内向き整流カリウムチャネルの小分子モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

この手順の全体的な目標は、内側の整流器カリウムチャネルの活性を調節する新しい化合物を発見することです。これは、最初にテトラサイクリン誘導性、HK2 9 3細胞をプレーティングすることにより達成され、目的のKIRチャネルを384ウェルプレートに発現させる。2番目のステップは、インフルエンザという名前の蛍光タリウムレポーター色素を細胞に2つにロードすることです。

次に、取り込まれていない色素を細胞から洗い流し、ビヒクルコントロールまたは試験化合物を含むアッセイバッファーに置き換えます。最後のステップは、タリウムフラックスを開始するために、ウェルに刺激バッファーを追加することです。最終的には、蛍光プレートリーダーを使用して、KIRチャネルを介したタリウムイオンの動きを変化させる化合物を特定します。貧しい。

この方法が手動パッチクランプ電気生理学などの既存の技術よりも優れている点は、研究者が毎日数百の実験を同時に、数千の実験を同時に実行できることです。この方法により、研究者は数千の小分子のライブラリをスクリーニングして、タリウムフラックス実験の前日に細胞を解離し、添付の原稿に記載されているように細胞懸濁液の密度を定量化します。次に、10%透析FBSプレートを含むBH培地を使用し、BDピュアコートアミンコーティング384ウェルプレートの各ウェルに目的のKIRチャネル遺伝子を安定してトランスフェクトしたBDピュアコートアミンコーティング384ウェルプレートで、翌日、サーモマルチドロップコンビまたはマルチチャネルピペッターを使用して、顕微鏡でプレートを検査し、細胞が付着し、ウェルの底部全体に均一に分布していることを確認します。

次に、ELX 4 0 5マイクロプレートウォッシャーを使用して、細胞培養培地をHBSSアッセイに交換します。ウェルあたり20マイクロリットルで緩衝します。その後、チューブを短時間遠心分離して、100マイクロリットルの無水DMSO中の2つの粉末に50マイクログラムのインフルエンザを溶解することにより、2:00 AM Dローディング溶液でインフルエンザを準備します。

次に、体積あたり20%の重量の50マイクロリットルのonic F1 27 DMSO溶液を染料に加えます。ピペッティングでやさしく混ぜます。次に、150マイクロリットルのインフルエンザを午前2時00分の1 onic F1 27〜35ミリリットルのHBSSアッセイに加え、緩衝して穏やかに混合します。

次に、すでに20マイクロリットルのHBSSアッセイが含まれている各ウェルに、20マイクロリットルの色素ローディングバッファーを追加します。バッファ。細胞に色素をロードしている間に、細胞を室温で約1時間インキュベートします。0.5グラムの重炭酸ナトリウムを50ミリリットルの5×タリウム刺激緩衝液に新たに溶解することにより、タリウム刺激プレートを準備します。

次に、細胞が午前2:00にインフルエンザをロードした後、ポリプロピレン384ウェルプレートの各ウェルに50マイクロリットルの溶液を追加します。プレートをELX 4 0 5マイクロプレートウォッシャーで洗浄します。次に、20マイクロリットルまたは40マイクロリットルのHBSSアッセイを追加します。各ウェルにバッファリングを戻すと、プレートは実験の準備が整います。

タリウムプレートとセルプレートをHema Matsu機能性薬物スクリーニングシステムまたは液体分注機能が統合された同等のキネティックイメージングプレートリーダーにロードし、flu oh fourなどのフルオレセインベースの色素に適したフィルターを使用します。その後、40マイクロリットルのHBSSアッセイバッファーを含む細胞プレートの対応するウェルに10マイクロリットルの5つのXタリウムシリーズを追加するための単一の追加プロトコルを設定します。次に、ベースライン蛍光を1ヘルツのサンプリング周波数で少なくとも10秒間記録します。

ウェルからウェルへの蛍光は、最適なセルプレーティング、洗浄、およびdローディング条件が確立されると、プレート全体で均一で安定しているはずです。その間、内蔵の384チャンネルピペッターを使用して、タリウム刺激バッファーを各ウェルに同時に追加し、少なくとも2分間記録を続けて、タリウムによる蛍光の増加の速度とピークをオフライン分析のために捕捉します。次の一連の実験では、384ウェルプレートの各列と行の他のすべてのウェルにコントロール阻害剤をプレーティングすることにより、アッセイの均一性と再現性を評価し、ビヒクルコントロールとして他のウェルにDMSOを追加します。

マルチチャンネルピペッターを使用してください。ウェルあたり80マイクロリットルおよび0.1%DMSOビヒクルで以前に決定された濃度でターゲットKIRチャネルの阻害剤を384ウェルポリプロピレンプレートにピペッティングすることにより、化合物DMSOプレートを作成します。これは、ウェルAの1つから始まり、ウェルBの2つに交互に、そしてウェルB24までというように、既知の阻害剤を添加することによって行われる。

この手順を、DMSOを井戸から開始し、B井戸から開始し、井戸A24まで繰り返します。次に、細胞、化合物、およびタリウム刺激プレートをプレートリーダーにロードします。次に、20マイクロリットルのHBSSアッセイバッファーを含む細胞プレートの対応するウェルに、20マイクロリットルの2つのX濃度化合物シリーズを添加する2つの追加プロトコルを設定します。

化合物を細胞プレートに加え、室温で最大20分間インキュベートします。ベースラインのインフルエンザを2つの蛍光で少なくとも10秒間記録します。次に、10マイクロリットルの5 x タリウムバッファーをセルプレートの各ウェルに加えます。

その後3日間実験を繰り返して、結果の再現性を確認します。DMSOおよび薬剤処理細胞のタリウムフラックスを使用して、Zプライムの値を計算します。2 つの井戸母集団間の井戸間の変動性の統計的尺度は、P と N の平均と標準偏差に基づいてこの式を使用して Z 素数を計算します (P は抑制されていないフラックス値、N は完全に抑制されたフラックス値です)。

ZPrime値が3日間で0.5以上のアッセイは、ハイスループットスクリーニングに適していると考えられています。これらの図は、さまざまなタイプの実験で使用される細胞プレーティングマップの一例です。非誘導細胞またはテトラサイクリン誘導細胞を含むウェルの位置は、異なる色で示されています。

この図は、アッセイ開発および化合物スクリーニングに最適なタリウム濃度を決定するために使用されるソースプレートマップを示しています。色のグラデーションは、100%から0.002%のタリウムの範囲の3倍希釈シリーズを表しており、これは、タリウムフラックス値が低いものから高いものまでを示す、寒色から熱色までの代表的な蛍光強度マップです。ここに示されているセルプレーティングマップは、タリウムCRCに4つのパラメータロジスティック関数を当てはめて、15%タリウムのEEC 80値を決定するために使用されます。

この図は、アッセイのDMSO耐性を決定するために使用されるソースプレートマップを示しています。カラム 1 と 24 にはアッセイバッファーのみが含まれていますが、カラーグラデーションは 10% から 0.01% DMSO の範囲の 2 倍希釈シリーズを示しており、これは代表的な蛍光強度マップで、タリウムフラックス値が低いことを濃い青で示しています。ここには、示された濃度のDMSOを含むウェルから記録された平均タリウムフラックス値をまとめています。

現在、この図は、KIRチャネルの既知の阻害剤の濃度応答曲線を確立するために使用されるソースプレートマップを示しています。各化合物は異なる色で示され、通常は3倍希釈シリーズとしてめっきされます。代表的な蛍光強度マップをここに示し、この図は、その開発と最適化後のタリウムフラックスby-in阻害剤の用量依存的な阻害を示しています。

タリウムフラックスアッセイは、さまざまな日常的な薬理学的アッセイにも使用できます。タリウムフラックスアッセイは、これまで、電圧およびライゲーションされたカリウムチャネル、非選択的陽イオンチャネル、さらにはカリウムトランスポーターでの使用に適応されていました。テリウムでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、手袋の使用や適切な廃棄物処理などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。