Name: 内向き整流カリウムチャネルの小分子モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶ内向き整流カリウムチャネル（Kir）の活性を蛍光タリウムアッセイで定量化するハイスループットスクリーニング法。HK293細胞を用いて新規モジュレーター化合物を探索し、創薬研究に貢献します。

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この作品は、国立保健研究所（NIH）の助成金の1R21NS073097-01と1R01DK082884（JSD）と国立衛生研究所の助成金PIER11VCTRための財団からの資金によって支えられている。

<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
<li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213(2007).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

データ処理：いったんデータが収集され、分析の一般的なステップは、実験の最初にF 0を初期値に各ウェルの蛍光応答、Fを、正規化が含まれます。これは、一般的に&quot;静的比&quot;と呼ばれ、 &quot;F / F 0&quot;に象徴される。F0を指示薬色素によって支配されている例では静的比率演算が実質的に、このような照明、信号コレクション内disuniformitiesなどの多くの要因のために修正されますおよび細胞数。背景が適切に静的比率を計算する前に対処することができない限り、染料信号が弱い、またはシステム内のバックグラウンド蛍光や反射が高い例では、静的比は有効になりません。データの正規化した後、活動を定量化し、ヒット曲を選ぶために使用される単一の値に蛍光波形を低減するために典型的である。最も一般的に、これはデータを当てはめることによって行われますTlの添加後10秒でポイント+誘発蛍光増加の初期勾配を得るために。ヒットピッキングについては、一般的なアプローチは、試験集団における化合物...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

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Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td>インビトロジェン</td><td> V1033-20 </td><td>テトラサイクリン誘導発現ベクター</td></tr><tr><td> T-REX-HEK293細胞</td><td>インビトロジェン</td><td> R71007 </td><td>テトラサイクリン誘導性細胞株</td></tr><tr><td>リポフェクタミンLTX /プラス試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> 15338100 </td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTAバイオ</td><td> S11550 </td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11965 </td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB </td><td>インビトロジェン</td><td> 10687-010 </td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ブラストサイジンS </td><td>インビトロジェン</td&gt; <td> R210-01 </td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140 </td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>フリーHBSS - 二価</td><td>メディアテック</td><td> 21022CV </td><td>細胞洗浄</td></tr><tr><td>トリプシン0.25パーセント</td><td>メディアテック</td><td> 25053CI </td><td>細胞解離</td></tr><tr><td>テトラサイクリン塩酸</td><td>シグマ</td><td> T9823 </td><td>誘導試薬</td></tr><tr><td>透析FBS </td><td> ATLANTAバイオ</td><td> S12650 </td><td>プレート培地</td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td>インビトロジェン</td><td> F24189 </td><td>蛍光染料</td></tr><tr><td>プルロニックF-127 </td><td>インビトロジェン</td><td> P-3000MP </td><td>色素ローディング</td></tr><tr><td> HBSS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14175 </td><td>アッセイバッファー</td></tr><tr><td> HEPES </td><td>インビトロジェン</td><td> 15630 </td><td>アッセイバッファー</td></tr><tr><td> NaHCO 3を </td><td>シグマ</td><td> S6297 </td><td> TL +刺激バッファー</td></tr><tr><td> MgSO 4を </td><td>シグマ</td><td> M2643 </td><td> TL +刺激バッファー</td></tr><tr><td> •のCaSO 4·2H 2 O </td><td>シグマ</td><td> C3771 </td><td> TL +刺激バッファー</td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td>シグマ</td><td> G7528 </td><td> TL +刺激バッファー</td></tr><tr><td>硫酸タリウム</td><td>アルドリッチ</td><td> 204625 </td><td> TL +刺激バッファー</td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H4034 </td><td> TL +刺激バッファー</td></tr><tr><td> DMSO </td><td>シグマ</td><td> D4540 </td><td>溶剤</td></tr><tr><td> 8チャネルの電子ピペッター</td><td>バイオヒット</td><td> E300 </td><td> 384内のセルメッキ -ウェルプレート</td></tr><tr><td> BD PureCoatアミンコーティングした384ウェルプレート</td><td> BD Biosciences社</td><td> 356719 </td><td>アッセイマイクロプレート</td></tr><tr><td>エコーは、384ウェルマイクロプレートポリプロピレン（384PP）を認定</td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td>化合物源マイクロプレート</td></tr><tr><td> 384ウェルマイクロプレートポリプロピレン</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td>マルチドロップコンビ試薬ディスペンサー</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405マイクロプレートウォッシャー</td><td> BioTekの</td><td> ELx405HT </td><td>自動細胞洗浄</td></tr><tr><td>液体ハンドラをエコー</td><td> Labcyte </td><td> Labcyteエコー550 </td><td></td></tr><tr><td>ブラボー自動リキッドハンドリングプラットフォーム</td><td>アジレント·テクノロジー</td><td>標準モデル</td><td></td></tr><tr><td> Hamama津FDSS 6000 </td><td>浜松市</td><td></td><td>キネティック·イメージングプレートリーダー</td></tr></tbody></table> 表1。材料および試薬のリスト。

内向き整流カリウムチャネルの小分子モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

内向き整流カリウム（KIR）チャネルファミリーの特定のメンバーは、高血圧、心房細動、疼痛1,2を含む様々な疾患のために創薬ターゲットを想定しています。しかし、ほとんどの場合、それらの治療法としての可能性、あるいは基本的な生理機能を理解するための進捗状況は良い薬理学的ツールの不足により減速されています。確かに、内向き整流ファミリーの分子薬理学は、ナノモル親和性のための番号電位依存性カリウム（KV）チャネルのS4スーパーファミリーのそれより大幅に遅れていると選択性の高いペプチド毒素変調器は3が発見されました。ハチ毒毒素tertiapin及びその誘導体は、Kir1.1とKir3チャネル4,5の強力な阻害剤であるが、ペプチドは実験だけでなく、治療的に使用が制限され、その抗原特性と貧しい生物学的利用能、代謝安定性、組織浸透度に起因しています。強力の開発改良された薬理学的特性を有する選択的低分子プローブは、完全にキールチャネルの生理機能と治療の可能性を理解するための鍵となるでしょう。 学術、科学者がより良い薬理6必要としている分子標的とするシグナル伝達経路のためのプローブディスカバリキャンペーンを開始するために、米国立衛生研究所によってサポートされて分子ライブラリプローブプロダクションセンターネットワーク（MLPCN）は、衛生研究所（NIH）の共通基金の機会を作成しています。 MLPCNは、業界規模スクリーニングセンターや医薬品化学研究者にアクセスを提供し、インフォマティクス、遺伝子や遺伝子ネットワークの機能を解明する小分子プローブを開発するためにサポートしています。 MLPCNにエントリを得るための重要なステップは、ハイスループットスクリーニング（HTS）に適している堅牢なターゲットまたは経路特異的アッセイの開発である。 ここでは、蛍光ベースのタリウム（Tl +）フラックスASSAを開発する方法について説明しハイスループット化合物スクリーニングのための7,8,9,10キールチャネル機能のy。アッセイは、Kの透過性K +同族TLにチャンネル孔+に基づいています。市販の蛍光TL +レポーター色素が細孔を通過Tlの貫通フラックス+を検出するために使用されます。 BTC、FluoZin-2、7,8 FluxOR：TL +フラックスアッセイに適している少なくとも3市販の染料があります。このプロトコルはFluoZin-2を用いたアッセイの開発について説明します。もともと亜鉛指標として開発·販売していますが、FluoZin-2展示Tlの時に蛍光発光+結合で堅牢かつ用量依存的に増加。 FluxORは7,8使用可能だったので9,10を行うために続けている前に、我々はFluoZin-2で働き始めた。しかし、彼らの特定のnに最も適した染料アッセイ開発の手順は、すべての3つの色素について本質的に同一であるため、ユーザーは判断する必要がありますeeds。またMLPCNへのエントリーのために考慮されることで合意されている必要がありアッセイの性能ベンチマークを議論する。 TL +は容易にほとんどのK +チャネルに浸透しているので、このアッセイは、ほとんどのK +チャネルターゲットに適応する必要があります。

テトラサイクリン誘導発現系の使用が特徴的な内因性経路を介してTL +フラックスと関心のあるキールチャネルのための便利な内部統制を提供しています。 図1は、実験の種類で使用されるセルメッキマップの例をいくつか示します。非誘導またはテトラサイクリン誘導細胞を含むウェルの位置が異なる色で示されています。 図2Aは、アッセイ開発と化合物スクリーニングのための最適なTL +濃度を決定するために使用されるソースプレート·マップを示します。色のグラデーションは100％から0.002パーセントTL +に至るまで3倍希釈系列を表します。代表的な蛍光強度マップはそれぞれ、ローからハイへのTL +フラックス値を示すクール·トゥ·ホット色で、 図2Bに示されている。 図1Cに示すように細胞播種マップは、この実験のために使用された。 tに4パラメータロジスティック関数のフィット彼TL + CRC（ 図2C...

内向き整流カリウム（KIR）ハイスループット化合物スクリーニングのためのチャネルの活性を測定するための定量的な蛍光アッセイを開発し、検証するための方法が提示されます。

内向き正流カリウム（Kir）チャネルファミリーの特定のメンバーは、高血圧を含むさまざまな疾患の薬物標的になると想定されています。

この手順の全体的な目的は、内向き整流カリウムチャネルの活性を調節する新規化合物を探索することです。まず、目的のKIRチャネルを発現するテトラサイクリン誘導性HEK 293細胞を384ウェルプレートに播種します。次に、FluoIn-T2という蛍光タリウムレポーター色素を細胞に導入します。次に、細胞から未結合の色素を洗浄し、ビークルコントロールまたは試験化合物を含むアッセイバッファーに置換します。最終ステップとして、ウェルに刺激バッファーを添加し、タリウムフラックスを開始させます。最終的に、蛍光プレートリーダーを用いて、KIRチャネルを介したタリウムイオンの移動を変化させる化合物を同定します。Poor.手動パッチクランプ電生理学などの既存の技術に対する本手法の主な利点は、研究者が数百件の実験を同時に、そして1日に数千件の実験を行うことができる点にあります。本手法を用いることで、研究者は数千種類の低分子化合物ライブラリをスクリーニングし、内向き整流性カリウムチャネルのモジュレーターを探索することが可能です。タリウムフラックス実験の前日に、付属の原稿に記載されている通りに細胞を分散させ、細胞懸濁液の密度を定量します。次に、10%透析FBSを含むBH培地を用い、KIRチャネル遺伝子を安定的に転換させたモノクローナル細胞 20,000個を、Thermo MultiDrop Combiまたはマルチチャンネルピペッターを使用して、BD PureCoat Aminコーティング384ウェルプレートの各ウェルに播種します。翌日、顕微鏡下でプレートを確認し、細胞が接着し、ウェルの底面に均一に分布していることを確認してください。次に、ELX 405マイクロプレートウォッシャーを用いて、細胞培養培地を1ウェルあたり20 µLのHBSSアッセイバッファーに置換します。その後、チューブを短時間遠心して50 µgのflus in twoパウダーを100 µLの無水DMSOに溶解させ、2:00 AM Dローディング溶液中のflusを調製します。次に、20% w/v の onic F1 27 DMSO 溶液 50 µL を色素に加えます。ピペッティングにより緩やかに混合します。その後、onic F1 27 2:00 AM の flus 150 µL を 35 mL の HBSS アッセイバッファーに加え、緩やかに混合します。次に、20 µLのHBSS assay.Bufferが既に分注されている各ウェルに、20 µLの染料ローディングバッファーを加えます。細胞に染料をロードさせるため、室温で約1時間インキュベートします。50 mLの5x thallium stimulus bufferに0.5 gの炭酸水素ナトリウムを新たに溶解させ、タリウム刺激プレートを準備します。次に、ポリプロピレン製384ウェルプレートの各ウェルに、溶液を50 µLずつ加えます。細胞にフルオレセインをロードした後、ELX 405マイクロプレートウォッシャーでプレートを洗浄します。続いて、各ウェルに20 µLまたは40 µLのHBSSアッセイバッファーを加えれば、実験の準備は完了です。タリウムプレートおよび細胞プレートを、液体分注機能を備えたHema Matsu機能的薬剤スクリーニングシステムまたは同等のキネティックイメージングプレートリーダーにロードし、Fluo-4などのフルオレセイン系色素に適したフィルターを使用します。その後、40 µLのHBSSアッセイバッファーを含む細胞プレートの対応するウェルに、5Xタリウムシリーズを10 µL添加するシングルアドプロトコルを設定します。次に、サンプリング周波数1 Hzで、少なくとも10秒間ベースライン蛍光を記録します。最適な細胞播種、洗浄、およびローディング条件が確立されれば、プレート全体のウェル間の蛍光は均一かつ安定する必要があります。その間に、組み込みの384チャンネルピペッターを使用して、各ウェルにタリウム刺激バッファーを同時に添加し、タリウム誘起による蛍光増加の速度とピークをオフライン解析で捉えられるよう、少なくとも2分間記録を継続します。次の一連の実験では、384ウェルプレートの各列および各行の1つおきのウェルにコントロール阻害剤を播種し、その他のウェルにはビークルコントロールとしてDMSOを添加することで、アッセイの均一性と再現性を評価します。マルチチャンネルピペットを使用します。あらかじめ決定した濃度の標的KIRチャネル阻害剤および0.1% DMSO溶媒を、1ウェルあたり80 µLずつ384ウェルポリプロピレンプレートに分注し、化合物DMSOプレートを作成します。これは、既知の阻害剤をウェルA1から順に、B2へと交互に、B24まで加えて行うことで実施します。この手順を、B1ウェルからA24ウェルまで、DMSOを用いて順次繰り返します。次に、細胞プレート、化合物プレート、およびタリウム刺激プレートをプレートリーダーにセットします。その後、HBSSアッセイバッファー 20 µLを含む細胞プレートの対応するウェルに、2倍濃度の化合物シリーズを 20 µL添加するための2回添加プロトコルを設定します。化合物をセルプレートに加え、室温で最大20分間インキュベートします。2つの蛍光波長でベースラインの蛍光を少なくとも10秒間記録します。その後、セルプレートの各ウェルに5倍濃度のタリウムバッファーを10 µL加えます。結果の再現性を確認するため、3日連続で実験を繰り返します。DMSOを加えたタリウムフラックスおよび薬剤処理した細胞を用いて、Zプライム値を算出します。2つのウェル群間のウェル間変動の統計的指標であるZプライムは、P（非抑制フラックス値）とN（完全抑制フラックス値）の平均値と標準偏差に基づき、以下の式を用いて算出します。3日連続でZPrime値が0.5以上となったアッセイは、ハイスループットスクリーニングに適していると考えられます。これらの図は、異なる種類の実験で使用されるセルプレーティングマップの例です。未誘導細胞またはテトラサイクリン誘導細胞を含むウェルの位置が、それぞれ異なる色で示されています。この図は、アッセイの開発および化合物スクリーニングにおいて最適なタリウム濃度を決定するために使用したソースプレートマップを示しています。カラーグラデーションは100%から0.002%までのタリウムの3倍希釈系列を表しており、ここでは寒色から暖色で示された代表的な蛍光強度マップにより、タリウムフラックス値の低から高への変化を示しています。ここに示されている細胞播種マップとタリウムCRCへの4パラメータロジスティック関数のフィッティングにより、EEC 80値をタリウム15%と決定しています。この図は、アッセイのDMSO耐性を決定するために使用したソースプレートマップを示しています。1列目と24列目はアッセイバッファーのみを含み、カラーグラデーションは10%から0.01% DMSOまでの2倍希釈系列を示しています。また、ここでは代表的な蛍光強度マップを示しており、タリウムフラックス値が低いウェルほど濃い青色で表示されています。指定した濃度のDMSOを含むウェルから記録された平均タリウムフラックス値をここにまとめます。この図は、KIRチャネルの既知の阻害剤について濃度反応曲線を確立するために使用したソースプレートマップを示しています。各化合物は異なる色で表示されており、通常は3倍希釈系列としてプレートに分注されます。ここでは代表的な蛍光強度マップを示しており、この図は、開発および最適化後の阻害剤によるタリウムフラックスの用量依存的な抑制を示しています。タリウムフラックスアッセイは、さまざまなルーチンの薬理学的アッセイにも利用可能です。タリウムフラックスアッセイは、電位依存性およびリガンド依存性カリウムチャネル、非選択的陽イオンチャネル、さらにはカリウム輸送体への適用にこれまで適応されてきました。タリウムの取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は、手袋の着用や適切な廃棄物処理などの予防措置を常に講じてください。

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Research

JoVE Journal

Biology

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内向き整流カリウムチャネルの小分子モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

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