Name: 酵素による細胞融合アッセイを使用して、SNARE媒介膜融合の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学ぶSNARE媒介膜融合の酵素による細胞融合アッセイ。COS-7細胞でV・T SNAREタンパク質を発現させ、β-ガラクトシダーゼ活性を分光光度計で測定することで、複数のSNARE組み合わせを定量的に解析する革新的な手法です。

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この作品は、国立衛生研究所からのルイビルCA135123大学（CHへ）からスタートアップ資金によってサポートされています。

1。細胞培養およびトランスフェクション<ol><li> COS-7細胞は、4.5 g / Lグルコース、10％ウシ胎児血清（FBS）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養される。 </li><li>プラスミドのトランスフェクションは、製造業者の指示（Invitrogen社）によるとリポフェクタミンを使用して行われます。 </li></ol> 2。細胞表面のSNARE式の蛍光顕微鏡分析<ol><li>トランスフェクションの前日、3×10 4、COS-7細胞を24ウェルプレートに含まれている無菌12mmのカバーグラス（フィッシャー·サイエンティフィック）上に播種する。 </li><li>各ウェル中のV-細胞については、TTA（PTETオフ、Clontech）をコードするプラスミド0.25μgのは急行がVAMPSをひっくり返しているプラ​​スミド0.25μgのコトランスフェクトされています。 </li><li>各ウェル中のT細胞は、コードするプラスミド、TRE-LacZを（PBI-G、クロンテック社）の0.25μgを0.25μgの急行は、SNAP-25およびsyntaxins 1または4をひっくり返している各プラスミドと共トランスフェクトされています。 </li><li>トン24時間後ransfection、細胞を+ +で30分間、10分間PBS + +（PBSは0.1g / LのCaCl 2を補充し、0.1グラム/リットルのMgCl 2）中の4％パラホルムアルデヒドで固定した後、PBS中10％FBS中でブロックされます。 </li><li>細胞を抗Mycモノクローナル抗体9E10（ニートハイブリドーマ培養上清）で1.5時間インキュベートする。 </li><li>後PBSで4回洗浄+ +は、細胞を1:500の希釈でFITC結合二次抗体（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ）で1時間インキュベートする。 </li><li>後PBSで4回洗浄+ +は、標識された細胞は、延長でGold退色防止試薬（Invitrogen）を装着されている。 </li><li>共焦点画像は、オリンパスのレーザー走査共焦点顕微鏡で収集されます。画像はAdobe Photoshopソフトウェアで処理されます。 </li></ol> 3。細胞表面のSNARE発現のFACS分析<ol><li>トランスフェクションの前日、2×10 5個の COS-7細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種する。 </li><li> TRA 24時間後とnsfection、スネア、PTETオフとPBI-Gプラスミドを反転し、細胞をPBSで1％パラホルムアルデヒド+ +で15分間固定した後、PBS中10％FBS + +で15分間ブロックされます。 </li><li>細胞は、60分間抗Mycモノクローナル抗体9E10と共にインキュベートする。 </li><li>した後、PBSで3回洗浄+ +は、細胞を45分間、FITC標識二次抗体（1:200希釈）で標識されています。 </li><li> PBSで3回洗浄+ +は、細胞をセルスクレーパーでプレートを掻きされた後。 </li><li> 15000セルがFACSCaliburフローサイトメーター（BD Biosciences）を用いて分析される。各サンプルの平均蛍光強度は、CellQuest Proソフトウェアを使用して取得されます。 </li></ol> 4。酵素的細胞融合アッセイ<ol><li>トランスフェクションの前日に、1.2×10 6個の COS-7細胞をそれぞれ100 mm組織培養ディッシュに播種され、2×10 5個の COS-7細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種する。 </li><li> 5μgのflippの各 - V-セル、0.5プラスミドED VAMPは、それぞれ100mmの培養皿で細胞へPTETオフ5μgのコトランスフェクトされています。コントロール細胞は、空ベクターpcDNA3.1（+）とPTETオフで同時トランスフェクトされています。 VAMPS 1、4、5、7、8、ツニカマイシンのN-グリコシル化を防ぐために（10μg/ ml）をトランスフェクション時の細胞培養培地に含まれています。 </li><li> 6ウェルプレートの各ウェル内のT細胞は、1μgのは、SNAP-25プラスミドとPBI-Gを反転し、0.5μgとのsyntaxin1プラスミド又は0.05μgとsyntaxin4プラスミド裏返し裏返しで同時トランスフェクトされています。 </li><li>トランスフェクション後24時間は、V-細胞は、酵素を含まない細胞解離バッファ（Invitrogen）を用いて培養皿から切り離されます。剥離した細胞は、血球計を用いて計数し、DMEM、10％FBS、6.7μg/ mlのツニカマイシンおよび0.67 mMのDTTを補充HEPES緩衝に再懸濁する。 </li><li> 4.8×10 5 V、再懸濁した細胞はすでによくT細胞を含むそれぞれに追加されます。 </li><li> 6,12または24時間後にラット37℃、5％CO 2中</sub&gt;に、β-ガラクトシダーゼの発現は、製造元の指示（Promega社）によるとレポーター溶解緩衝液にβ-ガラクトシダーゼ酵素アッセイ系を用いて測定される。簡単に言えば、細胞をPBSで2回洗浄され、その後、レポーター溶解緩衝液に溶解した。細胞溶解物をアッセイ2×等量のバッファーと混合される。ブランクコントロールとして、レポーター溶解緩衝液をアッセイ2×緩衝液と混合されています。 </li><li> 90分後、比色反応を1M炭酸ナトリウムを添加することにより停止されています。 </li><li> 420 nmの吸光度を100から40日立分光光度計を用いて測定される。 </li></ol>

<ol><li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+intracellular+protein+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li>
<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs--engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li>
<li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREpins%3A+minimal+machinery+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li>
<li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li>
<li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li>
<li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+%28VAMPs%29+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238(2010).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li>
<li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+%5Bsee+comments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li>
<li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li>
<li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+synaptobrevin%2FVAMP+homologous+protein+%28VAMP5%29+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li>
<li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li>
<li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endobrevin%2C+a+novel+synaptobrevin%2FVAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

元の細胞融合アッセイ6は蛍光顕微鏡法による、SNARE媒介細胞融合イベントを決定します。ここでは、β-ガラクトシダーゼおよび分光測定の活性発現によりSNARE媒介細胞融合事象を定量化する革新的なアッセイを説明します。このアッセイを使用して、我々は日常的に15を分析 - 20 V-及びt-SNARE一回の実験での組み合わせ。細胞表面でのSNARE発現を測定するためにフローサイトメトリーを用いて、我々は、VAMPSの発現量を滴定し、それらの膜融合能力（図2および図4）を比較します。さらに、酵素的細胞融合アッセイを用いて、我々はVAMP1タンパク質の細胞表面密度で細胞融合活性の依存性を決定し、細胞融合反応8のVAMP1タンパク質のない協同性を認められず、複数のSNARE複合体の協調行動が必要とされないことを示唆している細胞膜を融合させる。 推定N-グリコシル化のモチベーションがあります。SNAREタンパク質のfs（Asn-X-Ser/Thr）。 N-グリコシル化がの融合活動はSNARE蛋白質6を反転阻害するので、2つのア...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や機器の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> COS-7細胞</td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td>ツニカマイシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T7765-5mgの</td></tr><tr><td> PTETオフ</td><td>クロンテック</td><td> K1620- </td></tr><tr><td> pBI系G </td><td>クロンテック</td><td> 6150から1 </td></tr><tr><td>リポフェクタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td>無酵素細胞解離ソリューション</td><td>インビトロジェン</td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td>ウサギ抗Tetリプレッサーポリクローナル抗体</td><td>ミリポア</td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> FITC結合ロバ抗マウスIgG（H + L） </td><td> JACksonのイムノ</td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td>レーザースキャニング共焦点顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> FACSCaliburフローサイトメータ</td><td> BD Biosciences社</td><td></td></tr><tr><td>レポーター溶解緩衝液を有するβ-ガラクトシダーゼ酵素アッセイシステム</td><td>プロメガ</td><td> E2000 </td></tr><tr><td>モデル100から40、UV-VIS分光光度計</td><td>日立</td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

酵素による細胞融合アッセイを使用して、snare媒介膜融合の解析

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

スネアの相互作用（S oluble N-エチルマレイミド感受性因子ttachmentタンパク質再受容体）小胞（V-スネア）とターゲット膜上のタンパク質（T-スネア）は細胞内の小胞融合1-4を触媒する。再構成アッセイは、SNARE媒介膜融合5のメカニズムと規制を解剖するために不可欠です。細胞融合アッセイ6,7においては、SNAREタンパク質は細胞表面で異所的に発現されています。これらは、スネアが細胞膜を融合させるのに十分であることを実証し、SNAREタンパク質ドライブ細胞 - 細胞融合を &quot;フリップ&quot;。細胞融合アッセイを顕微鏡分析に基づいているため、複数のV-及びt-SNARE相互作用を定量的に分析するために使用された場合、それはあまり効率的である。 ここでは、β-ガラクトシダーゼの活性発現によりSNARE媒介細胞融合事象を定量化する新しいアッセイ8を説明します 。 2テトラサイクリン制御トランス（TTA）とテトラサイクリン応答エレメントの制御（TRE-lacZ）を下にLacZ遺伝子をコードするプラスミドレポーター：テトオフ遺伝子発現システム9の構成要素は、読み出しシステムとして使用されています。エクスプレスは、細胞表面にT-SNAREタンパク質をひっくり返しているCOS-7細胞（T細胞）に、細胞表面でのv-SNAREタンパク質（V-細胞）およびトランスフェTRE-LacZを反転しているCOS-7細胞に我フェTTA 。 TRE、LacZおよびβ-ガラクトシダーゼの発現の転写活性化にTTAの結合におけるv-及びt-細胞の結果、SNARE依存の融合。 β-ガラクトシダーゼの活性は、420 ​​nmの吸光度比色法を用いて定量する。 小胞関連膜タンパク質（VAMPS）は、様々なポストゴルジ小胞のコンパートメント10-15に存在するV-スネアです。同じレベルでVAMPS 1、3、4、5、7と8を発現することによって、我々は彼らの膜融合を比較酵素による細胞融合アッセイを使用して活動。分光測定に基づいて、このアッセイは、SNARE媒介膜融合を分析するための、高スループットの研究のための定量的なアプローチを提供しています。

定量的な細胞融合アッセイを開発するために、我々はTREにTTAの結合により強力な転写活性化を活用しています。 TTAの非存在下では、TRE-LacZ遺伝子における LacZ遺伝子の転写は、沈黙している。 TTAが存在する場合、それがTREに結合し、LacZの転写を活性化する。 図1は、酵素の細胞融合アッセイのフローチャートを示す。 TTAは、細胞表面での急行のv-SNAREタンパク質、及び、TRE-LacZのは 、T-細胞にトランスフェクトされているV-細胞にトランスフェクトされている細胞表面でのストークT-SNAREタンパク質。 TRE、LacZの転写活性化、及びβ-ガラクトシダーゼの発現にTTAの結合におけるv-及びt-細胞の結果の融合。 図2Aは、裏返さSNAREコンストラクトのドメイン構造を示す図である。 preprolactinシグナル配列は、スネアのN末端に融合される。これらの人工スネアは &q...

我々は、β-ガラクトシダーゼの活性発現によりSNARE媒介膜融合事象を定量化細胞融合アッセイを開発した。

酵素による細胞融合アッセイを使用して、SNARE媒介膜融合の解析

小胞上のSNARE（可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体）タンパク質（v-SNARE）と標的膜上のSNAREタンパク質との相互作用は...

この手順の全体的な目的は、β-ガラクトシダーゼの活性化発現により、SNARE介在性の細胞融合イベントを定量化することです。これは、まずCost7細胞の表面にv-SNAREタンパク質およびt-SNAREタンパク質を異所的に発現させることで達成されます。次のステップでは、v-SNAREタンパク質を発現している細胞と、t-SNAREタンパク質を発現している細胞を混合させます。これにより、SNARE介在性の細胞融合が起こり、β-ガラクトシダーゼの発現が活性化されます。最終的に、細胞融合によって誘導されたβ-ガラクトシダーゼ活性を分光光度計を用いて測定します。この手法、あるいは顕微鏡によるSAL領域アッセイのような既存の手法の主な利点は、複数のSNAREの組み合わせを解析できることです。定量的に、この手法はSNARE介在性膜融合のメカニズムと制御を理解するために適用できます。また、ハイスループット研究への応用も可能です。この手順の実演は、私の研究室のポストドクターであるDoc Na Hassanと、技術者のDavid Humphreyが行います。トランスフェクションの前日に準備を行います。12 mmのガラスカバースリップを配置した24ウェルプレートを用意し、実験で使用する固有のプラスミドを発現する細胞の各組み合わせについて、2つのウェルを準備します。DMEM（4.5 g/L グルコースおよび10% FBS添加）で培養したCOS-7細胞30,000個を、トランスフェクションのために各カバースリップに播種します。各ウェルに、0.25 µgのTTAプラスミドと1セットの発現プラスミドを添加します。今回の目的タンパク質であるflipped vampsをT細胞に導入するため、TRE lacks Zをコードするプラスミド 0.25 µgと、目的のflippedタンパク質（本件ではsnap 25、syntaxin 1、およびsyntaxin 4）をコードする相補的なプラスミドセットを添加します。次に、製造元の指示に従い、lipofectamineを用いてcost 7をトランスフェクションし、細胞を24時間培養します。トランスフェクションの24時間後、補充済みパラホルムアルデヒドで細胞を10分間固定します。固定後、PBS++で細胞を3回洗浄し、補充済みFBSで30分間細胞をブロッキングします。ブロッキング後、細胞をanti micモノクローナル抗体（Nine E 10）と共に30分間インキュベートします。PBS++で4回洗浄後、1:500に希釈したfitzy共役二次抗体と共に細胞を1時間インキュベートします。さらにPBS++で4回洗浄した後、ラベル化した細胞を市販の抗退色剤で封入します。細胞の共焦点顕微鏡観察の準備が整いました。トランスフェクションの前日に、解析予定の各プラスミドの組

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蛍光プロテアーゼ アッセイプラット フォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用

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脂質混合アッセイ用リポソームへの組換えショウジョウバエアラストシンの洗剤支援再構成

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副腎クロマフィン細胞における融合細孔ダイナミクスの3つのモードを測定するための共焦点顕微鏡

学ぶSNARE媒介膜融合の酵素による細胞融合アッセイ。COS-7細胞でV・T SNAREタンパク質を発現させ、β-ガラクトシダーゼ活性を分光光度計で測定することで、複数のSNARE組み合わせを定量的に解析する革新的な手法です。

酵素による細胞融合アッセイを使用して、SNARE媒介膜融合の解析

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