乳癌細胞株における細胞増殖を決定するための3つの異なる方法の比較

このデモンストレーションの全体的な目標は、3つの異なる細胞増殖アッセイを比較し、各方法の長所と短所を提示することです。この方法は、最も適切な細胞増殖法の使用など、がん研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。セルイメージャーのステップを学ぶのが難しいため、この方法の準備は非常に重要です。

彼らは、適切な細胞計数マスクを適用する前に、細胞に焦点を当てることを要求します。この手順を開始するには、フェノールレッドフリーDMEMを使用して、T75平方センチメートル組織培養フラスコで2つのMCF-7細胞株を3日間増殖させ、75〜80%のコンフルエンスにします。3日後、培地を廃棄物容器に注ぎ、フラスコから細胞を取り出します。

次に、すぐに2ミリリットルの予熱した2倍トリプシンで細胞層を洗浄します。トリプシンを吸引し、インキュベーターに入れる前に、事前に温めたトリプシンをさらに2ミリリットル細胞層に加えます。細胞が分離したら、温めた新鮮な補充DMEM10ミリリットルで細胞を洗います。

次に、細胞懸濁液を滅菌済みの15ミリリットルチューブに移し、室温で5分間遠心分離します。5分後、上清を慎重に吸引して廃棄します。その後、細胞ペレットを5ミリリットルの新鮮な補充DMEMに再懸濁します。

細胞計数を行うには、100マイクロリットルの細胞懸濁液をDPBSの1倍の900マイクロリットルに希釈します。次に、新しい60マイクロメートルのセンサーを自動セルカウンターに置きます。プランジャーを押したまま、希釈した細胞懸濁液にセンサーを沈めます。

セルカウンターのプランジャーをゆっくりと放します。次に、完了したらセンサーをセルカウンターから取り外します。96ウェルプレートに最終容量100マイクロリットルの細胞を約20%の密度で播種し、細胞増殖と3〜5日間にわたる増殖の測定の余地を確保します。

血球計算盤を使用して細胞数を測定するには、培地とトリプシンの両方を細胞培養インキュベーター、オーブン、またはウォーターバスで摂氏37度に予熱します。次に、細胞から培地を廃棄物容器に吸引します。次に、2倍のトリプシンの30マイクロリットルでそれらを一度洗い、培地を再び廃棄物容器に吸引します。

次に、細胞を2倍のトリプシンの30マイクロリットルで再度洗浄し、摂氏37度で5分間インキュベートします。プレートの端を軽くたたいて、細胞を外す。続いて、50マイクロリットルの添加DMEMを加え、ピペッティングで細胞を混合し、単一の細胞懸濁液が形成されるまで

ガラスカバースリップを計数チャンバーの上に置き、カバースリップエッジとヘロサイトメーターの間にニュートン屈折リングが見えるまで貼り付けます。次に、カバースリップの下に20マイクロリットルの細胞液を静かにピペットで移し、毛細管運動によって計数チャンバーを充填させます。続いて、10倍の倍率でグリッドレイアウトの計数チャンバーを視覚化します。

この手順では、発光試薬を摂氏22度の水浴で30分間解凍します。ボトルを静かに反転させて、均質な混合物を得ます。次に、播種した細胞の1つのプレートを室温で30分間平衡化します。

その後、各ウェルに100マイクロリットルの発光試薬を加えます。オービタルシェーカーで内容物を2分間混合します。その後、プレートを室温で10分間インキュベートします。

マルチモードプレートリーダーソフトウェアを使用して発光実験を設定するには、マルチモードプレートリーダーの電源を入れてソフトウェアを開きます。タスク マネージャーで、[実験] と [新規作成] を選択します。次に、サイドツールバーから「ファイル」を選択し、「プロトコル」タブで「プロシージャ」を選択します。

次に、プレートタイプとしてGreiner 96フラットボトムを選択し、[蓋を使用]ボックスをオンにします。[読み取りメソッド] ボックスの下にある [読み取り] アクションを選択します。次に、検出方法として[Luminescence]を選択し、[Read Step]ボックス OK.In をクリックし、[Full Plate]タブでスキャンするウェルを選択し、ブランクウェルとして機能するウェルを選択します。

[フィルター セット] を [空のフィルター] に設定します。ゲインを 135 に設定し、ウェルあたりの積分時間を 5 秒、読み取り高さを 6.5 mm に設定します。「OK」をクリックして、発光読み取りの設定を保存します。

発光読み取りを実行するには、「Instrument Control」タブを選択し、「Plate Out」をクリックしてプレートホルダーを取り出します。96ウェルプレートをプレートホルダーに置き、蓋が開いていることを確認します。プレートホルダーを閉じるには、Instrument Control(インストルメントコントロール)タブのPlate In(プレートイン)をクリックします。

次に、ツールバーの「今すぐ読む」をクリックして、発光読み取りを実行します。その後、各ウェルのRLU測定値をスプレッドシートにエクスポートして、さらに分析します。細胞イメージング実験を設定するには、マルチモード細胞イメージャーをオンにして、ソフトウェアを開きます。

タスク マネージャーで、[実験] タブを選択し、[新規作成] を選択します。[ファイル] ツールバーで、[プロトコル] タブをクリックし、[手順] タブをクリックします。「温度の設定」アクションを選択します。

インキュベーターをオンに設定し、温度を摂氏37度に設定します。[予熱]をオンにし、[OK]をクリックして設定を保存します。次に、読み取りアクションを選択します。

検出方法として[画像]をクリックします。次に、読み取りタイプとして [Endpoint/Kinetic] と [Filters] オプティカル タイプを選択し、[OK] をクリックします。その後、[Full Plate] タブをクリックし、イメージングするプレート上のウェルを選択します。[OK] をクリックして設定を保存します。

次に、ドロップダウンの[目標]オプションから2.5倍の目標を選択します。「チャンネル」タブで、「GFP 469.525」と「明視野」を選択します。両方のチャンネルの[自動露出]をチェックし、自動露出ウェルを選択します。

オートフォーカスの設定を確認するには、[オプション] をクリックします。オートフォーカスオプションの場合は、スキャンを選択し、次にオートフォーカスを選択します。[OK] をクリックして設定を保存します。

その後、ウェルの中心からの水平オフセットと垂直オフセットをゼロに設定します。ウェルごとに複数の画像を3×2のモンタージュでスキャンする場合に選択します。次に、「OK」をクリックして、プロシージャ設定を保存します。

選択したプレート上の実験を読み取るには、「Instrument Control」タブをクリックし、「Plate Out」機能を選択します。プレートホルダーに96ウェルプレートを置き、蓋が開いていることを確認します。「Instrument Control」タブで、「Plate In」機能を選択します。

次に、プレートタブから[今すぐ読み取り]を選択し、シード後最大96時間まで、24時間ごとに読み取りを繰り返します。画像を分析するには、画像プレートの[データ]タブをクリックし、[画像GFP 469、525、および明視野]を選択します。次に、画像化されたウェルをダブルクリックします。

次に、ロードされた画像をクリックします。「分析」を選択し、分析するモンタージュの 1 つの画像を選択します。次に、[OK]をクリックします。その後、GFPチャネルのみを確認し、表3に示すようにパラメータを設定します。

その後、をクリックします 開始 画像化されたセルにパラメータを適用します。画像化された細胞の上に配置されたセルカウントマスクを観察し、画像ごとの細胞数を決定するために使用されます。「Apply Changes」をクリックし、実験全体でイメージングされる各プレートのこれらの設定を維持します。

この図では、MCF-7-LeGO細胞とMCF-7-δ40p53細胞の細胞増殖を測定するために検討したさまざまな方法間の相関関係を比較するために、線形回帰分析が行われました。ピアソンの相関係数を計算し、細胞増殖を測定するさまざまな方法間で有意性を決定しました。最も強い相関関係は、発光ベースのアッセイとセルイメージャーとの比較との間に観察されました。

ここに示されているのは、細胞イメージャーを使用して細胞が100%のコンフルエントに達するまで24時間ごとにキャプチャされたGFP陽性のMCF-7-LeGOおよびMCF-7-delta 40p53乳がん細胞の代表的な画像です。この方法は、数日間にわたる細胞増殖を視覚的に監視したり、異なる細胞株間で細胞サイズと細胞形態を比較したりするなど、有用な細胞情報を提供します。ここでは、テストした各方法の長所と短所の要約を示しており、各方法の汎用性を示しており、読者が最も適切な方法を選択するのに役立ちます。

このビデオを見れば、3つの異なる細胞増殖アッセイについて十分に理解し、どれが自分の実験デザインに最も適しているかを判断できるようになるはずです。