Name: 細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: 学ぶ細胞トラッキング染料を用いた免疫細胞分裂の定量法。蛍光標識とフローサイトメトリー、ピークモデリングソフトウェアを組み合わせ、複雑な集団内の細胞増殖を正確に解析する手法を解説します。

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ブルース·バグウェル（Verityのソフトウェアハウス）、NadègeBercovici（IDM）、Lizanneブレスリン（ZynaxisセルサイエンスおよびPTI研究）：著者は、特に年間を通じてこれらの方法の開発への技術的·知的貢献のために以下の個人に感謝したいと思います、ブライアン·グレイ（PTIリサーチ）、ヤン·フィッシャー（ダートマス医科大学）、アリスGivan（ダートマス医科大学）、ベッツィオールソン·ヴィルヘルム（SciGro、Inc。）、およびメアリー·ウォー（ダートマス医科大学）。彼らはまた、 図2に示すようにデータを生成した年次調査方法のコースおよびフローサイトメトリーの応用、2006年からのボードンクラスに感謝したいと思います。 フローサイトメトリーは、NIHの共有インストゥルメント·プログラムから機器の助成金によって部分的に設立されたロズウェルパークがん研究所のフローサイトメトリー研究室で行われ、全国からコアグラント（5 P30-CA016056-29）からの支援を受けたがんロズウェルパークがん研究所へ、そしてアブラムソンがんセンターのフローサイトメトリーおよびNIH共有音源プログラムから機器の助成金によって部分的に設立されたペンシルベニア大学の細胞選別資源研究所の研究所、およびNIH＃2P30から支援を受けて米国国立がん研究所からCA016520。 図3及び図5に示す作業もPTIリサーチ社に授与生体イメージングとバイオの国立研究所（NIBIB）からSBIRの助成EB00228によって部分的にサポートされていました

1。 PKH26細胞トラッキング色素で、一般的なメンブレンラベリング（ 文献25;図1） <ol><li> 1.9 - 手順1.1の滅菌技術を使用してください。血小板汚染を最小限に抑えるための最終的な300×gでスピンを加えた実験室の標準法を用いて〜10 7ヒト末梢血単核細胞またはリンパ球（hPBMC、hPBL）を準備します。ステップ2で使用するための500μlのアリコートを（5×10 6細胞）を確保し、10氷上のHBSS +1％BSAおよび場所で7 / mlになるように細胞を再懸濁する。 </li><li> 12 x 75 mmの円錐形のポリプロピレン製チューブに入れ、5×10 6個の細胞（500μL）。 3.5mlのHBSSで1回洗浄します。慎重に残留流体のこれ以上より15から25μlを残しているが、細胞を除去しないように注意しながら、上清を吸引除去する。ステップ1.4で2倍の細胞懸濁液を調製するために、このチューブをご使用ください。 </li><li>ステップ1.2における細胞洗浄の間に、12 x 75 mmの円錐ポリプロピレンチューブに希釈Cラベリング車両0.5mlを（PKH26GLキットから）を追加します。予備校にこのチューブを使用ステップ1.5倍PKH26ソリューションです。 </li><li>ステップ1.2から洗浄細胞ペレットに希釈Cラベリング車両の0.5 mlを加え、単一の細胞懸濁液（2倍の細胞）を得るために3〜4回の吸引と分注する。細胞の生存と回復を減らすかもしれない、バブルの形成と過度の混合は避けてください。 </li><li>直ちにステップ1.4で2倍の細胞懸濁液を調製した後、ステップ1.3で調製した希釈液、C管にエタノール中1.0mMのPKH26色素株式（PKH26GLキットから）2.0μlを添加して2倍（4μM）色素溶液を調製し、ボルテックスへ均一に分散させる。 </li><li>直ちにステップ1.5で2倍の色素溶液を調製した後、急速に2倍の染料溶液にステップ1.4から2倍の細胞懸濁液をピペットと同時に完全に色素で細胞を分散させるために3-4回を吸引および分注しないでください 。に直接1.0mMの染料を追加細胞;倍色素に2倍の細胞を注ぐ、あるいはボルテックスしながら染料を2倍に2倍のセルを追加します。染色はほぼ瞬時に行われますので、そのような方法はあまり得推奨される方法より均一な強度（ 図2）。 </li><li> 1分後、熱不活性化血清または細胞膜に色素の取り込みを停止するHBSS +5％BSAを1.0ミリリットルを追加します。十分なタンパク質を使用しなかった場合は、洗浄工程の中の細胞を持つことができペレット色素凝集体の形成をリスクと実験中に存在する他の細胞の意図しないラベリングを引き起こす。 10％熱不活化血清（CM）またはHBSSで培地+1％BSAが停止試薬として使用する場合は、すべての吸着を確実にするために15 mlコニカルポリプロピレンチューブに染色行うと停止試薬の少なくとも5.0ミリリットルを追加非法人の染料。 </li><li> 5分間標識した細胞を遠心@〜400 x gで。注意深く細胞を除去することなく、上清を吸引除去する。よく再遠心分離前にペレットを分散させると、CMまたはHBSS +1％BSAの4ミリリットルでペレットを2回洗浄。チューブ壁に吸着した色素のキャリーオーバーを最小限に抑え、洗浄効率を最大限に高めるためには、fiの後に新鮮なポリプロピレンチューブに細胞を移すRST再懸濁。注：十分に染色された細胞は、ペレット内の異なるピンクの色合いを示すであろう。 </li><li> 1.0ミリリットルHBSS +1％BSAで洗浄した細胞ペレットを再懸濁します。 、細胞をカウントする細胞の回復を決定し、10 7 / mlの最終濃度になるようにボリュームを調整します。慎重に吸引すると、細胞の回復が≥85％であるべきである。細胞の回復は&lt;70％であれば、先へ進む前に、原因を特定します。ステップ2で使用するために氷の上で150μlのアリコート（1.5×10 6個の細胞）と場所を撤回します。 </li></ol> 2。インストゥルメントおよびアッセイセットアップコントロールの調製（ 表1） <ol><li> 5 1.8ミリリットルエッペンドルフチューブの各々にステップ1.1で保存した細胞懸濁液からの未染色細胞のアリコートを50μl（5×5）：1、3、4、5、7。 3各チューブへのステップ1.9からPKH26 posの細胞のアリコートを50μl（5×5）：2、6および8。 </li><li>チューブ1月8日に、10μlのIgGのブロック（試薬の表を参照のIgGの100μg/チューブ）を追加と周囲温度（20-25℃）で10分間インキュベートする。 </li><li>チューブ4、5、7、および8に、表1に示されており、周囲温度で30分間のすべてのサンプルを（チューブ1-8）インキュベートし、光から保護する抗体の飽和量（IES）を追加します。 </li><li>すべてのサンプルにHBSS +1％BSAを1.5ミリリットル、ペレットを遠心分離により細胞を（5分@ 400×g）で追加し、セル損失を避けるために慎重に吸引して、HBSS +1％BSAを1.5 mlで1回洗浄します。 </li><li> HBSS +1％BSAを500μlの各サンプルを再懸濁します。あなたのメーター上で分析されるサンプルで必要な場合は、12 x 75 mmの丸底チューブに移す。 表1に示すように管3、6、7、8から100μg/ mlの7-AADの日常作業用ストックを10μl（試薬の表を参照）を追加します。フローサイトメーターのセットアップおよび染色検証（ステップ3）での使用に先立って、氷上で30分間インキュベートします。 </li></ol> 3。フローサイトメーターの設定および染色検証<ol><li>ていることを確認し、フローcytomeTERは毎日の品質管理のための研究室の確立された手順を使用して、正常に動作しています。容易に使用するために、各スペクトルウィンドウに検出され、検出器の応答は、増殖のモニタリング14に使用されるウィンドウで強度を通知するために直線的に比例することができるように信号を検証する。 </li><li>線形表示スケールを使用してチューブ1にFSC対SSCデータを取得します。リンパ球集団がドットプロットの左下の象限内に収まるように各検出器の増幅はそのような調整、どちらのパラメータでオフスケールのものではなく、しきい値が原因で中断されません。 3.7 - 3.3ステップですべてのサンプルに対してゲートなしFSC対SSCデータを収集します。 </li><li>全4蛍光検出器のための色補正と対数表示のスケールを使用していない、チューブ1のデータを取得する。最初のチャンネルに蓄積少数/無細胞と規模で染色されていないリンパ球の自家蛍光を配置するために、各検出器の高電圧（HV）を調整します。各ヒストグラムの解析境界を設定する非染色細胞の明るい2パーセントに相当する。 </li><li>ステップ3.2と3.3年に設立されない色の補償とHV設定を使用していない、FSC、SSC、すべて4蛍光検出器の信号を収集し、チューブ2のデータを取得する。 PKH26蛍光をモニターするために使用される検出器の場合は、すべてのPKH26 posの細胞は最後のチャンネルに/少数の細胞で、第3回-4 回目の十年のシングル対称ピークとしてスケールで表示されていることを確認します。複数のピークまたはピーク形状があるが偏っている場合には、最小化と混合技法（ 図2）塩には細心の注意でステップ1を繰り返します。必要に応じて、色素濃度を調整します。 </li><li>ステップ3.3に設立された設定を使用して、FSC、SSC、すべて4蛍光検出器で信号を収集、チューブ3のデータを取得する。 7-AAD蛍光をモニターするために使用される検出器については、7-AADのposの細胞（非生存細胞が十分に解決され、 すなわち 、ステップ3.3に設立され、2％の境界線上に入ることを確認してください実行可能な7-AAD neg細胞から）。 </li><li>ステップ3.3に設立された設定を使用して、FSC、SSC、すべて4蛍光検出器で信号を収集、チューブ4のデータを取得する。 CD8 posの細胞が十分に染色されていない細胞（ すなわち 、FITC標識検出器のためのステップ3.3に設立され、2％の境界上秋）から解決されていることを確認します。チューブ5を繰り返して、POSおよびCD8細胞はよく染色されていない細胞（ すなわち 、APCの検出器のためのステップ3.3に設立され、2％の境界上秋）から解決されていることを確認します。 </li><li>ステップ3.3に設立された設定を使用して、すべての4蛍光検出器にFSC、SSC、および信号を収集、管6、7、8のデータを取得する。 </li><li>チューブ1-5と他の3つの蛍光色素を監視するために使用されている検出器の各蛍光色素のために行列を重複色を確立するためにあなたの色補正ソフトのために収集リストモードファイルを使用します。サンプル6用のリストモードファイルにこの行列を適用していることを確認しPKH26ラボの存在elingは7-AAD posの細胞を検出する能力を変更するものではありません。 </li><li> 3）うまく解決亜集団（CD3 NEG CD4 NEG、CD3 POS CD4 NEGおよびCD3 posの CD4 posが ）、FITC対に識別することができます：ステップ3.8からサ ​​ンプル7のためのリストモードファイルに行列をオーバーラップしていることを確認して色を適用APCのドットプロットと、b）抗CD3-FITCおよび抗CD4-APCの存在は7-AADのposの細胞を検出する能力を変更するものではありません。抗CD3-FITCの存在がPKH26検出器で収集されたデータの上位2％の境界を変更した場合、必要​​に応じて境界を再調整します。 </li><li>ステップ3.8からサンプル8のリストモードファイルに行列を重複色を適用します。 PKH26標識の存在は、ステップ3.3における自家蛍光コントロールを使用して、それらの集合から、FITC、7-AADまたはAPC検出器のための2％の境界を変更した場合、 表1のチューブ7を使用して、必要に応じて境界（IE）を再調整していることを確認し、それまだdistingすることが可能ですuish、CD3、CD4、POS posには、CD3、CD4 POS NEG、およびCD3 NEGの CD4 neg細胞は、調整された境界（IE）を使用します。 </li></ol> 4。色素希釈により細胞分裂監視のための増殖モデルの選択<ol><li>あなたのメーターでチャンネルや対数十年の数に依存している世代間の間隔を決定する。デジタル機器の場合、この値は一般的に4〜5十年は、デジタル信号プロセッサのビンの数によって決定されます。アナログ楽器で、数十年はめったに整数ではない場合は、正確なモデリングは、実験的に決定される数十年の正確な数を必要とします。これを行うには、メーカーが割り当てた相対強度較正した蛍光ビーズの混合物からのデータは、実験で使用したのと同じ検出器電圧を高く設定で取得されています。ビーズのピークの位置は、intの面で、対数スケールのキャリブレーションが可能にログディケード当たりensity範囲。具体的には、これは、メーカーが割り当てた値の対数に対して各ビーズ型のチャネル番号をプロットすることにより行われます。ビーズデータ値の最適な直線の傾きは、チャネルあたりの相対強度単位の数を与えます。チャネル数を乗じ、この値はその後の強度の2倍の減少（ すなわち 、娘世代間隔）に対応するチャンネルの数が14を計算することができ、そこからフルスケールのログ数十年、となります。 </li><li>世代間の固定間隔を使用するか、または間隔をフローティングにして使用するかを決定します。 標準 （固定）設定では、各世代の場所を割り当てるには、手順4.5で決定し、世代間隔値を使用し、ヒストグラムが明瞭なピークを欠いているときに一般的に使用されます。 フロート設定は、各世代のピーク位置がヒストグラム形状によって決定することができ、いつdistinguishabl一般的に使用されている電子世代のピークは明らかである。 </li><li>すべての世代またはフローティング幅に固定されたピーク幅を使用するかを決定します。固定幅は、すべての世代をモデル化するためにSDが刺激されていない対照サンプルに対して計算使用し、サンプルを区別世代のピークを欠いているときに一般的に選択されます。フローティング幅はプログラムが独立してそれぞれの世代のためにSDを変化させることができ、最高の区別世代ピークで使用されます。 </li><li>増殖解析モジュール（ここではModFit LTバージョン3.3）を含むプログラムを実行します。分析するデータセット（ 例えば 、 表1にチューブ8の場合と対比PKH26 POS細胞の刺激96時間培養）から刺激PKH26 posのファイルをロードします。 </li><li>この場合、現実的にゲートPKH26（585/42）（7-AAD NEG）CD3 posのリンパ球と小さな破片と大きな凝集体（ 図3）を除外するために、FSC対SSC中で、分析するためのパラメータを選択します。定義でこれらの領域は、爆発は、通常見られる高い前方散乱領域を含めるとCD3発現が刺激された培養物でダウン変調されてもよいことに注意するように注意してください。 </li><li>増殖ウィザードを使用して、新しい増殖モデルを作成します。 [データファイルを開く （[スタート]タブ）を使用して、非刺激PKH26 posの制御ファイルをロードし、分割されていないセルに対応する親の分布のピークチャンネルの位置を定義します。 </li><li>親ピークの位置と幅（標準偏差）の値に注意して、刺激されていないPKH26 POS制御用ファイルを分析します。一定のピーク幅（SD）が望まれる場合には、 ロックのSDをチェックします 。 </li><li> PKH26 ネガティブコントロール（ 例えば 、PKH26 neg細胞の96時間培養表1のチューブ7の場合と対比）をロードします。 PKH26 ネガティブコントロール上最も暗い世代のピークチャンネルを設定することにより、世代の数を調整します。これは、NUを決定モデルが正確に合うことができるの娘世代のmberとは、通常、6月9日の世代である。 </li><li>刺激を受けたサンプルのデータファイル（ 例えば 、 表1のチューブ8の場合と対比PKH26 posの細胞の刺激96時間培養）を開き、手順4.7で定義されている親のピーク位置とSDの領域が変わらないことを確認します。一定の世代間隔が望まれる場合には、 標準モデルオプションを選択し、それ以外のフローティングオプションを選択します。 </li><li>ステップ4.9で定義された同じモデルを使用して、データセット内の各実験ファイルを分析します。視覚的にも減少カイ二乗（RCS）の値で定義されるような親のピーク位置の微調整は非常に最高のフィット感のために必要であるかもしれません。 </li><li>データセット内の各実験ファイルに対するベストフィットに起因する目的の増殖メトリックを記録。可能なメトリックの包括的な説明については参考文献を参照してください。 22。 </li></ol>

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</ol>

K·ハンフリー、JD Tario、ジュニアとPKウォレスはライフテクノロジーズ社とBD Biosciencesから評価用にあらかじめ市販の細胞追跡試薬を受けています。 ADはBantlyとJSムーア各種CellVue細胞追跡色素の準商用特性評価のためのPTIリサーチ社からライフテクノロジーズ社と資金からの評価のために事前に市販の細胞追跡試薬を受けています。 K·ミュアヘッドは（Phanosテクノロジーズ社にコンサルティングサービスを提供しています（PKHとCellVue染料の所有者）とシグマアルドリッチと分子標的·テクノロジーズ株式会社のバックアップテクニカルサポートを提供してSciGro社によって採用されているこれらの代理店染料）。 この記事への生産とフリーアクセスは、Sigma-Aldrich社が主催しています。

ここで説明する方法は、それらの最も確実膜色素13,16,18と膜タンパク質または染料2,11,13,16のいずれかを使用して、リンパ球サブセットの表現型と増殖の追跡のために、使用してhPBMCラベリングのための最適な結果を与えるために、私たちの組み合わせの研究室で発見された18。 図1および図2に示すように、明るく均一な標識は最も容易に生理的塩の存在を制限し、混合技術を使用することによって達成される色素の同じ濃度にすべての細胞の急速な、均質な被ばくをもたらすこと。膜染料による染色は脂質二重層に分割することにより発生するため、無料の色素濃度を変更する他の変数は、標識効率に影響を与えることができます。たとえば、特に、管壁への吸着を染めるため減少し遊離染料濃度は前希釈液Cで再懸濁すると、塩の少ない効率的なウォッシュアウトで丸底ポリスチレンチューブ結果にラベリング低い染料濃度で。どちらの要素も円錐底ポリプロピレンチューブ（ 図3、図4、使用するラベルが実行されるときよりも広い染色分布を与える傾向がある 未発表データ）。最適化された染色手順が使用されている場合でも、サンプルの年齢やタイプもピーク幅に影響を与えることができる。たとえば、24時間古い血液サンプルまたはTRIMAフェレーシスフィルタ範囲から単離したリンパ球のCVに対し14から20パーセントから新たに採取した血液の範囲（ 図3、文献13および未発表の結果）から単離されたPKH26 posのリンパ球のCV 25から30から％（ 図4およびRef 18）。 染色の均一性と非生存細胞を解析から除外し、両方の区別娘のピークが順番に観測されたデータ（ 図5と図6に合わせて増殖モデルの選択に影響を与える色素希釈プロファイルで明白であるかどうかに影響を与えることができる程度</strong&gt;）。 ModFit（Verityのソフトウェアハウス、料理Topsham、MEは）そのような増殖指数と前駆周波数（ 図3、図5と図6、表3）のようなメトリックを生成するために使用されるソフトウェアの一例として、ここで使用されていますが、他のソフトウェアパッケージを使用すると、モジュールが分析する含まれてい増殖データ。これらを含めるFCSExpress（de novoのソフトウェア、ロサンゼルス、CA）およびFlowJo（ツリースター社は、オレゴン州アッシュランド）。これらのプログラムのすべては、反復的にシーケンシャル娘の世代を表すガウスピークの位置、高さ、およびSD（または幅）を変更することにより、生データへの最適解を非線形最小二乗分析を使用しています。増殖指数（PI）と前駆周波数（PF）は、増殖の程度の最も一般的に使用される指標です。 PIは、ModFitによって定義されるように、チミジン取り込みアッセイの &#39;刺激指数&#39;に類似アッセイの過程で細胞数の増加の尺度である。 PFは初期populat中の細胞の割合を返します増殖によって刺激に応答したイオン。用語は、ソフトウェアパッケージ（ 例えば 、FlowJoとModFitが&quot;増殖指数&quot;が何を意味しているかで異なる定義や計算を使用）22の間で多少異なりますので、文献を読む場合は注意が、しかし、お勧めします。 蛋白質の染料を使用した場合の膜色素で標識及び増殖分析のためにここで説明する重要な問題も発生しています。例えば、混合技法に細心の注意を払うも、CFSE（ 図6）2-4,13,18,24 を使用するときに均一な分布と区別娘のピークを得るために、死んだ/死細胞の排除とともに、遵守しなければなりません。表現型と生存率評価のための蛍光色素を適切に選択することは、特に、CFSE 2-4,11,13,16,18として可視発光タンパク質色素で、抗体陽性細胞を認識するために過度のスペクトルの重なりと不能を回避することも重要である</sup&gt;。トラッキング色素の濃度を減少させると隣接スペクトルチャネルに補償の問題を減少させるだけでなく、娘細胞強度が自家蛍光と重なるように開始する前に監視することができる細胞分裂の数を制限します。あるいは、このような遠赤色発光CellVueクラレットなどの新しいセルトラッキング色素（Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO）の使用または紫色発光CellTraceバイオレット（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、NY）は（ 図6）補償の問題を減らすことができます。膜染料は一般的にあまり毒性11,26を示す傾向があるものの、最終的に、それは染料のいずれかのクラスを持つオーバーラベル細胞への可能性があります。それが使用されるトラッキング色素の濃度が追跡する細胞の機能（ 図6）3,13,16,18 を変更していないことを確認するために常に必要がある。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や機器 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 市販品を購入する </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>アトランタバイオ</td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液（HBSS） </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 14175-079 </td><td>フェノールレッドを含まないカルシウムとマグネシウムを含まない、 </td></tr><tr><td>ヒトIgGコーン画分IIおよびIIIグロブリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD3-FITC </td><td> BD Biosciences社</td><td> 349201 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD4-APC </td><td> BD Biosciences社</td><td> 340672 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences社</td><td> 348799 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD8-FITC </td><td> BD Biosciences社</td><td> 347313 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD8-APC </td><td> Caltag（Life Technologies）を</td><td> MHCD0805 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD19-APC </td><td> Caltag（Life Technologies）を</td><td> MHCD1905 </td><t実験室での滴定により決定されるようにD&gt;飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD25-APC </td><td> BD Biosciences社</td><td> 340938 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD127-PE </td><td> BD Biosciences社</td><td> 557938 </td><td>実験室での滴定により決定される飽和濃度</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1.0 mg / mlで、アジ無料</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD28 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1.0 mg / mlで、アジ無料</td></tr><tr><td> PBS </td><td>ギブコ</td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH中10-3M PKH26および希釈剤Cを含有PKH26赤色蛍光細胞リンカーキット</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> PKH26GL-1KT または MINI26-1KT </td><td>ステップ1の手順も適用されますPKH67または他のCellVue染料を含有するキットへ</td></tr><tr><td> EtOHおよび希釈液Cで10-3M CellVueクラレットを含むCellVueクラレット遠赤色蛍光細胞リンカーキット</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> MINCLARET-1KTまたはMIDCLA​​RET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - （及び-6） - カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFDA-SE） </td><td> Invitrogen社（Life Technologies）を</td><td> C34554 </td><td>非蛍光性、形成する膜エステラーゼによって開裂蛍光アミノ反応性カルボキシスクシンイミジルエステル（CFSE） </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD修正可能なバイオレット</td><td> Invitrogen社（Life Technologies）を</td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td>円錐形の滅菌12×75ミリメートル ポリプロピレンチューブ＆キャップ</td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td>良い膜染料染色効率を（;上清吸引中に小さいセル損失低減色素吸着）を与える</td></tr><tr><td> 12×75ミリメートルroundの底 ポリスチレンチューブ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td> BD Bioscience社</td><td> FACSキャリバー LSRFortessa </td><td>とAPC EX、FITC、PKH26、および7-AAD（全角それぞれ520 nmの567 nm、および655 nmであり、例：488 nm）を検出することができ、任意のメーター。 633から640 nmで、EM。 660 nm）を</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>ベックマン·コールター</td><td> LSRIIシアン</td><td>とAPC EX、FITC、PKH26、および7-AAD（全角それぞれ520 nmの567 nm、および655 nmであり、例：488 nm）を検出することができ、任意のメーター。 633から640 nmで、EM。 660 nm）を</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ラボラトリー準備 </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D、 濃縮された株式</td><td> NA </td><td> NA </td><td> PBS中1 mg / mlである。 -20℃でアリコートとストアでフリーズ</td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D、 WOR王株式</td><td> NA </td><td> NA </td><td> PBS中での100μg/ mlの、1 mg / mlの凍結ストックから毎日用意しております。 </td></tr><tr><td> IgGをブロック</td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / mlのヒトIgGコーン画分IIおよびIIIグロブリン+ 10 mg / mlのBSA。 </td></tr></tbody></table>

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

蛍光細胞追跡色素は、流れやイメージサイトメトリーとの組み合わせで、in vitroおよび in vivo で異なる種類の細胞の相互作用と運命を研究するためにどのと、強力なツールです。1月5日このような染料を使用してパブリケーションの数千のいくつかは、文字通りありますが最も一般的に遭遇する細胞追跡アプリケーションはの監視が含まれます： <ol><li>幹細胞および前駆細胞休止、増殖および/ ​​または分化6月8日 </li><li>抗原ドリブン膜伝9および/ ​​または前駆細胞の増殖と3,4,10-18 </li><li>免疫調節およびエフェクター細胞機能1,18-21。 </li></ol>市販の細胞追跡色素は、それらの化学的性質と蛍光特性が大きく異なりますが、大多数の落下細胞標識のそれらのメカニズムに基づいて2クラスのいずれかに。 PKH26に代表される &quot;膜色素&quot;は、高親油性染料トンアール細胞膜1,2,11に安定しますが、非共有結合帽子パーティション。 CFSEに代表される&quot;タンパク質色素&quot;は、細胞のタンパク質4,16,18で安定な共有結合を形成するアミノ反応性染料である。各クラスには独自の利点と制限があります。彼らの成功を使用するための鍵は、特に複数の色素が異なる種類の細胞を追跡するために使用される多色の研究では、各クラス2-4,16,18,24の最適な利用を可能にする重要な問題を理解することである。 プロトコルは、細胞追跡色素を使用しているとき貧しいまたは変数の結果の3つの一般的な原因を強調ここに含まれています。これらは次のとおりである： <ol><li> 明るく、均一で再現性の標識を達成するために失敗しました 。これは、任意の細胞追跡研究のために必要な出発点であるが、タンパク質染料または抗体のような平衡結合試薬を用いた場合よりも膜の染料を使用して別の変数に注意を払う必要があります。 </li><li> 次善の蛍光色素の組み合わせND /または重要な報酬のコントロールが含まれて使用した場合。色素の蛍光を追跡することは、典型的には10 2 -抗体蛍光より10 3倍明るい。したがって、追跡用色素の存在が使用されている他のプローブを検出する能力が損なわれていないことを確認することが不可欠である。 </li><li> ピークモデリングソフトウェアとの良好なフィット感を得ることに失敗しました 。このようなソフトウェアは、前駆体の頻度や他のメトリックに基づいて、異なる集団または刺激を越え増殖応答の定量的な比較が可能になります。良いフィット感を得ること、しかし、色素希釈プロファイルを歪めると観測された色素希釈プロファイルの特性を持つモデルの基礎となる仮定のマッチングができる死んだ/死細胞の排除を必要とします。 </li></ol>ここに挙げた例は、細胞増殖をモニターするために、膜および/またはタンパク質の染料を使用している場合、これらの変数は結果に影響を与えることができる方法を示しています。

免疫細胞機能や増殖を監視するための細胞追跡用染料の使用の成功は、いくつかの重要な手順が含まれます。我々は、するための方法を説明します：1）膜染料と明るく、均一で、再現可能なラベルり得るステップと、2）蛍光色素とデータ収集条件を選択すると、3）色素希釈に基づいて、細胞増殖を定量化するためのモデルを選択する。

蛍光細胞トラッキング色素は、フローサイトメトリーおよびイメージサイトメトリーと組み合わせることで、...の相互作用や運命を研究するための強力なツールとなります。

本手法の総合的な目的は、細胞追跡染料を用いて、複雑な集団内における異なる免疫細胞サブセットの細胞分裂の程度を直接定量化することである。これはまず、細胞タンパク質に安定して結合するか、あるいは細胞膜に非共有結合的にインターカレートすることが知られている蛍光染料で親細胞集団をラベル化することで達成される。刺激に反応して追跡染料でラベル化された細胞を追跡し、蛍光抗体で染色した後にマルチパラメータフローサイトメトリーで分析することで、刺激された目的の免疫細胞タイプ間の反応の差を検出できる。一方で、追跡染料で染色していないコントロールを用いて、自家蛍光と区別できる娘細胞の最低蛍光強度を決定する。その後、追跡染料でラベル化されているが刺激されていないコントロールを用いて、分裂していない細胞が検出される蛍光強度を決定する。通常、刺激を与えると強度の幅が広くなる。これは、反応して増殖する細胞は次第に蛍光が弱くなるが、非反応細胞は弱くならないためである。最終的に、ピークモデリングソフトウェアを使用して異なる世代の細胞の相対頻度を推定することで、増殖指数や前駆細胞頻度などの指標を用いて、異なる集団や刺激に対する増殖反応を定量的に比較することが可能になります。トリチウム標識チミジンの取り込みやKI 67の発現といった既存の手法に対するこの技術の主な利点は、DI希釈によって細胞分裂を直接的に測定でき、それを免疫表現型解析やサイトカイン産生などの他のフローサイトメトリー測定と組み合わせることができる点にあります。細胞による染料の取り込みは極めて迅速であるため、膜染料染色の方法を視覚的に提示することが有用です。したがって、明るく均一な染色を得るには、適切な手技が重要です。ヒト末梢血単核細胞を分離した後、血小板の混入を最小限に抑えるため、室温にて 300 ×g で 5 分間遠心分離します。次に、ペレットを 1% BSA 含有 HBSS で 10⁷ cells/mL の濃度で再懸濁し、氷上に置きます。500 µLの分注液を取り出して保存し、さらに別の500 µLの細胞分注液を12 × 75 mmの円錐形ポリプロピレンチューブに移します。3.5 mLのHBSSを加え、室温、400 ×gで5分間遠心分離して細胞を沈殿させます。洗浄の間、PKH 26 GLキットの希釈液C（labeling vehicle）0.5 mLを別の12 × 75 mm円錐形ポリプロピレンチューブに加えておきます。細胞を採取しないよう注意しながら、上清を慎重に吸引し、残留液が15〜25 µL以下になるようにします。次に、細胞ペレットに0.5 mLの希釈液C（labeling vehicle）を加え、溶液の吸引と分注を数回繰り返して、単一細胞懸濁液にします。希釈液Cが入ったチューブにPKH 26を2 µL加え、2X XDストック溶液を調製します。その後すぐに、細胞懸濁液を調製したばかりの2X PKH 26染料溶液にピペッティングし、同時に混合液を数回吸引・吐出して、細胞を染料中に均一に分散させます。1分後、熱不活化血清を1 mL加えて、細胞膜への染料の取り込みを停止させます。遠心分離後、ペレットを除去しないように注意しながら上清を吸引します。次に、10%熱不活化血清を含む完全培地 4 mLでペレットを分散させ、細胞懸濁液を新しいポリプロピレンチューブに移します。HBSS + 1% BSAで細胞を2回洗浄します。十分に染色された細胞は、ペレットがはっきりとした桃色を呈します。細胞ペレットをHBSS + 1% BSA 1 mLで再懸濁した後、細胞数を計測し、最終濃度が10⁷ cells/mLになるように液量を調整します。表に記載されたフローサイトメトリーのプロトコルに従って細胞を染色した後、最初の5本のチューブを使用して、前方散乱光（forward scatter）と側方散乱光（side scatter）のパラメータ、および4つの蛍光検出器すべてにおけるシグナルを設定します。特に、チューブ2のPKH 26蛍光をモニタリングするために使用する検出器について確認します。すべてのPKH 26染色細胞が、スケール上で3〜4桁目の単一の対称ピークとして表示され、最終チャンネルに細胞がほとんどまたは全く存在しないことを確認してください。次に、カラー補正ソフトウェアとチューブ1から5で収集したリストモードファイルを使用し、他の3つのフルオロクロムをモニタリングするために使用している検出器の各蛍光色素について、カラーオーバーラップマトリックスを作成します。次に、このマトリックスをサンプル6のリストモードファイルに適用します。PKH 26のラベル化によって7-AAD陽性細胞の検出能が変化しないことを確認するため、今作成したカラーオーバーラップマトリックスをチューブ7のリストモードファイルに適用します。FE対PCプロット上で、CD3陽性CD4陰性およびCD3陽性CD4陽性の集団を特定します。anti-CD3、FE、およびanti-CD4 APCが存在しても、CD7陽性細胞を検出する能力に影響がないことを確認してください。最後に、チューブ7のカラーオーバーラップマトリックスをチューブ8のリストモードファイルに適用します。次に、増殖解析モジュールを含むプログラムを開きます。データセットから、解析対象となる刺激後のPKH 26染色ファイルをロードしてください。続いて、本解析におけるパラメータを選択します。ここでは、生存している7-AAD陰性およびCD3陽性のリンパ球でゲートをかけたPKH 26、および小さなデブリや大きな凝集塊を除外するための前方散乱光（FSC）対側方散乱光（SSC）を選択します。これらの領域を定義する際は、通常ブラスト細胞が見られる前方散乱（forward scatter）の高い領域が含まれるように注意してください。次に、増殖ウィザード（proliferation wizard）を開きます。「start」タブをクリックしてデータファイルを開き、未刺激のPKH 26陽性コントロールをロードします。未分裂細胞に対応する親ピークの位置を定義します。親ピークの位置と幅の値を記録しながらファイルを解析してください。ピーク幅を固定したい場合は、「lock SD」にチェックを入れ、PKH 26陰性コントロールをロードし、PKH 26陰性細胞よりも上に娘細胞世代のピークチャネルを設定して、世代数を調整します。これにより娘世代の数を設定します。完了後、モデルは正確に適合させることができます。刺激したPKH 26陽性ファイルを再読み込みしてください。世代ごとのピークが明確に区別できる場合は、モデルオプションでfloating設定を選択してください。ログ・デケードが正確に4.0でない場合は、本記事で述べた通り世代間間隔を調整してください。次に、刺激したサンプルを分析し、親ピーク位置の領域が変化していないことを確認してください。最後に、データセット内の各実験ファイルに対して「analyze」を選択し、作成したモデルを適用して、各ファイルの最適適合から得られる目的の増殖指標を記録します。この最初のデータシリーズは、混合手法が PKH 26 蛍光分布に及ぼす影響を示しています。培養されたU 9 37骨髄系細胞を、上述の方法を用いて細胞追跡染料で染色しました。最初のヒストグラムは、未染色のコントロールデータを示しています。サイトメーターの設定は、これらの細胞からの自家蛍光が第1デケードに位置し、第1チャンネルに蓄積する細胞がほとんどないか、全くないように調整されました。2番目のヒストグラムは、良好なPKH 26染色結果を示しています。2xの細胞と2xの染料を迅速に混合したところ、明るく均質で対称的な蛍光分布が得られましたが、前のヒストグラムで使用した装置設定においてスケール外となる細胞は見られませんでした。一方、2xの細胞を2xの染料に添加し、すぐに混合しなかった場合は、より不均質な蛍光分布が得られました。この弱く標識された細胞の小さなサブポピュレーションが、本実験の最終的なヒストグラムにおける後のタイムポイントに存在していた場合、娘細胞であると誤認される可能性があります。また、3 µLの濃縮エタノール染料ストックを0.5 mLの2x細胞懸濁液に誤って直接添加した際にも不十分な混合が起こり、極めて暗く右に歪んだ蛍光強度分布が得られました。ここでは、PKH 20で染色したヒト末梢血単核細胞を、刺激剤であるAnti CD3およびIL-2の有無で培養した増殖実験の典型的な結果を示します。96時間の培養後、細胞を回収し、anti CD3 PE、anti CD19 APC、および7-AADで対比染色を行いました。2つの異なるゲーティング戦略を比較しました。最初のゲーティング戦略では、CD3対CD7のドットプロットを用い、7-AADを用いて、生存している7-AAD陰性かつCD3陽性のT細胞を選択しました。次に、前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）領域を用いて、芽球化したリンパ球を保持しつつ、大きな凝集塊をゲーティングして除外しました。未染色のコントロールにおけるR1+R2ゲートイベントをグレーのヒストグラムで、PKH26染色済みで未刺激の細胞を青色で示しています。未刺激コントロールにおいて、生存しているが分裂していないT細胞が、明るく対称的で均質な染色を示していることに注目してください。これらのデータは前図と同様の手法でゲート設定されていますが、このケースでは細胞を抗CD3およびIL2で刺激しました。R1+R2ゲートイベントのPKH26ヒストグラムには、現在、主に分裂した細胞が含まれており、娘細胞の各世代に対応する色付きのピークによって強度の低下が示されています。青色の親細胞のピークには、まだいくつかの明るい未分裂細胞が残っています。高度に分裂した細胞の強度は、未染色細胞が測定される領域とはまだ重複していないことに注意してください。もし重複していれば、ここでの最低強度の子世代の細胞数に基づいた指標の推定が困難になります。データは前の2組の図と同様に分析されましたが、生存しているT細胞の選択にはライトスキャッター（前方散乱光）とCD3のみが使用されました。このゲーティング戦略では、CD3対7-AADドットプロットに残存する7-AAD陽性の死細胞の少数の集団で示されるように、多くの死細胞は除外されますが、すべてではありません。細胞追跡色素を使用する場合、分裂していない細胞の染色強度が極めて高いため、免疫表現型解析に使用する蛍光色素の選択によって、困難なコンペンセーション（補正）の問題が生じることがあります。本実験では、24時間経過した末梢血単核細胞をPKH26で標識し、その後、CD3およびCD4に対する抗体と生存率染料で対比染色を行いました。この一連のデータでは、2 µMのPKH 26で標識した細胞を、抗CD3 FITCおよび抗CD4 APCで対比染色し、前述と同様のR1+R2ゲーティング戦略を用いて解析した。PKH 26のAPCチャネルへの漏れ込みがほとんどなかったため、補正の有無にかかわらず、CD4陽性と陰性のイベントを明確に分離することができた。これらのデータは、最終的なPKH 26濃度を4 µMに上昇させた場合でも、生存しているCD3陽性CD4陽性T細胞が十分に分離されたままであることを示している。抗CD4 PerCPを抗CD3 FITCおよび2 µMのPKH 26、ならびに生存率染料のDAPIと組み合わせて使用したところ、PKH 26のPerCPチャネルへの顕著な漏れ込みにより、結果は大幅に悪化した。補正前のデータでは、CD4陽性細胞と陰性細胞を区別することはできず、補正後でもわずかに区別できる程度でした。PKH 26の最終濃度を4 µMまで上げると、補正後であってもCD4陽性イベントとCD4陰性イベントを区別する能力が完全に失われました。CPあたりの抗CD4抗体を含むサンプルと含まないサンプルが、実質的に同一であることに注目してください。色素希釈プロファイルをピークモデリングソフトウェアを用いて解析し、連続する娘細胞世代の細胞頻度を推定する場合、連続する娘ピークの位置および／または幅を、親ピークの値に対して固定または変動させることができます。これらの値は、未刺激コントロールから推定されます。例えば、この PKH 26 強度プロファイルは、中等度の反応を示した被験者の非刺激 96 時間培養細胞から得られたものであり、未分裂の親細胞を表すピークの位置と幅の初回推定値を mod fit 増殖ウィザードに提供するために使用されました。ピーク位置に固定設定（fixed setting）を使用する場合、各世代のピークの平均値は、前のピークの蛍光強度の正確に半分である必要があります。ピーク位置にフロート設定（float setting）を使用すると、最適なフィットを得るために必要に応じて、世代ピークの最終的な位置を期待される強度から変動させることができます。同様に、ピーク幅を固定設定（fixed setting）にする場合は、各世代のピーク幅を親世代または非刺激コントロールのピーク幅と同一にする必要があります。一方、ピーク幅を変動設定（float setting）にすると、この表で最適なフィットを得るために、最終的な幅を必要に応じて個別に変動させることができます。識別可能な世代別ピークが認められた2名の異なるドナーについて、前述の図の解析結果をここに示します。ピーク位置と幅の両方を変動させた場合に、最小の簡約カイ二乗値が得られました。世代ごとのピークが明確に識別できない増殖プロファイルについては、ピーク位置を固定設定にすることを推奨します。これらのデータは、フローサイトメトリーを用いた免疫抑制アッセイにおいて、2種類の追跡染料を使用して異なる免疫細胞種の増殖履歴を個別にモニタリングする方法を示しています。緑色で示されたエフェクターT細胞はCFSEで、青色で示された制御性T細胞はCellViewで標識されました。Claretで標識した細胞集団を様々な比率で混合し、anti CD3、anti CD28、および放射線照射した副細胞の存在下で96時間培養しました。その後、細胞を回収し、anti CD4、PE7-AD, およびLive/Dead Violetで染色しました。ここでは、Live/Dead Violet陽性細胞を除去（ゲーティング）した後の、Treg対T effector比が0.25:1の場合の代表的なデータを示しています。リンパ球および芽球を含み、凝集塊およびデブリを除外する前方散乱・側方散乱ゲートを適用し、続いてCD4陽性イベントを含めるゲートを設定した。CellView Claret染色により、生存Treg細胞を、高度に増殖してCFSE強度が低下した生存Tエフェクター細胞から容易に区別することができた。そのため、CFSE陽性Tエフェクター細胞およびCellView Claret陽性Treg細胞のCFSE DIM増殖プロファイルを、ModFit Peakモデリングソフトウェアを用いて解析した。約25,000イベントを解析した。これらのうち48%が生存しているTエフェクター細胞、6%が生存しているTreg細胞であり、残りは死細胞、副細胞、およびデブリであった。アッセイ期間中の細胞数の増加倍率を反映する算出増殖指数は、Tエフェクター細胞で3.85、Treg細胞で1.83であった。ここでは、CFSE色素希釈プロファイルから算出されたTエフェクター細胞の増殖指数に対するTreg細胞濃度の影響を示す。Treg細胞をCell View Claretで標識した場合と未染色のままであった場合で結果は同様であり、染色はTreg機能に影響を与えないことが示されました。追跡の結果、予想通り、Treg細胞の濃度を低下させるとT effector細胞の増殖範囲が増加しました。また、異なるTreg対T effector比におけるCell View Claret染料の希釈プロファイルから、Treg細胞の増殖指数を算出しました。予想通り、T effector細胞が存在しない場合、T effector細胞の濃度が増加してもTregsの増殖は最小限にとどまりました。しかし、Treg細胞の増殖の程度も同様に増加しました。ビデオを視聴することで、細胞追跡染料を用いて細胞増殖をモニタリングする方法、適切な蛍光色素とカラーコンペンセーションコントロールの選び方、そして染料の希釈に基づいて細胞分裂を定量化するための適切なモデルの選択方法について、十分に理解できたはずです。本手順に加え、抗原特異的T細胞の染色や、静止期または緩徐に分裂する幹細胞様細胞を回収するためのフローソートなど、実験的な疑問を解決するための他の手法を実施することが可能です。ご視聴ありがとうございました。

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