Name: 乳癌細胞株における細胞増殖を決定するための3つの異なる方法の比較 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: 学ぶ乳がん細胞株MCF-7における3つの細胞増殖測定法の比較。従来の細胞計数、ルミネッセンス法、細胞イメージャーを用いた手法の利点と欠点を解説し、研究目的に最適な方法選択の指針を提供する。

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形質導入されたMCF-7-LeGO細胞株の開発に協力してくださったハミッシュ・キャンベル博士とアントニー・ブレイスウェイト教授に感謝いたします。Bloomfield Group FoundationからHunter Medical Research Instituteを通じて資金提供を受けたことに感謝いたします。BCMは、ニューカッスル大学によるAPA奨学金と、ハンター医学研究所によるMMソーヤー奨学金によってサポートされています。

増殖アッセイのために1.準備細胞注：各メソッドを分析するために同じ形式で同じ方法及び種子中の2つの細胞株を準備します。 <ol><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したフェノールレッドフリーのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いてT 75cm 2の組織培養フラスコ中で75％〜80％コンフルエンスに7個の細胞を、MCF-7、レゴとMCF-7Δ40p53成長、200 mMのL-グルタミン、2 / mlのインスリン、5％CO 2で37℃を1μg/ mlのピューロマイシン。滅菌安全キャビネットクラスIIで細胞を処理します。 注：これは、コンフルエンスまで細胞を増殖するのにかかる時間は、播種希釈によって異なり。増殖アッセイのために細胞をプレーティングするための準備では、1で細胞を播種する：補充したDMEM中で3希釈し、75から80までパーセントの集密度になるまで3日間、通常の増殖条件下で維持します。 </li><li>メディアを捨てる、フラスコから細胞を除去するために、廃棄物容器。直ちに予熱2×トリプシン2mlの細胞層を洗浄します。吸引し、トリプシン。 5％CO 2で37℃で5分間インキュベーター中に細胞層及び場所に予め温めておいたトリプシンのさらに2 mlを加え。 <ol><li>細胞がデタッチしたら、新鮮な補充DMEMを温め10ミリリットルで細胞を洗浄。室温で5分間、491×gでの滅菌15mlチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を転送します。慎重に吸引し、上清を廃棄。 </li></ol></li><li>新鮮な補充したDMEM 5 mlに細胞ペレットを再懸濁します。 96ウェルプレートに細胞を播種するために適切な濃度を決定するために、細胞計数を行います。 <ol><li> 900μlの1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中100μlの細胞懸濁液を希釈します。自動セルカウンターの上に新しい60μmのセンサーを配置します。プランジ​​ャーを押しながら、希釈した細胞懸濁液にセンサーを沈めます。ゆっくりセルカウンターでプランジャーを解放します。細胞COUからセンサーを削除しますNTER完了したとき。 注：細胞数は、細胞/ mlで細胞計数器に表示されます。 </li></ol></li><li> 3~5日間にわたって増殖の細胞増殖および測定のための余地を可能にするため〜20％コンフルエントで96ウェルプレート中（DMEM中）を100μlの最終容量で種子細胞（ 表1参照）。三連ですべての細胞株をシード。 注記：この実験では、三つの異なる細胞密度は、最適な細胞密度を決定するために評価しました。必要な細胞数を表1に要約されている。種子細胞を低密度で、より長期的な成長の測定が必要な場合。 <ol><li>血球計数器と発光ベースアッセイのために、（ すなわち、アッセイあたり4プレート）の時点ごとに一つのプレートを準備します。細胞イメージャアッセイのために、実験期間中のみ1のプレートを準備します。 </li></ol></li><li> 24時間、5％CO 2で37℃で細胞を維持します。 </li></ol> 2.決定セルはおカウント血球計数器をる<ol><li>前加温培地および細胞培養インキュベーター、オーブンもしくは水浴中で37℃でトリプシン両方。廃棄物容器への細胞から培地を吸引は、2倍のトリプシン30μlの1回洗浄し、トリプシンを吸引します。 </li><li> 2倍のトリプシン30μlので再び細胞を洗浄し、37℃で5分間インキュベートします。静かにプレートから細胞を取り除くために、プレートの端をタップします。補充したDMEMの50μlを添加し、細胞を単一細胞懸濁液を形成するまで、ピペッティングにより細胞を混ぜます。 </li><li> 70％エタノールで表面とガラスカバーを洗浄することにより、血球計数器を準備します。 </li><li>計数室の上にガラスカバースリップを置き、「ニュートンの屈折リングは「カバースリップエッジと血球計数器との間で見ることができるようになるまで貼ります。 注：これらは、カバースリップが正しく血球計数器に付着したことを示しています。 </li><li>ゆっくり毛管運動によって計数室を埋め、カバースリップの下での細胞懸濁液20μLをピペット。顕微鏡の10倍の倍率で血球計数器を置き、グリッドレイアウト内の計数室を可視化します。 </li><li>グリッドレイアウトの4外側の正方形のセルをカウントします。精度を向上させるために、付加的な外側の正方形の反復回数が必要、またはカウントまで70に達した場合- 100セル14,15。 <ol><li>次のように1ml当たり細胞濃度を計算します。正方形のx希釈倍率ごとの平均細胞数（使用する場合）10 4を xは</li></ol></li><li>繰り返しは、2.1から2.8まで24時間毎に96時間、播種後の手順。 </li></ol> 3.発光ベースのアッセイを用いて細胞増殖を決定します注：これは、エンドポイントの測定です。試薬が細胞に添加されると、プレートは一度だけ定量することができます。 <ol><li> 30分間22℃の水浴中で解凍発光試薬。 </li><li>静かに均質な混合を得るために、ボトルを反転させることにより、試薬を混ぜます。 </li><li>ステップから（播種した細胞の一方のプレートを平衡化1.5）で30分間室温で。 </li><li>各ウェルに発光試薬を100μlを追加します。 2分間オービタルシェーカー上のコンテンツを混ぜます。プレートを室温で10分間インキュベートすることができます。 </li><li>マルチモードプレートリーダーソフトウェアを使用して発光実験を設定します。 <ol><li>マルチモードプレートリーダーをオンにして、ソフトウェアを開きます。 「タスクマネージャ」で、「実験」を選択し、ファイル &#39;new&#39;.Select作成&#39; &#39;側のツールバーからを、そして下の「プロトコル手順を&#39; &#39;タブを選択」。 </li><li> 「グルニエ96平底「プレートのタイプを選択し、「使用のふた」チェックボックスをオンにします。 「読み取り方法]ボックスの下の「読み取り」アクションを選択します。 「ルミネセンス」検出方法を選択します。 「OK」をクリックします。 </li><li>読み出しステップ]ボックスで、「完全版」タブでスキャンする井戸を選択して、などのブランクウェルとして作用することが井戸を選択します。 </li><li> （：穴、ミラー：なし例えば 、プラグ、エム）空のフィルタに設定されたフィルタを設定します。にゲインを設定します135、ウェル当たり0.5秒の積分時間6.5ミリのリード高さを有します。発光読み取りのための設定を保存し、「OK」をクリックします。 </li></ol></li><li>発光読み取りを実行します<ol><li> 「計測器制御」タブを選択することにより、プレートホルダーを取り出し、「蓋を確保する上で、プレートホルダーに96ウェルプレートをout&#39;.Placeプレートをクリックしてください。 「計測器制御]タブの[内プレート」をクリックすることで、プレートホルダーを閉じます。発光読み取りを実行するには、ツールバーから「今すぐ読み」をクリックします。 </li><li>よくさらなる分析のためにスプレッドシートにそれぞれの相対発光単位（RLU）の測定値をエクスポートします。 </li></ol></li><li>繰り返しは、細胞を播種した後、増殖を96時間に24時間毎の最大を記録するために3.1から3.6を繰り返します。 </li></ol> 4.セルイメージャーを用いて細胞数を決定します<ol><li>マルチモードセルイメージャー・ソフトウェアを用いた細胞イメージング実験のセットアップ<ol><li>マルチモードセルイメージャとオープン番目をオンにします電子ソフトウェア。 </li><li> 「タスクマネージャ」で、「実験」タブを選択し、ファイル &#39;new&#39;.Onを作成する&#39; &#39;ツールバー、をクリックして「プロトコル」タブを開いて「プロシージャ&#39; tab.Select「設定温度」アクション。 「ON」にインキュベーターを設定し、37℃に温度を設定し、次のステップ」のボックスを続行する前に、「予熱」を確認してください。設定を保存するには、「OK」をクリックします。 </li><li> 「読み取り」アクションを選択します。 「画像」検出方法をクリックして「エンドポイント/運動「読み取りタイプと「フィルタ」の光学系のタイプを選択します。フルプレート]タブ」をOK&#39;.Click」をクリックして、画像化されるプレート上のウェルを選択します。設定を保存するには、「OK」をクリックします。 </li><li> 「目標」オプションのドロップダウンから2.5倍の対物レンズを選択します。 GFP 469、525及びブライトフィールド：「チャンネル」タブで、2つのチャネルを選択します。両方のチャネルは &#39;auto&#39;で露出を確認し、十分に自動露出を選択します。 </li><li> AUTを決定するために、Oフォーカスの設定は、「オートフォーカス」を選択し、「オプション」をクリックします。オートフォーカスのオプションについては、「スキャンした後、オートフォーカス」メソッドを選択します。設定を保存するには、「OK」をクリックします。 </li><li>水平方向の間隔（μm）で= 2881および垂直方向の間隔（μm）と= 2127で、3×2モンタージュにウェル当たり複数の画像をスキャンする0.Selectするウェル（ミクロン）の中心から水平および垂直方向のオフセットを設定します。手順の設定を保存するには、「OK」をクリックします。 注：読み取りパラメータについては、 表2を参照してください。 </li></ol></li><li>選択されたプレート上で読むの実験を行います<ol><li> 「機器制御」タブをクリックして、蓋がオンになっている確保し、プレートホルダーでfunction.Place 96ウェルプレートを「プレートアウト」を選択します。 「計測器制御]タブで、関数 &#39;でプレート」を選択します。選択プレートタブから「今読んで」。 96時間後に播種し24時間毎のアップを読んで繰り返します。 </li></ol></li><li>用いた細胞数の分析セルイメージャソフトウェア。 <ol><li>画像を分析するために、画像形成されたプレート上で「データ」タブをクリックし、選択し &quot;画像[GFP 469、525 +明視野] &#39;。よく撮像された上でダブルクリックします。 </li><li>ロードされた画像をクリックしてください。選択して「分析」と分析するモンタージュの単一のイメージを選択します。 GFP「OK&#39;.Check「クリック」だけチャネル、および表3に概説のように設定したパラメータを。クリックして「画像化された細胞にパラメータを適用するには、START &#39;を。 </li><li>画像あたりの細胞数を決定するために使用される画像化された細胞上に置か細胞計数マスクを観察します。 「変更を適用」と実験を通して撮像された各プレートのために、これらの設定を維持する]をクリックします。 </li><li>いったん戻って画像形成されたプレートで、「データ」のドロップダウンメニューを選択し「細胞数」をクリックします。これは、ウェル当たりの総細胞数を生成します。 </li><li>さらなる分析のoには、「エクスポート」タブをクリックすることにより、スプレッドシートにすべてのデータをエクスポートします。ウェル当たり細胞数F。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+p53%2C+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer. p53, guardian of the genome.</a> Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf">https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf</a> 1-12 (2011).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

このプロトコルでは、培養細胞における細胞増殖を測定する3つの異なる方法を検討しました。それぞれの方法は、96時間にわたる細胞増殖の再現性と正確な測定が可能であった、その結果は（ 図2及び3）試験方法の各々の間で同等でした。発光ベースのアッセイ及び細胞イメージング法の両方が、96時間後の細胞増殖の線形増加を示し、最も堅牢な結果が得られた（ 図2B、C）。さらに、経時細胞イメージングは、形質導入および非形質導入細胞株（ 図4）との間の成長率に有意差を示しませんでした。 多くの利点と欠点は、このプロトコルで調べ、それぞれの方法のためにありますが、概要については、 表5を参照してください。血球計数器を用いた従来の細胞計数法は非常に少ない追加の試薬またはeffoを必要とする低コストの方法でありますrtが準備して実行します。さらに、この方法は、細胞/ mlで14における絶...

腫瘍抑制遺伝子は、p53は、細胞周期停止、アポトーシス及び老化1を含む細胞プロセスの多数の重要な調節因子です。これは、ゲノムの安定性を維持する責任があり、したがって、細胞死と細胞増殖のバランスを維持するために重要です。 p53の突然変異は、癌において一般的であり、制御されていない癌細胞の増殖を2につながるp53の不活性化の主な原因です。興味深いことに、p53の中の変異は、唯一の他のメカニズムがp53機能の喪失の原因であることを示唆し、乳癌3の約25％を占めています。最近発見されたp53のアイソフォームは、ヒト癌の多数において過剰発現されることが示されており、p53機能4,5を調節することができます。我々は、p53のアイソフォーム、Δ40p53は、乳癌において最も高度に発現されるアイソフォームであることが以前に示されており、正常な隣接TISSと比較した場合に有意に、乳癌細胞において上方制御されますUE 6。その後、我々は、安定レゴ-IG2-puroを+ベクターを用いΔ40p53（GFP +）の7を過剰発現するMCF-7ヒト乳癌細胞株を形質導入しました。これらの細胞は高いΔ40p53発現が乳癌細胞の細胞増殖率を増加させるかどうかを調べるために使用しました。 インビトロ 8,9 で培養した細胞の細胞増殖を測定する多くの直接的及び間接的な方法があります。これらは、時間の経過とともに連続測定として、またはエンドポイントアッセイ10のいずれかに行うことができます。従来の方法は、血球計数器を用いて細胞計数として、依然として有用です。このアッセイは、低コストと細胞数の直接の尺度であるが、それは数からの誤差と大きな標準偏差を最小にするために大規模な細胞数と高度に熟練した訓練に依存しません。ハイスループットフォーマットと互換性のある測定を行う必要がマルチウェルプレートアッセイの開発につながっています。これらの発光ベースアッセイmeasuセル11,12の代謝活性に比例する発光シグナルに基づいて、細胞数の再。より最近では、高含量のイメージングプラットフォームの導入は、定量的及び定性的な表現型データ収集を提供しつつ、細胞増殖をモニターする新しいツールを許可し、システム13の様々な含まれています。これらの方法の全ては、連続測定またはエンドポイントアッセイのいずれかによって、細胞増殖を測定するための手段を提供し、それぞれの感度、サンプル番号のスループット、およびセル情報に関して利点と欠点の範囲を有し、によって適宜計量することができるすべてが研究の質問に。 このプロトコルは、それぞれの方法は、感度、再現性、およびマルチウェルプレートフォーマットの異なる範囲を用いて、in vitroで細胞増殖を測定するための3つの異なる方法を記載しています。このプロトコルは、茶をカウント血球計数器の使用を比較することを目的としましたmber、96時間の時間経過にわたって細胞増殖の測定における発光に基づく細胞生存率アッセイ、および細胞イメージャ。これを行うには、ベクター形質導入細胞（MCF-7-LEGO）の成長は、3つの異なる細胞密度を使用して、Δ40p53（MCF-7-Δ40p53）を過剰発現するように形質導入​​された細胞と比較しました。細胞増殖は、最大96時間ごとに24時間測定しました。それぞれの方法は、それ自身の利点と欠点を有することが見出され、実験の目的に応じて、各々が依然として増殖の速度についての情報を提供するための有益な方法で行いました。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム、フェノールレッドなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21063-045</td><td>10%FBS、200 mM L-グルタミン、2 &micro;g / mlインスリンと1 &micro;g/ml ピューロマイシン</td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液 (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>インスリン溶液 ヒト</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン二塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>0.5% トリプシン-EDTA 溶液 (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)</td>で2倍に希釈します<td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ、75 cm2 成長領域</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Cell Counter</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>Automated Cell counter</td></tr><tr><td>96 well multiwell plate,平底</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>改良型ノイバウアー血球計算盤</td><td>BOECO ドイツ</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス IX51 倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 アッセイ</td><td>プロメガ</td><td>G9242</td><td>ルミネッセンスベースのアッセイ</td></tr><tr><td>Cytation 3 セルイメージング マルチモードリーダー</td><td>BioTek</td><td></td><td>発光、蛍光用プレートリーダーおよび明視野細胞イメージング</td></tr><tr><td>Gen5データ解析ソフトウェア</td><td>BioTek</td><td>GEN5</td><td></td></tr></tbody></table>

乳癌細胞株における細胞増殖を決定するための3つの異なる方法の比較

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

細胞増殖の測定は、それぞれが異なるレベルの感度、再現性、およびハイスループットフォーマットとの互換性を持ついくつかの異なる方法で行うことができます。このプロトコルは、従来の血球計算盤計カウントチャンバー、生存細胞の代謝活性の変化を細胞の相対数の尺度として利用する発光ベースのアッセイ、およびカウントアルゴリズムを使用して細胞数を測定するマルチモードセルイメージャーを含む、in vitroで細胞増殖を測定するための3つの異なる方法の使用について説明しています。各方法には、時間、コスト、ハイスループット適合性など、細胞増殖の測定に関する独自の長所と短所があります。このプロトコルは、各方法が経時的な細胞増殖を正確に測定でき、異なる細胞密度での成長を検出する感度が高いことを示しています。さらに、セルイメージャーを使用した細胞増殖の測定により、形態、コンフルエンスなどのさらなる情報を得ることができ、細胞増殖の経時的な継続的なモニタリングが可能になりました。結論として、どちらの方法も細胞増殖を測定することができますが、どの方法を選択するかはユーザーによって異なります。

培養された細胞の増殖を測定する別の方法を研究するために、MCF-7Δ40p53形質導入細胞の細胞増殖は、非形質MCF-7レゴ乳癌細胞株と比較しました。比較された三つの方法-従来の血球計数法、細胞生存率発光アッセイ、及び概略図（ 図1）に概説されている解析-細胞イメージング。それぞれの方法にも長所と短所が正確に時間をかけて細胞計数を測定することがあり、最も効果的な方法は、実験や細胞集団のために取得できる情報のエンドポイントの要件に依存します。 MCF-7-LEGOおよびMCF-7-Δ40p53細胞の増殖を、4日間24時間後に測定しました。 図1に示すように 、2つの細胞株は、3つの異なる細胞密度で播種した（1.5×10 3 </s&gt;アップ。 3×10 3。 5×10 3細胞/ウェル...

このプロトコルは、乳がん細胞株における細胞増殖を解析するための3つの異なる方法の使用を説明しています。これには、従来の細胞計数、発光ベースの細胞生存率、および細胞イメージャーの使用による細胞計数の使用が含まれます。それぞれに、細胞増殖の再現性のある測定に利点があります。

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

このデモンストレーションの全体的な目的は、3種類の異なる細胞増殖アッセイを比較し、それぞれの方法の利点と欠点を提示することです。この手法は、最も適切な細胞増殖法の選択など、がん研究分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。細胞イメージングの手順を習得するのは困難であるため、本手法の準備は極めて重要です。適切な細胞計数マスクを適用する前に、細胞に焦点を合わせる必要があります。この手順を開始するには、フェノールレッドフリーのDMEMを用い、T75平方センチメートルの組織培養フラスコでMCF-7細胞株2株を3日間培養し、コンフルエンスを75〜80%まで高めます。3日後、培地を廃棄容器に捨てて、フラスコから細胞を除去します。次に、あらかじめ加温した2倍濃度のトリプシン2 mLで細胞層を直ちに洗浄します。トリプシンを吸引し、さらにあらかじめ加温したトリプシン2 mLを細胞層に加えてから、インキュベーターに入れます。細胞が剥離したら、加温した新鮮なサプリメント添加DMEM 10 mLで細胞を洗浄します。次に、細胞懸濁液を滅菌済みの15 milliliterチューブに移し、室温で5分間遠心分離します。5分後、上清を注意深く吸引して廃棄します。その後、細胞ペレットを5 millilitersの新鮮な添加済みDMEMで再懸濁します。細胞数を計測するために、100 µLの細胞懸濁液を900 µLの1× DPBSで希釈します。次に、新しい60 µmセンサーを自動細胞カウンターに取り付けます。プランジャーを押し下げたまま、希釈した細胞懸濁液にセンサーを浸します。セルカウンターのプランジャーをゆっくりと戻します。完了後、セルカウンターからセンサーを取り除きます。細胞の増殖スペースを確保し、3〜5日間にわたる増殖測定を行うため、96ウェルプレートに最終容量100 µLで、コンフルエンシー約20%になるように細胞を播種します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を測定するために、培地とトリプシンの両方を細胞培養インキュベーター、オーブン、またはウォーターバスで37 °Cに予熱します。次に、細胞から培地を吸引し、廃棄容器に入れます。その後、2倍濃度のトリプシン30 µLで1回洗浄し、再び培地を吸引して廃棄容器に入れます。次に、2倍濃度のtrypsin 30 µLで細胞を再度洗浄し、37 °Cで5分間インキュベートします。プレートの縁を軽く叩いて細胞を剥離させます。その後、DMEM（添加物入り）50 µLを加え、ピペッティングにより細胞を混ぜ合わせ、単一細胞懸濁液にします。ガラスカバーのスリップを計数室の上に置き、カバーのスリップの端とヘモサイトメーターの間にニュートンリングが見えるまで固定します。次に、細胞懸濁液 20 µL をカバーのスリップの下に注意深くピペットで注入し、毛細管現象によって計数室が満たされるようにします。その後、10倍の倍率でグリッドレイアウトの計数室を観察します。この手順では、発光試薬を22 °Cのウォーターバスで30分間解凍します。ボトルをゆっくりと反転させ、均一に混合してください。その後、細胞を播種したプレート1枚を室温で30分間静置し、温度を平衡化させます。その後、各ウェルに100 µLのルミネッセンス試薬を加えます。オービタルシェーカーで2分間混合します。次に、プレートを室温で10分間インキュベートします。マルチモードプレートリーダーソフトウェアを使用してルミネッセンス実験を設定するには、マルチモードプレートリーダーの電源を入れ、ソフトウェアを起動します。タスクマネージャーで「Experiments」を選択し、「Create New」をクリックします。次に、サイドツールバーから「File」を選択し、「Protocol」タブの下にある「Procedure」を選択します。次に、プレートタイプとしてGreiner 96 flat bottomを選択し、「Use Lid」ボックスにチェックを入れます。「Read method」ボックスで「Read」アクションを選択してください。続いて、検出方法として「Luminescence」を選択し、「OK」をクリックします。「Read Step」ボックスの「Full Plate」タブでスキャンするウェルを選択し、ブランクウェルとして使用するウェルを選択してください。フィルターセットを「Empty Filter」に設定します。ゲインを135に、1ウェルあたりの積分時間を5秒に、読み取り高さを6.5 millimetersに設定します。OKをクリックして、ルミネッセンス読み取りの設定を保存します。ルミネッセンス測定を行うには、[Instrument Control]タブを選択して[Plate Out]をクリックし、プレートホルダーを排出します。蓋が付いていることを確認した上で、96ウェルプレートをプレートホルダーに設置します。[Instrument Control]タブの[Plate In]をクリックして、プレートホルダーを閉じます。次に、ツールバーのRead Nowをクリックして、ルミネッセンス測定を行います。その後、各ウェルのRLU測定値をスプレッドシートにエクスポートし、さらなる解析に利用します。細胞イメージング実験をセットアップするには、マルチモード細胞イメージャーの電源を入れ、ソフトウェアを起動してください。タスクマネージャーで、「Experiments」タブを選択し、「Create New」をクリックします。ファイルツールバーで、「Protocol」タブを選択し、次に「Procedure」タブをクリックします。「Set Temperature」アクションを選択してください。インキュベーターをOnに設定し、温度を37 °Cに設定します。Preheatにチェックを入れ、OKをクリックして設定を保存します。次に、Readアクションを選択します。検出方法として「Image」をクリックします。次に、読み取りタイプに「Endpoint/Kinetic」を、光学タイプに「Filters」を選択し、「OK」をクリックします。その後、「Full Plate」タブをクリックし、画像化するプレート上のウェルを選択します。「OK」をクリックして設定を保存します。次に、「Objectives（対物レンズ）」のドロップダウンオプションから2.5倍の対物レンズを選択します。「Channels（チャンネル）」タブで、GFP 469.525とBright Fieldを選択します。両方のチャンネルでAuto Exposure（自動露光）にチェックを入れ、自動露光を行うウェルを選択します。オートフォーカスの設定を決定するには、[Options]をクリックします。オートフォーカスのオプションで、[Scan]メソッドを選択し、次に[auto focus]を選択します。[OK]をクリックして設定を保存します。その後、ウェルの中心からの水平および垂直方向のオフセットをゼロに設定します。1ウェルあたり3×2のモンタージュで複数画像をスキャンするように選択します。次に、[OK]をクリックして、プロシージャの設定を保存します。選択したプレートの実験値を読み取るには、[Instrument Control]タブをクリックし、[Plate Out]機能を選択します。蓋がついていることを確認し、96ウェルプレートをプレートホルダーに設置します。[Instrument Control]タブで、[Plate In]機能を選択します。次に、プレートタブからRead Nowを選択し、播種後96時間まで24時間ごとに測定を繰り返します。画像を解析するには、撮影したプレートのDataタブをクリックし、Picture GFP 469, 525 plus Bright Fieldを選択します。その後、撮影されたウェルをダブルクリックします。次に、読み込んだ画像をクリックします。[Analyze]を選択し、解析対象となるモンタージュ内の単一画像を選択してください。続いて、[OK]をクリックします。その後、GFPチャンネルのみにチェックを入れ、表3に概説されている通りにパラメータを設定します。その後、[Start]をクリックして、撮像した細胞にパラメータを適用します。画像上の細胞に配置されたセルカウントマスクを確認してください。これは、画像あたりの細胞数を決定するために使用されます。[Apply Changes]をクリックし、実験全体を通じて撮像する各プレートでこれらの設定を維持してください。この図では、MCF-7-LeGO細胞およびMCF-7-delta 40p53細胞における細胞増殖を測定するために検討した異なる手法間の相関関係を比較するため、線形回帰分析を行いました。ピアソンの相関係数を算出し、細胞増殖を測定する異なる手法間の有意性を判定しました。その結果、ルミネッセンスベースのアッセイとセルイメージャーの比較において、最も強い相関が観察されました。ここでは、細胞がほぼ100%コンフルエントになるまで24時間ごとにセルイメージャーで撮影した、GFP陽性のMCF-7-LeGOおよびMCF-7-delta 40p53乳がん細胞の代表的な画像を示しています。この手法は、数日間にわたる細胞増殖の視覚的なモニタリングや、異なる細胞株間での細胞サイズおよび細胞形態の比較など、有用な細胞情報を提供します。検証した各手法の長所と短所のまとめをここに示します。これにより、各手法の汎用性が明らかになり、読者が最も適切な手法を選択する際の助けとなります。このビデオを視聴することで、3つの異なる細胞増殖アッセイについて十分に理解し、ご自身の実験計画に最適なものを判断できるようになります。

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学ぶ乳がん細胞株MCF-7における3つの細胞増殖測定法の比較。従来の細胞計数、ルミネッセンス法、細胞イメージャーを用いた手法の利点と欠点を解説し、研究目的に最適な方法選択の指針を提供する。

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