酵素による細胞融合アッセイを使用して、SNARE媒介膜融合の解析

この手順の全体的な目的は、β-ガラクトシダーゼの活性化発現により、SNARE介在性の細胞融合イベントを定量化することです。これは、まずCost7細胞の表面にv-SNAREタンパク質およびt-SNAREタンパク質を異所的に発現させることで達成されます。次のステップでは、v-SNAREタンパク質を発現している細胞と、t-SNAREタンパク質を発現している細胞を混合させます。

これにより、SNARE介在性の細胞融合が起こり、β-ガラクトシダーゼの発現が活性化されます。最終的に、細胞融合によって誘導されたβ-ガラクトシダーゼ活性を分光光度計を用いて測定します。この手法、あるいは顕微鏡によるSAL領域アッセイのような既存の手法の主な利点は、複数のSNAREの組み合わせを解析できることです。

定量的に、この手法はSNARE介在性膜融合のメカニズムと制御を理解するために適用できます。また、ハイスループット研究への応用も可能です。この手順の実演は、私の研究室のポストドクターであるDoc Na Hassanと、技術者のDavid Humphreyが行います。トランスフェクションの前日に準備を行います。

12 mmのガラスカバースリップを配置した24ウェルプレートを用意し、実験で使用する固有のプラスミドを発現する細胞の各組み合わせについて、2つのウェルを準備します。DMEM（4.5 g/L グルコースおよび10% FBS添加）で培養したCOS-7細胞30,000個を、トランスフェクションのために各カバースリップに播種します。各ウェルに、0.25 µgのTTAプラスミドと1セットの発現プラスミドを添加します。

今回の目的タンパク質であるflipped vampsをT細胞に導入するため、TRE lacks Zをコードするプラスミド 0.25 µgと、目的のflippedタンパク質（本件ではsnap 25、syntaxin 1、およびsyntaxin 4）をコードする相補的なプラスミドセットを添加します。次に、製造元の指示に従い、lipofectamineを用いてcost 7をトランスフェクションし、細胞を24時間培養します。トランスフェクションの24時間後、補充済みパラホルムアルデヒドで細胞を10分間固定します。固定後、PBS++で細胞を3回洗浄し、補充済みFBSで30分間細胞をブロッキングします。

ブロッキング後、細胞をanti micモノクローナル抗体（Nine E 10）と共に30分間インキュベートします。PBS++で4回洗浄後、1:500に希釈したfitzy共役二次抗体と共に細胞を1時間インキュベートします。さらにPBS++で4回洗浄した後、ラベル化した細胞を市販の抗退色剤で封入します。

細胞の共焦点顕微鏡観察の準備が整いました。トランスフェクションの前日に、解析予定の各プラスミドの組み合わせに対して、100 mmティッシュカルチャーディッシュに120万個のCOS-7細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに20万個のCOS-7細胞を播種します。1ウェル分を準備し、細胞を24時間培養します。翌日、トランスフェクション用のプラスミドを添加します。COS-7細胞の場合、目的の融合タンパク質を発現するプラスミドと5 µgのpTet-Offを、各100 mm培養皿の細胞にトランスフェクションします。

100 mm培養皿を用いて、V細胞と同じ相対濃度で空ベクターおよびP te offを用いてコントロール細胞を共導入します。V細胞およびコントロール細胞にすべてのプラスミドを添加した後、vampのN-グリコシル化を防止するために、それらのウェルにtcom mycinを添加します。6ウェルプレートの各ウェルにおいて、目的タンパク質を発現する相補的プラスミドと共に、1 µgのPBIGをT細胞に共導入します。

次に、製造元の指示に従って、Lipofectamineを用いてC7細胞にトランスフェクションを行います。その後、細胞を24時間培養します。トランスフェクションから24時間後、酵素フリー細胞解離バッファーを用いて、培養皿から細胞を回収します。まず、20 mLのPBSで細胞を1回洗浄することから始めてください。

次に、酵素不含解離バッファーを5 mL加えます。室温で10分間インキュベートした後、プレートを鋭く叩いて細胞を剥離させ、顕微鏡下で細胞が剥離したことを確認します。細胞の半分以上が剥離していない場合は、さらに5分間待ち、再度プレートを叩いてください。

細胞の半分以上が剥離するまで、剥離バッファー中でのインキュベーションを継続します。次に、ヘモサイトメーターを用いてV細胞を計数します。その後、サプリメント添加済みのDMEM（ヘーゼスバッファー）を用いて、V細胞を約480,000 cells/mLの濃度で再懸濁します。

次に、再懸濁したV細胞を1 mLずつT細胞が入っている各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。細胞を6時間、12時間、または24時間共培養した後、PBSで洗浄し、溶解バッファーを加えます。続いて、ウェルから細胞をスクレーパーで回収し、遠心分離用のチューブに移します。

遠心分離後、上清を新しいチューブに移し、市販のアッセイを用いてメーカーの指示に従いbeta galactoの発現を測定します。そのプロトコルの際、結果を算出するために1 molarの炭酸ナトリウムを添加し、90分後にコレラメトリック反応を必ず停止させてください。分光光度計を用いて420 nanometersで吸光度を測定します。CO seven細胞にflipped snareプラスミドをトランスフェクトすると、flipped snareタンパク質が細胞表面に発現しました。

細胞表面におけるSNAREタンパク質の発現レベルを測定するために、フローサイトメトリーを用いました。膜融合能を比較するためには、vampsを同レベルで発現させる必要がありました。そのため、トランスフェクションに使用する各フリップSNAREプラスミドの濃度を滴定し、トランスフェクションに最適化しました。

このような条件下で、vamps 1、3、4、5、7、8、およびsyntaxin 1および4がそれぞれ細胞表面に同レベルで発現していました。シナプス開口放出を媒介するニューロンのSNAREを用いて、このアッセイの実現可能性を検証しました。実際に、vamp 2を発現するV細胞とSYNTAXIN 1およびSNAP 25を発現するT細胞を組み合わせたところ、強力なβ-ガラクトシダーゼの発現が検出されました。しかし、vamp 2またはSNAP 25のいずれかが発現していない場合は、ベースラインのβ-ガラクトシダーゼ活性しか検出されず、細胞融合とβ-ガラクトシダーゼの発現がv-SNAREとt-SNAREの相互作用に依存していることが示されました。全体として、SYNTAXIN 1、SNAP 25、vamp 1、vamp 3、およびvamp 8は、同等かつ最高レベルの融合活性を示しました。

対照的に、ベースラインのbeta GAL活性は、vamp 5とSYNTAXIN 1の間のような膜融合をこのタンパク質組み合わせが誘導しないことを示唆しています。Snap 25。酵素的融合アッセイを行う際は、SNAREタンパク質のN-グリコシル化を防ぐためにtunicamycinを添加し、SNAREタンパク質間のジスルフィド結合形成を防ぐためにDTTを添加することを忘れないでください。

このビデオを視聴することで、細胞融合アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。