細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

本手法の総合的な目的は、細胞追跡染料を用いて、複雑な集団内における異なる免疫細胞サブセットの細胞分裂の程度を直接定量化することである。これはまず、細胞タンパク質に安定して結合するか、あるいは細胞膜に非共有結合的にインターカレートすることが知られている蛍光染料で親細胞集団をラベル化することで達成される。刺激に反応して追跡染料でラベル化された細胞を追跡し、蛍光抗体で染色した後にマルチパラメータフローサイトメトリーで分析することで、刺激された目的の免疫細胞タイプ間の反応の差を検出できる。一方で、追跡染料で染色していないコントロールを用いて、自家蛍光と区別できる娘細胞の最低蛍光強度を決定する。その後、追跡染料でラベル化されているが刺激されていないコントロールを用いて、分裂していない細胞が検出される蛍光強度を決定する。通常、刺激を与えると強度の幅が広くなる。これは、反応して増殖する細胞は次第に蛍光が弱くなるが、非反応細胞は弱くならないためである。

最終的に、ピークモデリングソフトウェアを使用して異なる世代の細胞の相対頻度を推定することで、増殖指数や前駆細胞頻度などの指標を用いて、異なる集団や刺激に対する増殖反応を定量的に比較することが可能になります。トリチウム標識チミジンの取り込みやKI 67の発現といった既存の手法に対するこの技術の主な利点は、DI希釈によって細胞分裂を直接的に測定でき、それを免疫表現型解析やサイトカイン産生などの他のフローサイトメトリー測定と組み合わせることができる点にあります。細胞による染料の取り込みは極めて迅速であるため、膜染料染色の方法を視覚的に提示することが有用です。

したがって、明るく均一な染色を得るには、適切な手技が重要です。ヒト末梢血単核細胞を分離した後、血小板の混入を最小限に抑えるため、室温にて 300 ×g で 5 分間遠心分離します。次に、ペレットを 1% BSA 含有 HBSS で 10⁷ cells/mL の濃度で再懸濁し、氷上に置きます。

500 µLの分注液を取り出して保存し、さらに別の500 µLの細胞分注液を12 × 75 mmの円錐形ポリプロピレンチューブに移します。3.5 mLのHBSSを加え、室温、400 ×gで5分間遠心分離して細胞を沈殿させます。洗浄の間、PKH 26 GLキットの希釈液C（labeling vehicle）0.5 mLを別の12 × 75 mm円錐形ポリプロピレンチューブに加えておきます。細胞を採取しないよう注意しながら、上清を慎重に吸引し、残留液が15〜25 µL以下になるようにします。次に、細胞ペレットに0.5 mLの希釈液C（labeling vehicle）を加え、溶液の吸引と分注を数回繰り返して、単一細胞懸濁液にします。

希釈液Cが入ったチューブにPKH 26を2 µL加え、2X XDストック溶液を調製します。その後すぐに、細胞懸濁液を調製したばかりの2X PKH 26染料溶液にピペッティングし、同時に混合液を数回吸引・吐出して、細胞を染料中に均一に分散させます。1分後、熱不活化血清を1 mL加えて、細胞膜への染料の取り込みを停止させます。遠心分離後、ペレットを除去しないように注意しながら上清を吸引します。

次に、10%熱不活化血清を含む完全培地 4 mLでペレットを分散させ、細胞懸濁液を新しいポリプロピレンチューブに移します。HBSS + 1% BSAで細胞を2回洗浄します。十分に染色された細胞は、ペレットがはっきりとした桃色を呈します。細胞ペレットをHBSS + 1% BSA 1 mLで再懸濁した後、細胞数を計測し、最終濃度が10⁷ cells/mLになるように液量を調整します。表に記載されたフローサイトメトリーのプロトコルに従って細胞を染色した後、最初の5本のチューブを使用して、前方散乱光（forward scatter）と側方散乱光（side scatter）のパラメータ、および4つの蛍光検出器すべてにおけるシグナルを設定します。

特に、チューブ2のPKH 26蛍光をモニタリングするために使用する検出器について確認します。すべてのPKH 26染色細胞が、スケール上で3〜4桁目の単一の対称ピークとして表示され、最終チャンネルに細胞がほとんどまたは全く存在しないことを確認してください。次に、カラー補正ソフトウェアとチューブ1から5で収集したリストモードファイルを使用し、他の3つのフルオロクロムをモニタリングするために使用している検出器の各蛍光色素について、カラーオーバーラップマトリックスを作成します。

次に、このマトリックスをサンプル6のリストモードファイルに適用します。PKH 26のラベル化によって7-AAD陽性細胞の検出能が変化しないことを確認するため、今作成したカラーオーバーラップマトリックスをチューブ7のリストモードファイルに適用します。

FE対PCプロット上で、CD3陽性CD4陰性およびCD3陽性CD4陽性の集団を特定します。anti-CD3、FE、およびanti-CD4 APCが存在しても、CD7陽性細胞を検出する能力に影響がないことを確認してください。最後に、チューブ7のカラーオーバーラップマトリックスをチューブ8のリストモードファイルに適用します。

次に、増殖解析モジュールを含むプログラムを開きます。データセットから、解析対象となる刺激後のPKH 26染色ファイルをロードしてください。続いて、本解析におけるパラメータを選択します。ここでは、生存している7-AAD陰性およびCD3陽性のリンパ球でゲートをかけたPKH 26、および小さなデブリや大きな凝集塊を除外するための前方散乱光（FSC）対側方散乱光（SSC）を選択します。

これらの領域を定義する際は、通常ブラスト細胞が見られる前方散乱（forward scatter）の高い領域が含まれるように注意してください。次に、増殖ウィザード（proliferation wizard）を開きます。「start」タブをクリックしてデータファイルを開き、未刺激のPKH 26陽性コントロールをロードします。

未分裂細胞に対応する親ピークの位置を定義します。親ピークの位置と幅の値を記録しながらファイルを解析してください。ピーク幅を固定したい場合は、「lock SD」にチェックを入れ、PKH 26陰性コントロールをロードし、PKH 26陰性細胞よりも上に娘細胞世代のピークチャネルを設定して、世代数を調整します。

これにより娘世代の数を設定します。完了後、モデルは正確に適合させることができます。刺激したPKH 26陽性ファイルを再読み込みしてください。

世代ごとのピークが明確に区別できる場合は、モデルオプションでfloating設定を選択してください。ログ・デケードが正確に4.0でない場合は、本記事で述べた通り世代間間隔を調整してください。次に、刺激したサンプルを分析し、親ピーク位置の領域が変化していないことを確認してください。

最後に、データセット内の各実験ファイルに対して「analyze」を選択し、作成したモデルを適用して、各ファイルの最適適合から得られる目的の増殖指標を記録します。この最初のデータシリーズは、混合手法が PKH 26 蛍光分布に及ぼす影響を示しています。

培養されたU 9 37骨髄系細胞を、上述の方法を用いて細胞追跡染料で染色しました。最初のヒストグラムは、未染色のコントロールデータを示しています。サイトメーターの設定は、これらの細胞からの自家蛍光が第1デケードに位置し、第1チャンネルに蓄積する細胞がほとんどないか、全くないように調整されました。2番目のヒストグラムは、良好なPKH 26染色結果を示しています。

2xの細胞と2xの染料を迅速に混合したところ、明るく均質で対称的な蛍光分布が得られましたが、前のヒストグラムで使用した装置設定においてスケール外となる細胞は見られませんでした。一方、2xの細胞を2xの染料に添加し、すぐに混合しなかった場合は、より不均質な蛍光分布が得られました。この弱く標識された細胞の小さなサブポピュレーションが、本実験の最終的なヒストグラムにおける後のタイムポイントに存在していた場合、娘細胞であると誤認される可能性があります。また、3 µLの濃縮エタノール染料ストックを0.5 mLの2x細胞懸濁液に誤って直接添加した際にも不十分な混合が起こり、極めて暗く右に歪んだ蛍光強度分布が得られました。

ここでは、PKH 20で染色したヒト末梢血単核細胞を、刺激剤であるAnti CD3およびIL-2の有無で培養した増殖実験の典型的な結果を示します。96時間の培養後、細胞を回収し、anti CD3 PE、anti CD19 APC、および7-AADで対比染色を行いました。

2つの異なるゲーティング戦略を比較しました。最初のゲーティング戦略では、CD3対CD7のドットプロットを用い、7-AADを用いて、生存している7-AAD陰性かつCD3陽性のT細胞を選択しました。次に、前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）領域を用いて、芽球化したリンパ球を保持しつつ、大きな凝集塊をゲーティングして除外しました。

未染色のコントロールにおけるR1+R2ゲートイベントをグレーのヒストグラムで、PKH26染色済みで未刺激の細胞を青色で示しています。未刺激コントロールにおいて、生存しているが分裂していないT細胞が、明るく対称的で均質な染色を示していることに注目してください。これらのデータは前図と同様の手法でゲート設定されていますが、このケースでは細胞を抗CD3およびIL2で刺激しました。R1+R2ゲートイベントのPKH26ヒストグラムには、現在、主に分裂した細胞が含まれており、娘細胞の各世代に対応する色付きのピークによって強度の低下が示されています。

青色の親細胞のピークには、まだいくつかの明るい未分裂細胞が残っています。高度に分裂した細胞の強度は、未染色細胞が測定される領域とはまだ重複していないことに注意してください。もし重複していれば、ここでの最低強度の子世代の細胞数に基づいた指標の推定が困難になります。データは前の2組の図と同様に分析されましたが、生存しているT細胞の選択にはライトスキャッター（前方散乱光）とCD3のみが使用されました。

このゲーティング戦略では、CD3対7-AADドットプロットに残存する7-AAD陽性の死細胞の少数の集団で示されるように、多くの死細胞は除外されますが、すべてではありません。細胞追跡色素を使用する場合、分裂していない細胞の染色強度が極めて高いため、免疫表現型解析に使用する蛍光色素の選択によって、困難なコンペンセーション（補正）の問題が生じることがあります。本実験では、24時間経過した末梢血単核細胞をPKH26で標識し、その後、CD3およびCD4に対する抗体と生存率染料で対比染色を行いました。

この一連のデータでは、2 µMのPKH 26で標識した細胞を、抗CD3 FITCおよび抗CD4 APCで対比染色し、前述と同様のR1+R2ゲーティング戦略を用いて解析した。PKH 26のAPCチャネルへの漏れ込みがほとんどなかったため、補正の有無にかかわらず、CD4陽性と陰性のイベントを明確に分離することができた。これらのデータは、最終的なPKH 26濃度を4 µMに上昇させた場合でも、生存しているCD3陽性CD4陽性T細胞が十分に分離されたままであることを示している。抗CD4 PerCPを抗CD3 FITCおよび2 µMのPKH 26、ならびに生存率染料のDAPIと組み合わせて使用したところ、PKH 26のPerCPチャネルへの顕著な漏れ込みにより、結果は大幅に悪化した。

補正前のデータでは、CD4陽性細胞と陰性細胞を区別することはできず、補正後でもわずかに区別できる程度でした。PKH 26の最終濃度を4 µMまで上げると、補正後であってもCD4陽性イベントとCD4陰性イベントを区別する能力が完全に失われました。CPあたりの抗CD4抗体を含むサンプルと含まないサンプルが、実質的に同一であることに注目してください。

色素希釈プロファイルをピークモデリングソフトウェアを用いて解析し、連続する娘細胞世代の細胞頻度を推定する場合、連続する娘ピークの位置および／または幅を、親ピークの値に対して固定または変動させることができます。これらの値は、未刺激コントロールから推定されます。

例えば、この PKH 26 強度プロファイルは、中等度の反応を示した被験者の非刺激 96 時間培養細胞から得られたものであり、未分裂の親細胞を表すピークの位置と幅の初回推定値を mod fit 増殖ウィザードに提供するために使用されました。ピーク位置に固定設定（fixed setting）を使用する場合、各世代のピークの平均値は、前のピークの蛍光強度の正確に半分である必要があります。ピーク位置にフロート設定（float setting）を使用すると、最適なフィットを得るために必要に応じて、世代ピークの最終的な位置を期待される強度から変動させることができます。

同様に、ピーク幅を固定設定（fixed setting）にする場合は、各世代のピーク幅を親世代または非刺激コントロールのピーク幅と同一にする必要があります。一方、ピーク幅を変動設定（float setting）にすると、この表で最適なフィットを得るために、最終的な幅を必要に応じて個別に変動させることができます。識別可能な世代別ピークが認められた2名の異なるドナーについて、前述の図の解析結果をここに示します。

ピーク位置と幅の両方を変動させた場合に、最小の簡約カイ二乗値が得られました。世代ごとのピークが明確に識別できない増殖プロファイルについては、ピーク位置を固定設定にすることを推奨します。これらのデータは、フローサイトメトリーを用いた免疫抑制アッセイにおいて、2種類の追跡染料を使用して異なる免疫細胞種の増殖履歴を個別にモニタリングする方法を示しています。緑色で示されたエフェクターT細胞はCFSEで、青色で示された制御性T細胞はCellViewで標識されました。

Claretで標識した細胞集団を様々な比率で混合し、anti CD3、anti CD28、および放射線照射した副細胞の存在下で96時間培養しました。その後、細胞を回収し、anti CD4、PE7-AD, およびLive/Dead Violetで染色しました。ここでは、Live/Dead Violet陽性細胞を除去（ゲーティング）した後の、Treg対T effector比が0.25:1の場合の代表的なデータを示しています。

リンパ球および芽球を含み、凝集塊およびデブリを除外する前方散乱・側方散乱ゲートを適用し、続いてCD4陽性イベントを含めるゲートを設定した。CellView Claret染色により、生存Treg細胞を、高度に増殖してCFSE強度が低下した生存Tエフェクター細胞から容易に区別することができた。そのため、CFSE陽性Tエフェクター細胞およびCellView Claret陽性Treg細胞のCFSE DIM増殖プロファイルを、ModFit Peakモデリングソフトウェアを用いて解析した。約25,000イベントを解析した。

これらのうち48%が生存しているTエフェクター細胞、6%が生存しているTreg細胞であり、残りは死細胞、副細胞、およびデブリであった。アッセイ期間中の細胞数の増加倍率を反映する算出増殖指数は、Tエフェクター細胞で3.85、Treg細胞で1.83であった。ここでは、CFSE色素希釈プロファイルから算出されたTエフェクター細胞の増殖指数に対するTreg細胞濃度の影響を示す。

Treg細胞をCell View Claretで標識した場合と未染色のままであった場合で結果は同様であり、染色はTreg機能に影響を与えないことが示されました。追跡の結果、予想通り、Treg細胞の濃度を低下させるとT effector細胞の増殖範囲が増加しました。また、異なるTreg対T effector比におけるCell View Claret染料の希釈プロファイルから、Treg細胞の増殖指数を算出しました。

予想通り、T effector細胞が存在しない場合、T effector細胞の濃度が増加してもTregsの増殖は最小限にとどまりました。しかし、Treg細胞の増殖の程度も同様に増加しました。ビデオを視聴することで、細胞追跡染料を用いて細胞増殖をモニタリングする方法、適切な蛍光色素とカラーコンペンセーションコントロールの選び方、そして染料の希釈に基づいて細胞分裂を定量化するための適切なモデルの選択方法について、十分に理解できたはずです。

本手順に加え、抗原特異的T細胞の染色や、静止期または緩徐に分裂する幹細胞様細胞を回収するためのフローソートなど、実験的な疑問を解決するための他の手法を実施することが可能です。ご視聴ありがとうございました。