CRISPR / CASシステムの酵素のための基質の生成

以下の実験の全体的な目的は、細菌および古細菌に見られるcrispr Cass免疫系において極めて重要な役割を果たすCasエンドヌクレアーゼの研究に用いるRNA基質を作製することです。好みの場合は、特定のCRISPR領域をPCR増幅させることで、in vitroでのRNA合成用の長いDNAテンプレートを得ることができます。

2本のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることで、基質RNA製造用の短いテンプレートを生成できます。あるいは、カスタム合成された短いリピート配列を用いて、CASエンドヌクレアーゼアッセイで検討することも可能です。最終的に、RNA転写物の産生およびそれに続くCAS6エンドヌクレアーゼによる切断は、オートラジオグラフィーによって可視化できます。

本プレゼンテーションの手法の主な目的は、さまざまな長さのRNA基質を用いて、研究者がCRISPR RNAプロセシングを研究できるようにすることです。そのため、単一のリピート要素のような小型RNAや、複数のスペーサーにわたる転写産物のようなより大きなRNAなど、小型RNAを生成するために異なる手法が利用されます。これらの手法は特にCRISPR RNAの成熟に関する知見を提供するものですが、同様のテンプレート調製戦略は他のRNAプロセシングシステムにも採用可能です。本手順のデモンストレーションは、細菌および古細菌のCRISPR免疫システムの研究室に所属する大学院生とポストドクターが担当します。

適応と呼ばれるプロセスにおいて、プロトスペーサーと呼ばれるウイルスDNA配列が、成長中のCRISPRクラスター内にある2つのリピート要素の間に挿入されます。次に、CRISPRクラスター全体が転写され、Casエンドヌクレアーゼ（例えばCas6など）によって小さなCRISPR RNAへとプロセシングされます。これらの小さなCRISPR RNAはその後、CASタンパク質複合体であるCascadeに取り込まれ、CRISPR RNAとプロトスペーサーの間の塩基相補性をウイルスDNA分解のシグナルとして利用することで、繰り返されるウイルスの攻撃に対する宿主防御を媒介し、長いpre-CRISPR RNA基質を生成します。

まず、フォワードプライマーにT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を付加することで、CRISPRクラスターのスペーサー領域を標的とするPCRプライマーを設計します。次に、PCR産物をベクターにクローニングするため、両方のプライマーに制限酵素部位を付加します。ゲノムDNAから目的のpre-CRISPR RNA配列をPCRで増幅した後、T7 RNAポリメラーゼが転写を適切に開始するにはG残基が必要であることに注意してください。

PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、目的のバンドをゲル抽出します。次に、PCR産物を制限酵素で消化し、粘着末端を形成させます。続いて、PCR精製キットを用いてPCR産物を精製し、切断副産物を除去した後、T4 DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼバッファー、および対応する粘着末端を持つpUC vectorと切断済みPCR産物を3:1のモル比で加えます。ライゲーション反応液を16 °Cで一晩インキュベートし、その後、標準的なプロトコルに従ってコンピテントE. coli DH5α細胞に混合物を形質転換し、ブルーホワイトスクリーニングを用いてライゲーションの成功を確認します。

最後に、プラスミド調製キットを用いて白色コロニーからプラスミドを単離し、プラスミドシーケンシングによってポジティブクローンを同定して、中間サイズのpre CRISPR RNA基質を生成します。まず、ここに示す配列と同様の、目的のCRISPRリピートスペーサー配列を持つフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドを設計します。なお、これらのオリゴヌクレオチドには、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの配列と、粘着末端が形成されるようにオリゴヌクレオチドの末端に制限酵素部位が含まれていることに注意してください。

サンプルをT4ポリヌクレオチドキナーゼおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼバッファーとともに37°Cで1時間インキュベートし、各オリゴヌクレオチドの5'末端をリン酸化します。次に、リン酸化されたフォワードおよびリバースのオリゴヌクレオチドを、T4 DNAリガーゼバッファーとともに加熱ブロックを用いて95°Cで5分間インキュベートします。サンプルがハイブリダイズした後、熱源を切って混合物を約2〜3時間放置し、室温まで冷却させます。

次に、ハイブリダイゼーションミックスで処理し、脱リン酸化したP vector Tと、準備したオリゴヌクレオチドを、T4 DNA Ligase bufferおよびT4 DNAリガーゼを用いて16 °Cで一晩ライゲーションします。その後、標準的なプロトコルに従い、ライゲーションされたプラスミドをコンピテントセルであるE. coli DH5αに形質転換し、ブルーホワイトスクリーニングを用いてライゲーションの成功を確認します。最後に、プラスミドを単離し、制限酵素消化およびそれに続くプラスミドシーケンシングによって陽性クローンを特定します。

短鎖のシングルリピートcas RNA基質配列は、ここに示したものと同様に設計できます。必ずデオキシリボヌクレオチドを組み込んでください。RNA切断部位を決定する必要がある場合は、カスタム合成受託施設を利用してRNAオリゴヌクレオチドを合成させることができます。

選択したカスタム基質を用いてプラスミドを単離した後、プラスミド精製用マキシプレップキットを使用し、クローン挿入断片の下流を切断する制限酵素でプラスミドを線状化させます。次に、完全に消化されたことを確認し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により線状化プラスミドを精製します。ペレットをDEPC処理済みの滅菌水に懸濁させ、核酸を回収します。

次に、ATP、CTP、GTP、およびUTPを含む、調製したばかりのin vitro T7 RNAポリメラーゼランオフ転写混合液中で、消化後のプラスミドを37 °Cで3時間インキュベートします。最後に、得られたRNA転写物を、変性8 M尿素、12%ポリアクリルアミドゲルで分析します。また、Mono Q陰イオン交換クロマトグラフィーで転写物を精製し、その後、RNA分画をエタノール沈殿させ、ペレットをDEPC処理済みの滅菌水で再懸濁して転写物を回収し、エンドヌクレアーゼアッセイによって設計基質を分析することも可能です。まずオートラジオグラフィーにより基質バンドを可視化し、変性8 M尿素ゲルからゲル抽出によって反応生成物を精製します。

12%ポリアクリルアミドゲルを作製し、次に、Clostridium thermo cell由来のCas6タンパク質で示されているように、熱沈殿およびニッケルNTAクロマトグラフィーを用いて、目的の組換えCasタンパク質を調製および精製します。その後、Casタンパク質を調製したばかりのエンドヌクレアーゼ反応混合液と合わせ、37 °Cで30分間静置してエンドヌクレアーゼアッセイ反応を進行させます。最後に、反応混合液の5 µLを8 M尿素ゲルにロードします。

12%ポリアクリルアミドゲルを用い、電気泳動後にオートラジオグラフィーで切断産物を可視化します。ここでは、カスタム設計したRNAオリゴヌクレオチドおよび2種類のin vitro RNA転写物のCoomassie Brilliant Blue（Coomassie Blue）染色ポリアクリルアミドゲルを示しています。RNAの合成効率は、短鎖、長鎖、および中間の長さのコンストラクト間で異なることに注意してください。

RNAエンドヌクレアーゼ活性の調査には、陽性および陰性コントロールに加え、高度に精製されたリコンビナントCasタンパク質が必要です。この図は、Clostridium thermocellum由来のCas6サンプル調製物のSDS-PAGEゲルを示しています。

熱沈殿およびNi-NTAクロマトグラフィー後の結果を、標準タンパク質マーカーと共に示します。適切なネガティブコントロールサンプルには、CAS sixを発現していない細胞溶解液を含めるべきですが、同一のCAS six精製手順に従った結果、得られたCAS six調製物は必要とされる高い純度を有していることが確認されました。ここでは、co Clostridium thermo cell CAS sixタンパク質による、5'末端標識リピート配列基質の切断をオートラジオグラフィーで可視化できます。

各レーンには、放射性標識した基質が含まれています。プラス記号で示されるのはcas6タンパク質とともにインキュベートした後のRNAであり、マイナス記号で示されるのは陰性対照としてのバッファーとともにインキュベートしたものです。また、デオキシリボヌクレオチドを添加した、あるいは添加していない長鎖基質または短鎖基質が含まれています。マイナス9番目の位置にデオキシリボヌクレオチドを導入することで、エンドヌクレアーゼ反応を促進させました。この手順に従った結果、RNA分子にデオキシリボヌクレオチドが含まれている場合、短鎖基質の切断が起こらなかったことに注目してください。

Casヌクレアーゼは、成熟した精細なRNAを生成するためのツールとしても利用可能です。これらのRNAをCascade複合体に組み込むことで、ウイルス攻撃の干渉への関与についての知見を得ることができます。このビデオを視聴することで、Casヌクレアーゼ用のCRISPR基質をどのように設計し、作製するかについて十分に理解できるはずです。

これらの異なる基質は、crispr Esの成熟と利用に関する疑問を解決するのに有用です。