乳癌細胞株における細胞増殖を決定するための3つの異なる方法の比較

このデモンストレーションの全体的な目的は、3種類の異なる細胞増殖アッセイを比較し、それぞれの方法の利点と欠点を提示することです。この手法は、最も適切な細胞増殖法の選択など、がん研究分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。細胞イメージングの手順を習得するのは困難であるため、本手法の準備は極めて重要です。

適切な細胞計数マスクを適用する前に、細胞に焦点を合わせる必要があります。この手順を開始するには、フェノールレッドフリーのDMEMを用い、T75平方センチメートルの組織培養フラスコでMCF-7細胞株2株を3日間培養し、コンフルエンスを75〜80%まで高めます。3日後、培地を廃棄容器に捨てて、フラスコから細胞を除去します。

次に、あらかじめ加温した2倍濃度のトリプシン2 mLで細胞層を直ちに洗浄します。トリプシンを吸引し、さらにあらかじめ加温したトリプシン2 mLを細胞層に加えてから、インキュベーターに入れます。細胞が剥離したら、加温した新鮮なサプリメント添加DMEM 10 mLで細胞を洗浄します。

次に、細胞懸濁液を滅菌済みの15 milliliterチューブに移し、室温で5分間遠心分離します。5分後、上清を注意深く吸引して廃棄します。その後、細胞ペレットを5 millilitersの新鮮な添加済みDMEMで再懸濁します。

細胞数を計測するために、100 µLの細胞懸濁液を900 µLの1× DPBSで希釈します。次に、新しい60 µmセンサーを自動細胞カウンターに取り付けます。プランジャーを押し下げたまま、希釈した細胞懸濁液にセンサーを浸します。

セルカウンターのプランジャーをゆっくりと戻します。完了後、セルカウンターからセンサーを取り除きます。細胞の増殖スペースを確保し、3〜5日間にわたる増殖測定を行うため、96ウェルプレートに最終容量100 µLで、コンフルエンシー約20%になるように細胞を播種します。

ヘモサイトメーターを用いて細胞数を測定するために、培地とトリプシンの両方を細胞培養インキュベーター、オーブン、またはウォーターバスで37 °Cに予熱します。次に、細胞から培地を吸引し、廃棄容器に入れます。その後、2倍濃度のトリプシン30 µLで1回洗浄し、再び培地を吸引して廃棄容器に入れます。

次に、2倍濃度のtrypsin 30 µLで細胞を再度洗浄し、37 °Cで5分間インキュベートします。プレートの縁を軽く叩いて細胞を剥離させます。その後、DMEM（添加物入り）50 µLを加え、ピペッティングにより細胞を混ぜ合わせ、単一細胞懸濁液にします。

ガラスカバーのスリップを計数室の上に置き、カバーのスリップの端とヘモサイトメーターの間にニュートンリングが見えるまで固定します。次に、細胞懸濁液 20 µL をカバーのスリップの下に注意深くピペットで注入し、毛細管現象によって計数室が満たされるようにします。その後、10倍の倍率でグリッドレイアウトの計数室を観察します。

この手順では、発光試薬を22 °Cのウォーターバスで30分間解凍します。ボトルをゆっくりと反転させ、均一に混合してください。その後、細胞を播種したプレート1枚を室温で30分間静置し、温度を平衡化させます。

その後、各ウェルに100 µLのルミネッセンス試薬を加えます。オービタルシェーカーで2分間混合します。次に、プレートを室温で10分間インキュベートします。

マルチモードプレートリーダーソフトウェアを使用してルミネッセンス実験を設定するには、マルチモードプレートリーダーの電源を入れ、ソフトウェアを起動します。タスクマネージャーで「Experiments」を選択し、「Create New」をクリックします。次に、サイドツールバーから「File」を選択し、「Protocol」タブの下にある「Procedure」を選択します。

次に、プレートタイプとしてGreiner 96 flat bottomを選択し、「Use Lid」ボックスにチェックを入れます。「Read method」ボックスで「Read」アクションを選択してください。続いて、検出方法として「Luminescence」を選択し、「OK」をクリックします。「Read Step」ボックスの「Full Plate」タブでスキャンするウェルを選択し、ブランクウェルとして使用するウェルを選択してください。

フィルターセットを「Empty Filter」に設定します。ゲインを135に、1ウェルあたりの積分時間を5秒に、読み取り高さを6.5 millimetersに設定します。OKをクリックして、ルミネッセンス読み取りの設定を保存します。

ルミネッセンス測定を行うには、[Instrument Control]タブを選択して[Plate Out]をクリックし、プレートホルダーを排出します。蓋が付いていることを確認した上で、96ウェルプレートをプレートホルダーに設置します。[Instrument Control]タブの[Plate In]をクリックして、プレートホルダーを閉じます。

次に、ツールバーのRead Nowをクリックして、ルミネッセンス測定を行います。その後、各ウェルのRLU測定値をスプレッドシートにエクスポートし、さらなる解析に利用します。細胞イメージング実験をセットアップするには、マルチモード細胞イメージャーの電源を入れ、ソフトウェアを起動してください。

タスクマネージャーで、「Experiments」タブを選択し、「Create New」をクリックします。ファイルツールバーで、「Protocol」タブを選択し、次に「Procedure」タブをクリックします。「Set Temperature」アクションを選択してください。

インキュベーターをOnに設定し、温度を37 °Cに設定します。Preheatにチェックを入れ、OKをクリックして設定を保存します。次に、Readアクションを選択します。

検出方法として「Image」をクリックします。次に、読み取りタイプに「Endpoint/Kinetic」を、光学タイプに「Filters」を選択し、「OK」をクリックします。その後、「Full Plate」タブをクリックし、画像化するプレート上のウェルを選択します。「OK」をクリックして設定を保存します。

次に、「Objectives（対物レンズ）」のドロップダウンオプションから2.5倍の対物レンズを選択します。「Channels（チャンネル）」タブで、GFP 469.525とBright Fieldを選択します。両方のチャンネルでAuto Exposure（自動露光）にチェックを入れ、自動露光を行うウェルを選択します。

オートフォーカスの設定を決定するには、[Options]をクリックします。オートフォーカスのオプションで、[Scan]メソッドを選択し、次に[auto focus]を選択します。[OK]をクリックして設定を保存します。

その後、ウェルの中心からの水平および垂直方向のオフセットをゼロに設定します。1ウェルあたり3×2のモンタージュで複数画像をスキャンするように選択します。次に、[OK]をクリックして、プロシージャの設定を保存します。

選択したプレートの実験値を読み取るには、[Instrument Control]タブをクリックし、[Plate Out]機能を選択します。蓋がついていることを確認し、96ウェルプレートをプレートホルダーに設置します。[Instrument Control]タブで、[Plate In]機能を選択します。

次に、プレートタブからRead Nowを選択し、播種後96時間まで24時間ごとに測定を繰り返します。画像を解析するには、撮影したプレートのDataタブをクリックし、Picture GFP 469, 525 plus Bright Fieldを選択します。その後、撮影されたウェルをダブルクリックします。

次に、読み込んだ画像をクリックします。[Analyze]を選択し、解析対象となるモンタージュ内の単一画像を選択してください。続いて、[OK]をクリックします。その後、GFPチャンネルのみにチェックを入れ、表3に概説されている通りにパラメータを設定します。

その後、[Start]をクリックして、撮像した細胞にパラメータを適用します。画像上の細胞に配置されたセルカウントマスクを確認してください。これは、画像あたりの細胞数を決定するために使用されます。[Apply Changes]をクリックし、実験全体を通じて撮像する各プレートでこれらの設定を維持してください。

この図では、MCF-7-LeGO細胞およびMCF-7-delta 40p53細胞における細胞増殖を測定するために検討した異なる手法間の相関関係を比較するため、線形回帰分析を行いました。ピアソンの相関係数を算出し、細胞増殖を測定する異なる手法間の有意性を判定しました。その結果、ルミネッセンスベースのアッセイとセルイメージャーの比較において、最も強い相関が観察されました。

ここでは、細胞がほぼ100%コンフルエントになるまで24時間ごとにセルイメージャーで撮影した、GFP陽性のMCF-7-LeGOおよびMCF-7-delta 40p53乳がん細胞の代表的な画像を示しています。この手法は、数日間にわたる細胞増殖の視覚的なモニタリングや、異なる細胞株間での細胞サイズおよび細胞形態の比較など、有用な細胞情報を提供します。検証した各手法の長所と短所のまとめをここに示します。これにより、各手法の汎用性が明らかになり、読者が最も適切な手法を選択する際の助けとなります。

このビデオを視聴することで、3つの異なる細胞増殖アッセイについて十分に理解し、ご自身の実験計画に最適なものを判断できるようになります。