内向き整流カリウムチャネルの小分子モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング
January 27th, 2013
内向き整流カリウム（KIR）ハイスループット化合物スクリーニングのためのチャネルの活性を測定するための定量的な蛍光アッセイを開発し、検証するための方法が提示されます。
この手順の全体的な目標は、内側の整流器カリウムチャネルの活性を調節する新しい化合物を発見することです。これは、最初にテトラサイクリン誘導性、HK2 9 3細胞をプレーティングすることにより達成され、目的のKIRチャネルを384ウェルプレートに発現させる。2番目のステップは、インフルエンザという名前の蛍光タリウムレポーター色素を細胞に2つにロードすることです。
次に、取り込まれていない色素を細胞から洗い流し、ビヒクルコントロールまたは試験化合物を含むアッセイバッファーに置き換えます。最後のステップは、タリウムフラックスを開始するために、ウェルに刺激バッファーを追加することです。最終的には、蛍光プレートリーダーを使用して、KIRチャネルを介したタリウムイオンの動きを変化させる化合物を特定します。貧しい。
この方法が手動パッチクランプ電気生理学などの既存の技術よりも優れている点は、研究者が毎日数百の実験を同時に、数千の実験を同時に実行できることです。この方法により、研究者は数千の小分子のライブラリをスクリーニングして、タリウムフラックス実験の前日に細胞を解離し、添付の原稿に記載されているように細胞懸濁液の密度を定量化します。次に、10%透析FBSプレートを含むBH培地を使用し、BDピュアコートアミンコーティング384ウェルプレートの各ウェルに目的のKIRチャネル遺伝子を安定してトランスフェクトしたBDピュアコートアミンコーティング384ウェルプレートで、翌日、サーモマルチドロップコンビまたはマルチチャネルピペッターを使用して、顕微鏡でプレートを検査し、細胞が付着し、ウェルの底部全体に均一に分布していることを確認します。
次に、ELX 4 0 5マイクロプレートウォッシャーを使用して、細胞培養培地をHBSSアッセイに交換します。ウェルあたり20マイクロリットルで緩衝します。その後、チューブを短時間遠心分離して、100マイクロリットルの無水DMSO中の2つの粉末に50マイクログラムのインフルエンザを溶解することにより、2:00 AM Dローディング溶液でインフルエンザを準備します。
次に、体積あたり20%の重量の50マイクロリットルのonic F1 27 DMSO溶液を染料に加えます。ピペッティングでやさしく混ぜます。次に、150マイクロリットルのインフルエンザを午前2時00分の1 onic F1 27〜35ミリリットルのHBSSアッセイに加え、緩衝して穏やかに混合します。
次に、すでに20マイクロリットルのHBSSアッセイが含まれている各ウェルに、20マイクロリットルの色素ローディングバッファーを追加します。バッファ。細胞に色素をロードしている間に、細胞を室温で約1時間インキュベートします。0.5グラムの重炭酸ナトリウムを50ミリリットルの5×タリウム刺激緩衝液に新たに溶解することにより、タリウム刺激プレートを準備します。
次に、細胞が午前2:00にインフルエンザをロードした後、ポリプロピレン384ウェルプレートの各ウェルに50マイクロリットルの溶液を追加します。プレートをELX 4 0 5マイクロプレートウォッシャーで洗浄します。次に、20マイクロリットルまたは40マイクロリットルのHBSSアッセイを追加します。各ウェルにバッファリングを戻すと、プレートは実験の準備が整います。
タリウムプレートとセルプレートをHema Matsu機能性薬物スクリーニングシステムまたは液体分注機能が統合された同等のキネティックイメージングプレートリーダーにロードし、flu oh fourなどのフルオレセインベースの色素に適したフィルターを使用します。その後、40マイクロリットルのHBSSアッセイバッファーを含む細胞プレートの対応するウェルに10マイクロリットルの5つのXタリウムシリーズを追加するための単一の追加プロトコルを設定します。次に、ベースライン蛍光を1ヘルツのサンプリング周波数で少なくとも10秒間記録します。
ウェルからウェルへの蛍光は、最適なセルプレーティング、洗浄、およびdローディング条件が確立されると、プレート全体で均一で安定しているはずです。その間、内蔵の384チャンネルピペッターを使用して、タリウム刺激バッファーを各ウェルに同時に追加し、少なくとも2分間記録を続けて、タリウムによる蛍光の増加の速度とピークをオフライン分析のために捕捉します。次の一連の実験では、384ウェルプレートの各列と行の他のすべてのウェルにコントロール阻害剤をプレーティングすることにより、アッセイの均一性と再現性を評価し、ビヒクルコントロールとして他のウェルにDMSOを追加します。
マルチチャンネルピペッターを使用してください。ウェルあたり80マイクロリットルおよび0.1%DMSOビヒクルで以前に決定された濃度でターゲットKIRチャネルの阻害剤を384ウェルポリプロピレンプレートにピペッティングすることにより、化合物DMSOプレートを作成します。これは、ウェルAの1つから始まり、ウェルBの2つに交互に、そしてウェルB24までというように、既知の阻害剤を添加することによって行われる。
この手順を、DMSOを井戸から開始し、B井戸から開始し、井戸A24まで繰り返します。次に、細胞、化合物、およびタリウム刺激プレートをプレートリーダーにロードします。次に、20マイクロリットルのHBSSアッセイバッファーを含む細胞プレートの対応するウェルに、20マイクロリットルの2つのX濃度化合物シリーズを添加する2つの追加プロトコルを設定します。
化合物を細胞プレートに加え、室温で最大20分間インキュベートします。ベースラインのインフルエンザを2つの蛍光で少なくとも10秒間記録します。次に、10マイクロリットルの5 x タリウムバッファーをセルプレートの各ウェルに加えます。
その後3日間実験を繰り返して、結果の再現性を確認します。DMSOおよび薬剤処理細胞のタリウムフラックスを使用して、Zプライムの値を計算します。2 つの井戸母集団間の井戸間の変動性の統計的尺度は、P と N の平均と標準偏差に基づいてこの式を使用して Z 素数を計算します (P は抑制されていないフラックス値、N は完全に抑制されたフラックス値です)。
ZPrime値が3日間で0.5以上のアッセイは、ハイスループットスクリーニングに適していると考えられています。これらの図は、さまざまなタイプの実験で使用される細胞プレーティングマップの一例です。非誘導細胞またはテトラサイクリン誘導細胞を含むウェルの位置は、異なる色で示されています。
この図は、アッセイ開発および化合物スクリーニングに最適なタリウム濃度を決定するために使用されるソースプレートマップを示しています。色のグラデーションは、100%から0.002%のタリウムの範囲の3倍希釈シリーズを表しており、これは、タリウムフラックス値が低いものから高いものまでを示す、寒色から熱色までの代表的な蛍光強度マップです。ここに示されているセルプレーティングマップは、タリウムCRCに4つのパラメータロジスティック関数を当てはめて、15%タリウムのEEC 80値を決定するために使用されます。
この図は、アッセイのDMSO耐性を決定するために使用されるソースプレートマップを示しています。カラム 1 と 24 にはアッセイバッファーのみが含まれていますが、カラーグラデーションは 10% から 0.01% DMSO の範囲の 2 倍希釈シリーズを示しており、これは代表的な蛍光強度マップで、タリウムフラックス値が低いことを濃い青で示しています。ここには、示された濃度のDMSOを含むウェルから記録された平均タリウムフラックス値をまとめています。
現在、この図は、KIRチャネルの既知の阻害剤の濃度応答曲線を確立するために使用されるソースプレートマップを示しています。各化合物は異なる色で示され、通常は3倍希釈シリーズとしてめっきされます。代表的な蛍光強度マップをここに示し、この図は、その開発と最適化後のタリウムフラックスby-in阻害剤の用量依存的な阻害を示しています。
タリウムフラックスアッセイは、さまざまな日常的な薬理学的アッセイにも使用できます。タリウムフラックスアッセイは、これまで、電圧およびライゲーションされたカリウムチャネル、非選択的陽イオンチャネル、さらにはカリウムトランスポーターでの使用に適応されていました。テリウムでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、手袋の使用や適切な廃棄物処理などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
この記事では、内向き整流カリウム（Kir）チャネルの活性を測定するための定量的蛍光アッセイの開発と検証方法を提示しています。この手順は、高スループットスクリーニングを通じてKirチャネル活性を調整する新しい化合物を発見することを目的としています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 薬理学
背景
- 内向き整流カリウムチャネル（Kir）は細胞の興奮性に重要な役割を果たします。
- Kirチャネルの調整を理解することで、新しい治療戦略につながる可能性があります。
- 蛍光アッセイは化合物をスクリーニングするための高スループット方法を提供します。
- タリウムフラックスはKirチャネル活性の信頼できる指標です。
研究の目的
- Kirチャネル活性のための定量的アッセイを開発すること。
- 潜在的な調整因子の高スループットスクリーニングを促進すること。
- Kirチャネルを通じたタリウムイオンの移動を変える化合物を特定すること。
使用された方法
- テトラサイクリン誘導性HK293細胞を384ウェルプレートにプラーティングすること。
- 細胞に蛍光タリウムレポーター染料をロードすること。
- 未結合の染料を洗い流し、コントロールまたは試験化合物を含むアッセイバッファーで置き換えること。
- 刺激バッファーを加えタリウムフラックスを開始し、プレートリーダーで蛍光を測定すること。
主な結果
- タリウムイオンの移動を著しく変える化合物の特定。
- 高スループットスクリーニングのためのアッセイの有効性の検証。
- アッセイの再現性と信頼性の実証。
- 新しいKirチャネル調整因子を発見する可能性。
結論
- 開発されたアッセイはKirチャネル調整因子のスクリーニングに有用なツールです。
- 新しい治療化合物の発見に役立つ可能性があります。
- 将来の研究では、特定された化合物のさらなる検証に拡張する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Developing robust assays for ion channel targets remains a bottleneck in early drug discovery, particularly for inward rectifier potassium channels where pharmacological tools are limited. This fluorescence-based thallium flux assay enables scalable, quantitative screening of small-molecule libraries to identify modulators with therapeutic potential. By supporting hit identification and lead optimization workflows, the method addresses a critical gap in target validation for cardiovascular, neurological, and pain indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Kir channel function through dose-dependent fluorescence readouts that correlate with ion flux activity.
- Operational Value: Supports screening of thousands of compounds daily, accelerating target hypothesis testing compared to low-throughput electrophysiology.
- Predictive Value: Generates quantitative data suitable for Z-prime calculation, ensuring assay reliability for go/no-go decisions in probe discovery campaigns.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses commercially available FluoZin-2 dye to detect transmembrane thallium flux, providing a standardized fluorescence signal for compound screening.
- Reproducibility: Requires consistent Z-prime values ≥0.5 across multiple days, establishing robustness for industrial-scale screening centers.
- Scalability: Compatible with 384-well plate formats and automated liquid handling, enabling integration into high-throughput screening pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Target Relevance: Directly supports investigation of Kir channels implicated in hypertension, atrial fibrillation, and pain, aligning with disease-modulating hypotheses.
- Lead Identification: Facilitates discovery of small-molecule modulators that can be optimized for selectivity and drug-like properties.
- Mechanistic De-risking: Provides functional validation of compound effects on channel activity, reducing ambiguity in downstream preclinical profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling progression from primary screening to hit confirmation and structure-activity relationship studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening of compound libraries to identify activators or inhibitors of Kir channel function.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible fluorescence readouts suitable for primary hit selection in 384-well formats.
- Analytics: Enables calculation of EC80 values and inhibition curves from concentration-response data, supporting potency and efficacy comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing validated chemical probes for target engagement studies in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to most potassium channel targets due to thallium permeability, promoting cross-project assay standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct functional readouts of channel modulation, improving target confidence.
- Operational Value: Standardizes assay execution across teams through defined protocols for cell loading, compound treatment, and flux measurement.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling rapid evaluation of large compound libraries, reducing reliance on low-throughput methods.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of Kir-targeted programs through reliable hit confirmation and reproducibility metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescent dye handling, and kinetic plate reader operation for accurate flux measurements.
- Dependent on access to fluorescence plate readers with injectors and appropriate filter sets for FluoZin-2 or analogous dyes.
- Necessitates standardization of cell plating density, washing steps, and dye loading times to ensure well-to-well uniformity.
- Involves safety considerations due to thallium toxicity, requiring proper PPE, waste disposal, and containment procedures.
- Assay performance must be validated using known inhibitors to establish inhibition curves and Z-prime thresholds before large-scale screening.
