と同様の手法で細胞を固定および封入した後、Z-stackイメージングにより外因的に添加したリコンビナントタンパク質の浸入を確認します。ラベル化されたタンパク質が取り込まれると、共焦点顕微鏡で生成された画像において、受容細胞の周囲内で検出されます。このZ-stackは、220 nanometersの間隔で24ステップ、深さ約5 micrometersをカバーします。ここでは、赤色で示されたリコンビナントDisc1フラグメント 598-785が、緑色で示された可溶性C末端GFPタグ付きDisc1を発現しているレシピエント細胞に取り込まれ、Disc1タンパク質凝集体の浸潤性が決定されます。mRFPタグ付きフルレングスDisc1からなるアクロゾームをNLF細胞から精製し、このビデオで説明されているようにレシピエントのSH-SY5Y細胞に添加しました。mRFPタグ付きDisc1アクロゾームが、可溶性GFPタグ付きC末端Disc1を発現しているヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞に浸潤した様子がここに示されています。さらに、MRFPタグ付きのdisc one asomeは、可溶性GFPタグ付きdisc oneを不溶性凝集塊へとリクルートすることができました。DIA lightでラベルした組み換えdisc oneの浸潤性を評価するため、ここに示すように、可溶性GFP disc oneを発現させたSH SY five Y神経芽細胞腫細胞にこれを適用しました。赤色で示された組み換えdisc oneタンパク質マルチマーがレシピエント細胞に浸潤しており、黄色の点は可溶性GFPタグ付きC末端disc oneの凝集塊へのリクルートを示しています。E coliから発現・精製したラベル付き組み換えdisc oneは、多量体タンパク質をラットの内側前頭前皮質に定位的に注入した際、in vivoにおいてもニューロンに対して細胞浸潤性を示しました。Zスタック画像により、ニューロン核に対する抗体で染色されたラット皮質ニューロン内に組み換えdisc oneタンパク質が存在することが確認されました。細胞浸潤を研究するためのdisc one凝集体を生成する2つの方法について説明しました。これらのいずれの方法を用いても、外来DNAのトランスフェクションによる組換え遺伝子発現という、潜在的に交絡因子となる変数を排除して、disc one凝集体の取り込みによる細胞への影響を調査することができます。これらの手法は、in vitroでの細胞内におけるdisc oneタンパク質病理の生物学的影響の調査や、動物モデルへの脳内接種またはその他の投与によるin vivoでの調査に適用可能です。これらの手法は、各タンパク質に合わせてプロトコルをわずかに修正することで、最終的に他のタンパク質凝集体にも応用できると考えています。この手順を行う際は、共焦点顕微鏡画像の詳細な解析に十分な時間を割くようにしてください。

generation-purification-characterization-cell-invasive-disc1-protein

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

三次元細胞外マトリックスへの腫瘍細胞の浸潤のモデルより反映...

モデリングとイメージング、3次元の集団細胞浸潤

ヒト骨格筋内の血管は、再生アプリケーションに最適ですいくつかの多系列前駆体集団を保有する。内膜から筋原内皮細胞、培地から周皮細胞、および外膜から外膜細胞：この分離法は、血管の三つの構造層からそれぞれ3多能性前駆細胞集団の同時精製を可能にする。...

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

この資料は、乳癌細胞の浸潤を定量化するための3次元（3D）のアッセイの使用のための詳細な方法論を提供する。具体的には、細胞が侵入したときに発生する膜の完全性の喪失を検査するためにこのようなアッセイ、定量化、およびデータ分析だけでなく、メソッドを設定するために必要な手順を説明します。...

3次元（3D）モデルを用いた乳癌細胞浸潤の定量化

初期の脳の腫瘍微小環境を入力する免疫細胞の数および活性化状態に対する時間依存の定量的データをもたらす神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析のための簡単​​な方法は、ここに提示しました。...

神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

上皮から間葉への移行(EMT)は、癌が浸潤性になることを可能にします。EMTを調査するために、血清と酵素を欠いた神経幹細胞(NSC)ベースのinvitroモデルが記載されています。この標準化されたシステムにより、細胞遊走、遺伝子およびタンパク質発現の定量的および定性的な評価が可能になります。創薬に適したモデルです。...

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

肝臓損傷は、不均一な細胞集団を表し、前駆細胞の増殖を伴います。この細胞区画の新規分類は、複数のサブセットの区別を可能にします。ここで説明する方法は、分析し、さらなるアッセイのために使用することができる種々のサブセットの高純度分離、フローサイトメトリーを示します。...

新規の表面マーカーの組み合わせで識別離および肝前駆サブセットの濃縮

膀胱癌の浸潤を支配するプロセスは、バイオ マーカーと治療開発のための機会を表します。腫瘍の回転楕円体、タイムラプス イメージングと共焦点顕微鏡の...

侵略を勉強し、膀胱癌の治療を評価するための 3次元細胞培養システム

キイロタマホコリカビは細胞遊走、エンドサイトーシス、開発など複雑な細胞プロセスを勉強する人気モデル生物です。生物のユーティリティは、遺伝子操作の可能性に依存しています。液体培地における培養細胞の既存の制限を克服するキイロタマホコリカビの細胞を使っての方法を紹介します。...

キイロタマホコリカビの選択に基づいて細胞と細菌の成長の遺伝子工学

本稿では、サッカロマイセス・セレビシエで過剰発現したカンジダ・アルビカンスABC(ATP結合カセット)タンパク質Cdr1の特性評価のための小規模な血漿膜分離プロトコルを提示する。プロテアーゼ切開性C末端mGFPCdr1とタグの間に16残基リンカーを備えた二重タグは、Cdr1の精製および洗剤スクリーニングを容易にするように設計された。...

カンジダ・アルビカンスCdr1-mGFPHisの分析のための小スケールプラズマ膜調製

侵襲的な細胞亜集団をリアルタイムで検出して捕捉するアプローチについて説明します。実験計画では、セルの電気インピーダンスの変化を監視することによってリアルタイムセルラー解析を使用しています。浸潤性癌、免疫、内皮または間質細胞を複雑な組織に捕捉することができ、共培養の影響を評価することができる。...

共培養からの侵襲的細胞亜集団のリアルタイム検出と捕捉

学ぶDISC1タンパク質凝集体の生成・精製法。神経芽細胞を用いた2種類の細胞侵襲アッサイを比較し、タンパク質構造病のメカニズム解明に貢献する技術を紹介します。

細胞侵襲DISC1タンパク質種の生成、精製とキャラクタリゼーション

さらに動画を探す