細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

この方法の全体的な目標は、細胞追跡色素を使用して、複雑な集団内のさまざまな免疫細胞サブセットの細胞分裂の程度を直接定量化することです。これは、まず、細胞タンパク質に安定して結合すること、または刺激カウンターに応答する色素標識細胞を追跡するために細胞膜に非共有結合的に挿入することが知られている蛍光色素で親細胞集団を標識することによって達成され、蛍光抗体で染色し、マルチパラメータフローサイトメトリーを使用して分析することにより、刺激された目的の免疫細胞タイプ間の異なる応答の検出が可能になります。 しかし、トラッキング色素の未染色コントロールは、自家蛍光トラッキング色素と区別できる最も低い娘細胞の蛍光強度を確立するために使用されますが、その後、非刺激コントロールを使用して、未分割の細胞が検出される蛍光強度を確立します。刺激は通常、応答して増殖する細胞が徐々に暗くなるため、広範囲の強度をもたらしますが、非応答者はそうではありません。

最終的には、ピークモデリングソフトウェアを使用して、異なる世代の細胞の相対頻度を推定することで、増殖指数や前駆体頻度などの指標を使用して、異なる集団や刺激間での増殖応答を定量的に比較することができます。トリチウム化、汝取り込み、KI 67発現などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、DI希釈が細胞分裂の直接的な測定を提供し、イムノフェノタイピングやサイトカイン産生などの他のMEフローサイトメトリー測定と組み合わせることができることです。膜色素染色の方法を視覚的に示示することは、細胞による色素の取り込みが非常に速いため、有用です。

したがって、優れた技術が明るく均質な染色を得るための鍵となります。ヒト末梢血単核細胞を単離した後、Gの300倍と室温で5分間遠心分離し、血小板汚染を最小限に抑えます。次に、ペレットをHBSSに1%BSAを加えた1ミリリットルあたり10〜7番目の細胞に再懸濁し、氷の上に置きます。

500マイクロリットルのEloquaを取り外して予約し、次に別の500マイクロリットルの細胞アリコートを12 x 75ミリメートルの円錐形ポリプロピレンチューブに移します。3.5ミリリットルのHBSSを加え、細胞を400倍Gで5分間スピンダウンし、室温で洗浄中に、PKH 26 GLキットから0.5ミリリットルの希釈剤Cラベリングビヒクルを追加し、別の12 x 75ミリリットルの円錐形ポリプロピレンチューブにスーパーナチンを慎重に吸引し、15〜25マイクロリットル以下の残留液を残し、細胞を除去しないように注意します。次に、0.5ミリリットルの希釈剤C標識ビヒクルを細胞ペレットに加え、溶液を数回吸引して分注し、単一細胞懸濁液を得る。

次に、希釈剤C.Onlyを含むチューブに2マイクロリットルのPKH 26を添加して、2つのXDストックを準備します。すぐに細胞懸濁液を新たに調製した2つのXPKH 26色素溶液にピペットで移し、同時に混合物を数回吸引して分注し、色素全体に細胞を均一に分散させます。1分後、1ミリリットルの熱不活化血清を加えて、細胞膜への色素の取り込みを停止します。.スピンダウン後、細胞はペレットを除去せずに上清を慎重に吸引します。

次に、ペレットを10%の熱不活化血清を含む4ミリリットルの完全培地に分散させ、細胞懸濁液を新鮮なポリプロピレンチューブに移します。HBSSと1%BSAで細胞を2回洗浄すると、適切に染色された細胞は、ペレットに明確なピンク色がかった色を示します 細胞ペレットを1ミリリットルのHBSSと1%BSAで懸濁した後、細胞を数え、次に容量を調整して、1ミリリットルあたり7番目の細胞に10の最終濃度を与えます。表に概説されているフローサイトメトリープロトコルに従って細胞を染色した後、最初の5本のチューブを使用して、前方散乱光と側方散乱光のパラメータ、および4つの蛍光検出器すべてのシグナルを設定します。

特に、チューブ2のPKH 26蛍光を監視するために使用される検出器に使用します。PKH 26 で染色されたすべての細胞が、3 番目から 4 番目の 10 年間で 1 つの対称的なピークとしてスケールに表示され、最後のチャネルには細胞がほとんどまたはまったくないことを確認します。次に、カラーコンペンセーションソフトウェアとチューブ1〜5で収集されたリストモードファイルを使用して、他の3つの蛍光色素のモニタリングに使用されている検出器の各フルーロの色オーバーラップマトリックスを確立します。

次に、この行列をサンプル 6 のリスト モード ファイルに適用します。PKH 26標識の存在が7つのAおよびD陽性細胞を検出する能力を変化させないことを確認すること。次に、この設定したばかりのカラーオーバーラップマトリックスをチューブ7のリストモードファイルに適用します。

FE対PCプロットで、CD 3、陽性、CD4、陰性、およびCD 3、陽性、CD、4、陽性の母集団を特定します。抗CD 3、FEおよび抗CD 4 A PCの存在が、7つのAおよびD陽性細胞を検出する能力を変化させないことを確認する。最後に、チューブ 7 のカラー オーバーラップ マトリックスをチューブ 8 のリスト モード File に適用します。

次に、増殖解析モジュールを含むプログラムを開きます。刺激を受けたPKH 26染色ファイルを解析するデータセットからロードします。次に、この場合、PKH 26は生存可能な7つのaの陰性CD、3つの陽性リンパ球、および小さな破片と大きな凝集体を除外するための前方散乱対側方散乱でゲートされた分析用のパラメータを選択します。

これらの領域を定義する際には、ブラストが通常見られる高い前方散乱領域を含めるように注意してください。次に、増殖ウィザードを開きます。スタートタブをクリックしてデータファイルを開き、非刺激PKH26ポジティブコントロールをロードします。

未分割のセルに対応する親ピークの位置を定義します。親ピークの位置と幅の値に注意してファイルを分析します。固定ピーク幅が必要な場合は、P KH26ネガティブコントロールをSDロードにロックし、PKH26ネガティブセルより上にディムスドータージェネレーションのピークチャネルを設定して世代数を調整します。

これにより、娘の世代数が設定されます。モデルは完成時に正確に収まります。刺激されたPKH 26陽性ファイルをリロードします。

識別可能な世代のピークが明らかな場合は、モデルオプションの下のフローティング設定を選択します。log decadeが正確に4.0でない場合は、記事で説明されているように世代間の間隔を調整します。次に、刺激されたサンプルを分析し、親のピーク位置の領域が変わらないことを確認します。

最後に、適用するデータセット内の各実験ファイルに対して [分析] を選択します。モデルは、データセット内の各実験ファイルに最適なものから得られる目的の増殖メトリクスを作成し、記録します。この最初の一連のデータは、PKH 26の蛍光分布に対する混合技術の影響を示しています。

培養すると、U9 37骨髄細胞を、この最初のヒストグラムが未染色のコントロールデータを示す、今説明した方法を用いて細胞追跡色素で染色した。サイトメーターの設定は、最初のチャネルに蓄積する細胞がまったくないか、または非常に少ない状態で、最初の10年間でこれらの細胞からの自家蛍光を配置するように調整されました。この 2 番目のヒストグラムは、良好な PKH 26 染色を示しています。

2つのx細胞と2つのx色素を迅速に混合すると、明るく均一で対称的な蛍光分布が得られましたが、前のヒストグラムで使用した装置設定ではスケールから外れた細胞はありませんでした。2つのx細胞を2つのx色素に直ちに混合せずに添加すると、より不均一な蛍光分布が得られました。この薄暗く標識された細胞の小さな亜集団は、この実験からの最終ヒストグラムの後の時点で存在していた場合、誤って娘細胞と解釈され、3マイクロリットルの濃縮エタノール染料ストックが誤って0.5ミリリットルの2つのx細胞懸濁液に直接加えられたときにも混合不良が発生し、非常に暗く、右に歪んだ蛍光強度分布をもたらしました。

ここでは、PKH 20で染色されたヒト末梢血単核細胞を刺激性の有無にかかわらず培養した増殖実験の典型的な結果を示します。抗CD3試薬とIL2試薬が示されています。96時間の培養後、細胞を回収し、抗CD3つのFE抗CD19APCおよび7つのAadで対比染色しました。

最初のゲーティング戦略であるCD3と7のドットプロットでは、2つの異なるゲーティング戦略が比較されました。A A Dを用いて、生きた7つの陰性CDの3つの陽性T細胞を選択しました。次に、前方散乱および側方散乱領域を使用して、ブラストリンパ球を含めながら大きな凝集体をゲートアウトしました。

未染色コントロールのR oneおよびR 2ゲートイベントは灰色のヒストグラムで表され、PKH 26で染色されたが、刺激されていない細胞はブルーノートで表され、刺激されていないコントロールの生存可能だが未分割のT細胞に対する明るく対称的な均質染色である。これらのデータは前の図と同様にゲーティングされていますが、今回は抗CD3とIL2で細胞を刺激しました。R 1 と R 2 のゲートイベントの PKH 26 ヒストグラムには、ほとんどが分割されたセルが含まれ、強度が低下し、各娘世代の色付きのピークで表されます。

いくつかの明るい未分割の細胞はまだ青い親のピークに残っていますが。高度に分裂した細胞の強度は、未染色細胞が測定される領域とまだ重なっていないため、ここで最も強度の低い娘世代の細胞数に基づく指標の推定が混乱することに注意してください。前の2組の図と同じデータを解析したが、生細胞の選抜には光散乱とCD 3のみを用いた。

このゲーティング戦略は、CDに残っている7つのA/A・D陽性の死細胞の小さな残留集団(3対7つのA・A・Dドット・プロット)によって示されるように、多くの死細胞を除外しますが、すべてではありません。イムノフェノタイピングに使用される蛍光色素の選択は、未分割細胞の染色強度が非常に明るいため、セルトラッキングダイを使用する際に困難な補償問題を引き起こす可能性があります。この実験では、24時間齢の末梢血単核細胞をPKH 26で標識し、次にCD 3およびCD 4に対する抗体と生存率色素で対比染色しました。

この一連のデータでは、2マイクロモルのPKH 26で標識された細胞を抗CD3 FZ 7 A A Dおよび抗CD4 A PCで対比染色し、次いで、以前と同じR one plus R two gating戦略を用いて分析した。 CDの4つのポジティブイベントとネガティブイベントは、補償が適用されたかどうかにかかわらず明確に解決されました。これらのデータは、生存可能なCD、3つの陽性CD、4つの陽性T細胞が、最終的なPKH 26濃度が4マイクロモルに増加した場合でも、どのように良好な分離を維持したかを示しています。抗 CD 3 FE 2 マイクロモル PKH 26 および生存率ダイからプロ 3 と組み合わせて使用すると、PKH 26 が CP チャネルごとに大幅に重複するため、CP あたり 4 つの抗 CD 4 を使用した場合、はるかに悪い結果が得られました。

CD 4つの陽性細胞と陰性細胞は、補正されていないデータでは互いに分解できず、補正が適用されたときにわずかにしか分解されませんでした。最終的なPKH 26濃度を4マイクロモルに増加させると、補償が適用された後でも、CD 4陽性事象とCD4陰性事象を分離する能力が完全に失われました。CPごとにアンチCD4を含むサンプルまたはアンチCD4がないサンプルが本質的に同一であることに注意してください。

ピークモデリングソフトウェアを使用して色素希釈プロファイルを解析し、連続する娘世代の細胞の頻度を推定すると、連続する娘ピークの位置や幅を固定またはフローティングにすることができます。親ピークの値に関して。これらの値は、非刺激制御から推定されます。

例えば、この PKH 26 強度プロファイルは、中等度レスポンダーによる非刺激 96 時間培養に由来し、未分割の親細胞を表すピークの位置と幅の最初の推定値を mod fit proliferation wizard に提供するために使用されました。ピーク位置を固定設定するには、各世代別ピークの平均を前のピークの蛍光強度のちょうど半分にする必要があります。ピーク位置のフロート設定により、世代別ピークの最終的な位置を、必要に応じて予想される強度から変化させて、最適な適合を得ることができます。

同様に、ピーク幅を固定設定するには、各世代ピークの幅を親ピークまたは非刺激制御ピークの幅と同じにする必要があります。ピーク幅のフロート設定により、このテーブルに最適なフィットを得るために、必要に応じて最終的な幅を独立して変化させることができます。2つの異なるドナーについて前の数値を分析した結果を、これらのドナーについて示し、世代間のピークが区別できる点を明らかにしました。

ピーク位置と幅の両方をフロートさせた場合に、識別可能な世代ピークが明らかでない増殖プロファイルに対して、最適な縮小カイ二乗値が得られました。ピーク位置の固定設定が推奨されます。これらのデータは、フローサイトメトリー免疫抑制アッセイにおいて、2種類のトラッキング色素を使用して異なる免疫細胞タイプの増殖履歴を別々にモニタリングする方法を示しています。緑色で示されているTエフェクター細胞はCFSEで標識され、青色で示されているT制御細胞はセルビューで標識されています。

クラレット標識細胞集団をさまざまな比率で混合し、抗CD 3、抗CD 28、および照射済みアクセサリー細胞の存在下で96時間培養しました。その後、細胞を採取し、抗CD4、PEサイズ7、および生死バイオレットで染色しました。ここは。トレグとTのエフェクター比が0.25対1の代表的なデータは、生きたバイオレット陽性細胞をゲートアウトした後で示されています。

リンパ球と芽球を含むが、凝集体と破片は除外する光散乱ゲートを適用し、続いてCDの4つの陽性イベントを含むゲートを適用しました。Cell view claret染色により、生存可能なtreg細胞を増殖性の高い生細胞Tエフェクター細胞と容易に区別することができたため、CFSE陽性Tエフェクター細胞のCFSE DIM増殖プロファイルおよびCell view Claret positive treg細胞をmod fitピークモデリングソフトウェアを使用して分析しました。約25, 000のイベントが分析されました。

これらのうち、48%は生存可能なTエフェクターであり、6%は生存可能なTレギュラーであり、残りは死細胞、付属細胞、および破片でした。アッセイ期間中の細胞数の倍増を反映する計算された増殖指数は、Tエフェクターで3.85、Tregで1.83でした。ここでは、CFSE色素希釈プロファイルから算出したTエフェクタ細胞の増殖指数に対するtregs細胞濃度の影響を示す。

結果は、トレグ細胞をセルビュークラレットで標識したか、染色せずに放置したかにかかわらず同じであり、トレグ機能が染色によって変化しなかったことを示しました。予想通りの追跡では、トレグ細胞の濃度が低下するにつれて、テクターの増殖の程度が増加しました。Treg細胞増殖指数も、異なるTregとTのエフェクター比でのCell View Clariet Dye希釈プロファイルから計算しました。

予想通り、Tエフェクター細胞の非存在下では、Tエフェクター細胞の濃度が上昇したため、Tregsの増殖は最小限に抑えられました。しかし、トレグ細胞の増殖の程度も増加しました。ビデオをご覧になった方には、細胞増殖をモニタリングするための細胞追跡色素の適切な使用方法、適切な蛍光色素と色補正コントロールの選び方、色素の希釈に基づく細胞分裂の定量化に適したモデルの選択方法について、十分に理解できるはずです。

この手順に加えて、抗原特異的T細胞の染色や、静止状態またはゆっくりと分裂している幹様細胞の回収のためのフローソーティングなど、実験上の疑問に答えるための他の方法を実行することができます。ご覧いただき、誠にありがとうございました。