Name: 特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学ぶ 内因性シグナル光学イメージングと二光子顕微鏡を組み合わせた新皮質ミクロドメイン標的ニューロン標識法。この手法により、機能マップに基づく高精度なニューロン構造・機能解析が可能となる。

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図5Aに示すように樹状突起をトレースするためのグレース·ディオン;、この作品は、我々はまた、外科的処置の支援についてはマシューペトレルラに感謝国立眼研究所R01EY017925とR21EY020985とダナ·ホワイトホール財団からPKへの資金からの補助金によって支えられているとPratik氏Chhatbar用原稿についてのコメント。

1。手術の準備<ol><li>麻酔を誘導し、連続的に心拍数を監視し、潮のCO 2、脳波、および温度を終了します。すべての手順は、サウスカロライナ医科大学の制度的動物実験委員会によって承認されたと我々は以前に9,15を公表したものに基づいていた。 </li><li>メスの刃で皮膚を切断することによって頭蓋骨の背側表面を露出させる。 Brudonのキュレットを用いて骨を覆う結合組織を解剖する。綿先端アプリケーターと綿ガーゼを使用して骨をきれいにしてください。小さな使者静脈を通って時折出血を止めるために、頭蓋骨に骨ワックスを（必要に応じ）を適用します。 </li><li>黒の塗料（ 材料を参照してください）と混合歯科用セメントを用いて、頭蓋骨（開頭術が行われる関心領域の上の）にチタンまたはステンレス鋼ヘッドプレートを取り付けます。ヘッドプレートの中央に長方形の開口部は、開頭術および光学イメージングのためのアクセスを提供します。ヘッドプレートの上に金属のチャンバーを取り付けます。このチャンバは、水浸対物レンズと撮像のための流体貯水池として機能します。 </li><li>金属ポストを使用してXYステージにヘッドプレートを固定します。 </li><li>歯科用ドリルを使用してheadplateの長方形の開口部内に骨の大面積を薄く。間伐する面積が十分に計画された開頭術の境界を越えて拡張する必要があります。開頭部位で、骨の厚さは、カバーガラスと新皮質の表面との間にアガロースの厚さが決まりますので、高解像度の画像は、新皮質から取得されようとしている場合は、非げっ歯類哺乳動物の厚い頭蓋骨（下記参照）が薄くしなければなら。 </li><li>開頭術のための骨の中に2×2 mm角のアウトラインをドリルで開けます。骨の破片を除去し、基礎となる皮質への放熱を最小限に抑えるために、新鮮な人工脳脊髄液（ACSF）で定期的にチャンバーを洗浄します。必要に応じて臨時の出血を止めるために、骨のワックスを適用します。 </li><li> LIFトン3位鉗子で骨弁。 </li><li>すべてが細かい鉗子（＃5CO）とVannas春のはさみを使用して硬膜の底層を削除します。非げっ歯類哺乳動物における硬膜は、厚さと不透明ですが、異なる層に除去することができる。出血はまれですが、穏やかに硬膜の残りの層鉗子を使用していて、ACSFですすぐから削除する必要がありゼルフォームと任意の血液の残基で停止させることができます。硬膜の最終層は透明であり、軟膜血管はそれを通してはっきりと見えるはずです。内因性信号イメージング中に硬膜のこの最終層は無傷のままにしておくと、（説明を参照）実験のその後の二光子イメージング相用蛍光カルシウム指示薬の一括読み込みの成功率が増加します。 </li><li>暖かい2％アガロース（ACSFに溶解）のドロップを適用し、直ちに開頭の上にカバーガラスを配置します。呼吸器や心臓血管外科の脈動は解剖顕微鏡の接眼レンズ、または使用することによって最小限に抑えていることを保証するために開頭術をチェック2を明視野モードの光子顕微鏡。 </li></ol> 2。内因性シグナル光イメージング<ol><li>内因性信号イメージング時の乾燥からアガロースを防ぐためにカバーガラスの外側の周りACSFに浸したゲルフォームを追加します。 </li><li>二光子顕微鏡（ 図1）の上に標準のCマウントポートに固有信号イメージング、CCDカメラを取り付けます。 XYステージ（ 図1A）の近くにエアテーブル上の照明光源を配置します。位置と開頭とheadplate /チャンバー（ 図1B）上ライトガイドを固定します。内因性シグナルのために必要な反射した赤色光は、CCDカメラ（ 図1C-D）に開頭から直接渡すようにプライマリーダイクロとCマウントポートの下に鏡を収納してください。 4倍空気対物レンズ（NA 0.13、17ミリメートルWD）を使用して、ビューの2 x 2 mmのフィールドには、内因性信号イメージングのための利用可能です。 </li><li>リットルの熱フィルターを挿入加熱から皮質を防ぐためIGHTパス。 （546 nmの中心λ）が緑色の光を通過させるフィルタを使用して、皮質表面の血管のデジタル基準画像を記録します。 </li><li>皮質表面下500μmにzのフォーカスを移動します。内因性シグナルを測定するために皮質を照らすために赤色フィルター（630nmの中心λ）を使用します。皮質表面を均一に照明されるように光導波路を配置します。視覚刺激の表示によって生成された光から開頭をシールドします。視覚刺激とレコード反射データの一連の画像を提示する。 10分以内方位マップを生成するには、8刺激（それぞれ向きを4方向、2方向）のシーケンスの4回の繰り返しに対応するデータを収集します。 </li><li>偽色方向マップを生成するために本質的な信号データを分析します。マップ内のポイント-ニューロンの二光子標識、 例えば、風車の向き特異性のための潜在的なターゲット領域を選択すべての優先配向が（ 図2A）収束する。方位マップと皮質表面の脈管構造（ 図2B-C）の画像を重ね合わせる。大血管や動脈15に場所を避けて、ターゲットを選択する機能ドメインと大型水上艦艇の位置のレイアウトを使用します。 </li></ol> 3。蛍光カルシウム指示薬のバルク·ロード<ol><li> 5μlのDMSO中に1グラムのプルロニックを追加することにより、20％プルロニック/ DMSOの溶液を調製します。完全プルロニックを溶解するために10分間60℃で混合物を加熱する。混合物を室温まで冷まします。蛍光カルシウム指示薬オレゴングリーン488 BAPTA-午前1時（午前OGB-1）50μgのバイアルにプルロニック/ DMSO混合物4μlを添加する。その後、赤色色素（Alexa Fluor 594の、2 mMのストック溶液）1μlとOGB-1はAM 1mMの最終濃度用ピペット溶液35μlを（ 資料を参照）を追加します。で半時間のためのソリューションを超音波処理冷水浴をした後、不純物を除去するために0.45μmのフィルターで遠心分離します。 </li><li> 2.0から2.5μmの外側先端径が長いテーパーピペットを引き抜きます。ピペットに染料混合物5μlをロードします。 </li><li>ピペットの挿入を容易にし、最高品質の二光子画像を得るために硬膜の最終層を削除します。 </li><li>ピペットは皮質層2月3日にその目標に到達するために配置する必要があることを皮質表面上の正確な位置を決定する。当社所定の皮質ターゲットは方位マップ（ 図2）風車特異点である。ピペットは、チャンバ壁と客観の間を通過するように30°の角度で皮質に駆動する必要があります。このように、200μmの皮質表面下の標的領域にラベルを付けるために、皮質表面にピペットエントリの位置が目標位置（ 図3-B）に横約350μm以下となります。 </li><li> （XYステージを移動する上で動物とpipetteのマニピュレーターは、センターの目的（ 図3C）の下で皮質表面のエントリの位置に）配置されています。ピペットを簡単に開頭術の壁に沿って客観的または骨に触れることなく、皮質を入力することを保証するために、少なくとも3mmの作動距離（WD）（ 資料を参照）で20倍または40倍の対物レンズを使用してください。エントリの位置は客観下中央に配置されたら、2ミリメートル（ 図3D）による客観のZ位置を上げる。緑の落射蛍光灯が直接皮質表面エントリ位置（上記の目的の下に（と集中）、その先端が中心になるまでピペットを移動するためにマイクロマニピュレータの斜めの軸を使用し、ピペットで赤色Alexa色素を可視化するためにオンにした状態で図3E）。 </li><li>連続OCUを通してピペットの先端を見ながらピペットは、皮質表面（ 図3F）に達するまで、ピペットを垂直（Z軸方向）下げる顕微鏡のラース。明視野照明を使用して、皮質表面の血管や残りの髄膜（軟膜とクモ膜）はピペットは皮質表面に近づくにつれて簡単に見ることができます。ピペットは、目的のエントリの位置に到達しない場合は、ピペットを高め、皮質表面上の血管のランドマークに基づいて再キャリブレーションターゲット。 </li><li>目標を外し、開頭術から過剰な脳脊髄液を芯と糸くずの出ない吸収槍を使用して、隣接する骨を乾燥させてください。開頭術（ 図3G）を通して見える皮質を安定させるために暖かい3％アガロース（ACSFに溶解）のドロップを適用します。非げっ歯類では、3％アガロースは、ニューロンによって蛍光色素の取り込みに成功した脈動を減衰させることが必要である。 2％アガロースとカバーガラスの組み合わせが必要な安定性を提供するので、内因性シグナル光学イメージングの場合のみ2％アガロースが必要とされている。ここでは、全くカバーガラスを3％アガロースので染料ローディングステップのためにされて使用されていません必要。アガロースが固化した後、40倍対物レンズ（0.8 NAは、3.3ミリメートルWD）とACSFで再充填チャンバーを挿入します。 </li><li>明視野からの2光子観察に切り替えて、ピペットの先端の位置を確認します。その先端が皮質（ 図3H）で所望の深さに達するまで、マイクロマニピュレータの対角軸を使用して、ピペットを移動します。染料混合物（数PSI、各パルス0.1秒）の時折圧力吐出パフ目詰まりからピペットチップを防ぐことができます。 OGB-1は細胞のみに入る時に見えるようになるだから、赤色Alexa色素は、皮質内部のピペットチップの可視化のために重要である。 </li><li>ピペットチップの深さを確認し、先端がのレイアウトに基づいてターゲットの位置にあることを確実にするために皮質表面上に再注力目的、染料の完全な用量で2月3日皮質層のニューロンをロードしようとする前に表面の血管。ピペットは、レイヤ2/3になっている場合は、染料の混合物の小さなパフが点灯します外空間と暗い影のように円形の細胞体の密集アセンブリを明らかにする。 </li><li>大脳皮質300から600μmの直径の球に神経細胞体をロードするために、30から90パルス、各パルス1.0秒、2月​​10日PSIを使用して細胞外空間に染料混合物を注入します。圧力のパルスは、組織が動くように強いてはいけません。注入が完了した後、数分待ってから、ピペットと目標を削除します。完全ニューロンによって巻き取られるようにAM OGB-1を可能にするために1時間待つ。 </li><li>染料ロードに使用アガロースを外し、録音室をすすいでください。表面で2-3％のアガロースの小滴を入れて、すばやく開頭の上にカバーガラスを配置します。蛍光色素は光に敏感なので、明視野または落射蛍光灯に皮質をオーバー露出させないようにしてください。客観的なホルダーと再中心XYステージを用いて目的の下で標識された皮質領域に高NA（1.0）の20倍の対物レンズを挿入します。 EXから開頭術をシールドtraneous光源、 例えば 、視覚刺激の表示、遮光材料の複数の層を使用しています。 </li></ol> 4。蛍光色素の単一セルのエレクトロ<ol><li>樹枝状形態を研究するために、100μMのAlexa Fluor 594（2mMのAlexa Fluor 594の株式のACSFで1時20希釈）の溶液を調製します。樹状突起の機能的イメージングのためにOGB塩が16,17を使用することができる。 </li><li> 1μmの先端サイズが長いテーパーピペットを引き、ピペットに染料の5μlをロードします。機能ドメインを標的とする他のすべての手順は、バルク·ロードする方法（ 図1-3）と同じです。神経細胞体の膜に隣接したピペットチップを配置するには、電極インピーダンスの増加を監視し、細胞外空間を照らすと二光子イメージング中に影のように細胞体を見るために、染料の圧力パフを適用します。 </li><li>ピペットの先端は、神経細胞体膜に隣接している場合には、適用するAxoporator 800Aを使用1-3パルス（-8〜-10 V、10ミリ秒パルス）。染料とニューロンの即時充填は2光子顕微鏡で容易に可視化される。ピペットを取り出して、in vivoでの樹状突起と軸索の高解像度の画像を収集する。 </li></ol>

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々は、新皮質の所定の機能、マイクロドメインにおける神経細胞体（または樹状突起と軸索）の標識を対象とする方法を提案する。二光子顕微鏡によるマージ固有信号光イメージングは​​、ニューロンの選択が機能してマップ内のニューロンの位置、および神経回路部品と相関するかどうかを、シナプス、細胞は任意の機能マップのマイクロドメインに寄与するかを決定する可能性を提供視覚経験7または臨床的に治療薬18のアプリケーションとその変化。 刺激の向き、方向、眼球優位性や、両眼視差のためのマップは成体野生型げっ歯6,19-21の視覚野に報告されていません。しかし、蛍光色素を用いた神経細胞をロードおよびマウスに使用できる強力な遺伝学的ツールとともに、イメージング·安定性を達成するための容易さは、研究の大部分をもたらしたげっ歯類の代わりに、フェレット、ネコ、サルで行われている大脳皮質の二光子イメージングを用いた。 非げっ歯類哺乳動物の神経細胞の高分解能2光子イメージングが長いため、手術時間、厚...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1。ライフサポート/実験準備 </td></tr><tr><td>イソフルレン</td><td>ウェブスターの獣医</td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td> Midmark </td><td> VIPの3000 </td><td></td></tr><tr><td>フィードバック安定化された毛布</td><td>ハーバード装置</td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> ECGモニター</td><td> Digicareメディカル</td><td> LifeWindow Liteの</td><td></td></tr><tr><td>脳波アンプ</td><td> AMシステム</td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td>脳波ディスプレイモニタ</TD&gt; <td>ヒューレット·パッカード</td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td>潮のCO 2モニタを終了</td><td>レスピロニクス</td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td>換気を最適化</td></tr><tr><td>掘削骨用超硬ドリルのバリ</td><td>ヘンリーシャイン</td><td>細かい（0.5mmの先端）と粗（1.25 mmのチップ） </td><td></td></tr><tr><td> headplate /チャンバー用セメント</td><td>デンツプライ</td><td> 675571、675572 </td><td></td></tr><tr><td>ブラックパウダーテンペラペイント</td><td>サージェントアート株式会社</td><td> 22から7185 </td><td>遮光性を向上するためにセメントや反射を低減するために追加</td></tr><tr><td>アガロース - タイプIII- </td><td>シグマ</td><td> A9793 </td><td>内因性シグナルと2光子イメージング中に脈動を最小限に抑えるための</td></tr><tr><td>カバーガラス：5または直径8mm、厚さ0.17ミリメートル</td><td>ワールド·イン·プレシジョンインストゥルメント</td><td> 502040、502041 </td><td>撮像中に脈動を最小限に抑えるために、カバーガラスは、必要に応じて切断してもよい</td></tr><tr><td> Brudonのキュレット</td><td>ジョージ·ティーマン</td><td> 105-715-0、105-715-3 </td><td>頭蓋骨の表面をクリーニング</td></tr><tr><td>骨ろう</td><td>エチコン</td><td> W31G </td><td>素早く出血を止める</td></tr><tr><td>綿はアプリケーターをひっくり返した</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 72308から05 </td><td>清潔で乾燥した骨表面</td></tr><tr><td>デュモン＃5CO鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11295から20 </td><td>硬膜またはPIAの個々の層をつかむ</td></tr><tr><td> Vannas春はさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15000から03 </td><td>カット硬</td></tr><tr><td>ゼルフォーム</td><td>ファイザー</td><td> 09-0396-05 </td><td>硬膜に出血を止めるために</td></tr><tr><td>吸収槍</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 18105から01 </td><td> CSFの超高速で糸くずの出ないウィッ</td></tr><tr><td>暗幕材料</td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td>シールド開頭術</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2。色素製剤/注射 </td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td>シグマ</td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td>プルロニック</td><td>シグマ</td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td>オレゴングリーン488 BAPTA-1 AM </td><td>インビトロジェン</td><td> O6807 </td><td>カルシウム指示薬</td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594の</td><td>インビトロジェン</td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td>遠心フィルター（孔径0.45μm） </td><td>ミリポア</td><td> UFC30HV00 </td><td>注射の前に不純物を除去するために</td></tr><tr><td>ガラスピペットプラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス（1.5ミリメートル外径）キャピラリーfilamented </td><td>ワールド·精密機器</td><td> 1B150F-4 </td><td>染料噴出ピペット</td></tr><tr><td> Microloader </td><td>エッペンドルフ</td><td> 5242 956 003 </td><td>ピペットに染料をロードするための</td></tr><tr><td>極微操作装置</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> MP-285 </td><td>ピペットを配置するには</td></tr><tr><td>圧力パルスコントローラ</td><td>パーカー·ハネフィン</td><td> PicoSpritzer III </td><td>染料の圧力注射用</td></tr><tr><td>単一セルのエレクトロ</td><td>分子デバイス</td><td> Axoporator 800A </td><td>染料のエレクトロ</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3。本質的なIMA変更する</td></tr><tr><td> 4xの目標（0.13 NA、17ミリメートルWD） </td><td>オリンポス</td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td>本質的なハードウェア/ソフトウェア</td><td>光イメージング株式会社</td><td>イメージャ3001 / VDAQ </td><td> VDAQソフトウェアはエピソードイメージングのために使用されている</td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td> Adimecの</td><td> Adimecの-1000 </td><td></td></tr><tr><td>光源用電源</td><td>関西電力</td><td> 15-15MのATE </td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td>光イメージング株式会社</td><td> HAL 100 </td><td>皮質表面での光強度は3-5 mWです</td></tr><tr><td>グリーンフィルタ（血管画像用） </td><td>光イメージング株式会社</td><td> λ= 546nmで（バンドパス30nm）を</td><td>表面の脈管構造の参照画像のために</td></tr><tr><td>赤色フィルター（真性信号用） </td><td>光学ImagiNG株式会社</td><td> λ= 630nmの（バンドパス30nm）を</td><td>内因性シグナルを収集するには</td></tr><tr><td>熱フィルター</td><td>光イメージング株式会社</td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4。二光子リグ/イメージング </td></tr><tr><td>二光子顕微鏡とソフトウェア</td><td>プレーリー·テクノロジーズ</td><td></td><td> Shen らを参照してください。光路、フィルタ、レーザーパワーのための2012 </td></tr><tr><td> Ti：サファイアレーザー</td><td>スペクトラ·フィジックス</td><td>マイタイXF </td><td></td></tr><tr><td> 20倍（0.5 NAは、3.5ミリメートルWD） </td><td>オリンポス</td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0.5 NA対物は（ない2光子イメージングのための）開頭の上にピペットを整列させるためにのみ使用され</td></tr><tr><td> 20倍（1.0 NAは、2.0ミリメートルWD） </td><td>オリンポス</td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40倍（0.8 NAは、3.3ミリメートルWD） </td><td>オリンポス</td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td>空気テーブル</td><td>ニューポート</td><td> ST-200 </td><td>外部振動から準備を隔離</td></tr><tr><td> XYステージ</td><td>マイクの機械株式会社（アットルボロー、マサチューセッツ州） </td><td></td><td> XYステージ上に配置実験対象とサッターのマニピュレーター</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> レシピ </td></tr><tr><td>人工脳脊髄液</td><td>のNaCl（135 mM）を、塩化カリウム（5.4 mM）を、MgCl 2を （1.0 mM）を、CaCl 2の （1.8 mM）を、HEPES（5mM）を、pH7.4の</td></tr><tr><td>ピペット溶液14 </td><td>のNaCl（150 mM）を、塩化カリウム（2.5mM）の、HEPES（10mM）を、pH7.4の</td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

非げっ歯類哺乳動物の一次視覚野では、ニューロンはそのような方向性1-4、方向5-7、眼優位8,9と両眼視差9として刺激特徴のための彼らの好みに応じてクラスタ化されます。方位選択性は最も広く研究されている機能であり、好ましい向きの準周期的なレイアウトの連続写像全体の一次視覚野10,11越えて存在している。これらの機能マップの刺激選択的応答につながるシナプス、細胞、ネットワークの貢献を統合することにより、ミリメートルの空間スケールにサブミクロンをまたぐイメージング技術のハイブリダイゼーションを必要とします。従来の内因性シグナル光学イメージングでは、視覚皮質の表面全体機能マップの全体的なレイアウトは、12を決定することができます。カルシウム感受性色素を用いたin vivoでの 2光子顕微鏡の開発は、SYNAPTを決定するために、1つを可能にICの入力は、個々の神経細胞体6,14の数百人から同時に個々の樹状突起棘13やレコード活動に到着。その結果、2光子顕微鏡のサブミクロンの空間分解能を有する結合内因性信号イメージングは​​、樹状細胞は、セグメントと新皮質内の機能マップのマイクロドメインに寄与するかを正確に決定する可能性を提供しています。ここでは、急速に皮質方位マップを取得し、非げっ歯類哺乳動物における蛍光色素で神経細胞を標識するためのこの機能マップ内の特定のマイクロドメインを標的とするため、高収率の方法を示しています。二光子イメージングに使用されるのと同じ顕微鏡を用いて、我々は最初の内因性シグナル光学イメージングを用いた方位マップを生成します。その後、我々はどちらかのラベルに染料を用いて神経細胞体またはラベルの樹状突起棘と軸索がに表示されていることをこのような単一ニューロンの人口を読み込まマイクロピペットを用いて目的のマイクロドメインをターゲットにする方法を示しています生体。以前の方法に比べて我々の改良が新皮質の機能的なアーキテクチャの枠組みの中で、サブ細胞レベルの分解能を持つニューロンの構造と機能の関係の検討を容易にする。

私たちの色素標識法の精度を説明するために、我々は、非げっ歯類の新皮質内の任意の既知の機能マップの最小のマイクロドメインを対象とした。まばらに一次視覚野における方位マップ全体中断特異点である。これらは、すべての優先方位が配向性の偽カラーマップ、 &quot;風車&quot;（ 図2A-B）のような特異点を見て周りの地域ではそのような収束するポイントで発生します。開頭当たり一風車は、特定の15大血管や動脈を避けるために確認してから、色素標識（ 図2Cに緑色の円）に選択されます。 OGB-1 AMのバルクロード機能により、指向格子視覚刺激の配列に蛍光ニューロンのカルシウム指示薬の変化を追跡することは風車の特異点の周りの単一セルの解像度機能マップ（ 図4）を明らかにする。単一セルのエレクトロポレーションを使用すると、樹状突起と軸索の空間的な組織としての風車の特異点に位置イングルニューロンを in vivo（ 図5） で決定される。 <p clas...

方法は新皮質の所定の機能、マイクロドメインにおける蛍光色素でニューロンを標識に記載されている。まず、内因性シグナル光学イメージング、機能マップを得るために使用されます。その後、2光子顕微鏡は、マップのミクロドメイン内でラベルとイメージニューロンに使用されます。

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

この手順の全体的な目標は、機能マップ内のマイクロドメインを正確にターゲットにして、ニューロンの構造と機能を高解像度で研究することです。これは、最初に皮質の広い領域に対して内因性シグナルイメージングを実行して、目的の刺激特徴のマップを取得することによって達成されます。2番目のステップは、高解像度からフォトンイメージングの対象となるマップ内の正確な位置を決定することです。次に、蛍光色素を充填したピペットを慎重に配置した後、ニューロンを蛍光マーカーで標識します。最後に、ニューロンの応答または構造の高解像度から光子までの画像が収集されます。最終的には、固有シグナル特徴マップを使用して、方位風車の特異点などの関心領域を見つけ、単一のニューロン分解能での研究のターゲットにすることができます。このプロトコルの主な利点は、システムを数回すばやく調整するだけで、同じ顕微鏡セットアップを使用して、異なる空間スケールで皮質をイメージングできることです。これにより、これらの技術を組み合わせて、高分解能イメージング用の蛍光プローブで標識するニューロンの領域を選択するためのガイドとして、コース分解能の固有シグナルマップを使用することができます。動物は、施設の動物管理誘発委員会が承認したプロトコルに従って麻酔をかけられ、頭蓋骨が露出して洗浄されました。デンタルセメントミックスは、中央に長方形の開口部があるステンレス製のヘッドプレートを頭蓋骨に取り付けるために使用されています。ヘッドプレート上部の金属チャンバーは、水浸対物レンズでイメージングするためのリザーバーとして機能します。ヘッドプレートは金属製の支柱を使用してXYステージに固定されています。デンタルドリルを使用して、ヘッドプレートの長方形の開口部内の骨の広い領域を薄くします。骨のワックスを塗るには、時折の出血を止める必要がありました。薄い領域は、計画された開頭術の境界を超えながら拡張する必要があります。次に、開頭術のために骨に2×2ミリメートル四方の輪郭をドリルで開けます。新鮮な人工脳脊髄液でチャンバーを定期的にすすぎ、骨片を取り除き、下にある皮質への熱放散を最小限に抑えます。次に、3番の鉗子で骨を持ち上げます。5番の鉗子とバナスプリングハサミを使用して、硬膜の上層を取り除き、下層はそのままにします。硬膜の最後の層は透明で、剥がれた血管がそれを通してはっきりと見えるはずです。A CSFに溶解した温かい2%エアロスを一滴垂らし、すぐに開頭術の上にカバーガラスを置きます。まず、カバーガラスの外側にA CSFを染み込ませたゲルフォームを塗布し、固有シグナルイメージング中にアグロスが乾燥するのを防ぎます。次に、2つの写真顕微鏡の上部にある標準Cマウントポートに固有信号イメージングCCGカメラを取り付け、XYステージ位置近くのエアテーブルに照明光源を配置し、ライトガイドを開頭術に固定します。一次ダイクロイックとミラーを海山ポートの下に引っ込めて、固有信号に必要な反射した赤色光が開頭術から直接CCDカメラに通過するようにします。皮質が加熱するのを防ぐために、光路に赤外線フィルターを挿入します。次に、緑色の光を通すフィルターを配置し、皮質表面血管のデジタル参照画像を記録します。次に、Zフォーカスを皮質表面の500ミクロン下に移動します。緑色のフィルターを赤色のフィルターに交換して、皮質を照らし、固有の信号を測定します。皮質が均一に照らされていることを確認してください。視覚刺激ディスプレイによって生成される光から開頭術を遮蔽し、視覚刺激のシーケンスを提示し、反射率データ画像を記録して方位マップを生成する10分以内に、4つの方位と各方位に対する2つの方向を持つ8つの刺激のシーケンスの4回の繰り返しに対応するデータを収集する。次に、固有信号データを解析して、次に示すように偽方位カラーマップを生成します。次に、ニューロンの2光子標識の潜在的な標的領域を選択します。たとえば、向きのピンホイールの特異点は、すべての優先向きが収束するマップ内のポイントです。次に、方位マップと皮質表面血管系の画像を重ね合わせ、機能ドメインのレイアウトと大きな表面血管の位置を使用して、大きな血管や動脈のある場所を避けてターゲットを選択します。蛍光D溶液を調製し、書面によるプロトコルの指示に従って長いテーパーピペットを引っ張ります。5マイクロリットルの染料混合物をピペットに入れます。次に、硬膜の最終層を取り外してピペットの挿入を容易にし、この図に示すように最高品質の2光子画像を取得します。ピペットは、チャンバーと対物レンズの間を通過するために、30度の角度で皮質に打ち込む必要があります。したがって、ピペットのエントリー位置の皮質表面位置は、対象とする対象領域の真上にはなりません。例えば、皮質表面の200ミクロン下にある標的領域を標識するには、皮質表面上のピペットの入口位置は、標的位置から約350ミクロン横になります。XYステージを動かして、皮質表面のエントリー位置を20 xまたは40 xの対物レンズの下の中央に配置します。エントリーポジションが対物レンズの中央に配置されたら、対物レンズのZ位置を2ミリメートル上げます。次に、緑色のエピ蛍光ライトをオンにし、ピペット内の赤色のAlexa色素を視覚化し、先端が皮質表面の入口位置より上に来るまでピペットを動かします。明視野照明を備えた顕微鏡の接眼レンズを通してピペットの先端を見ながら、先端が皮質表面上の目的のエントリー位置に達するまでピペットを下げます。次に、対物レンズを取り外し、糸くずの出ない吸収槍を使用して、開頭術から余分な脳脊髄液を吸い上げ、隣接する骨を乾燥させます。次に、皮質を安定させるためにA CSFに溶解した温かい3%ローズを一滴塗布します。arosが固まったら、40倍対物レンズを挿入し、チャンバーにCSFを補充します。次に、マイクロマニピュレーターの対角線軸を使用して、先端が皮質の目的の深さに達するまでピペットを動かします。DI混合物の時折の圧力放出パフは、ピペットが第2層に達したときにピペットの先端が詰まる可能性を減らし、DI混合物の3つの小さなパフは余分な細胞空間を照らし、直径300〜600ミクロンの皮質の球体にニューロン体をロードするための暗い影として円形の細胞体の密集したアセンブリを明らかにします。Dix混合物を30〜90パルスを使用して細胞外空間に注入します。各パルスは 1 秒、2 PSI から 10 PSI です。注入が完了したら、数分待ってからピペットと対物レンズを取り外してください。蛍光カルシウムインジケーターは、1時間でニューロンによって完全に取り込まれます。最後に、ダウンロードに使用したアロスを取り外し、録音チャンバーをすすぎます。表面に2〜3%の小さな滴を置き、開頭術の上にカバーガラスをすばやく置きます。高NA 20 x対物レンズを対物レンズホルダーに挿入し、ラベル付けされた皮質領域を対物レンズの下に再配置します。XYステージを使用して、開頭術を外部の光源から遮蔽し、標識されたニューロンの高解像度画像をin vivoで収集します。あるいは、シングルセルエレクトロポレーションを使用して、樹状突起の形態や樹状突起の機能イメージングを研究することもできます。この方法論では、DIは書かれたプロトコルに従って準備されます。次に、手順の適切なポイントで、ピペットチップをニューロン細胞体膜に隣接して配置し、軸索を使用して1〜3パルスを印加します。ニューロンの色素による即時充填は、2光子顕微鏡で容易に視覚化できます。この画像は、視覚野層23で蛍光カルシウムインジケーターOGB 1:00 AMで標識された細胞体を示す2光子画像化された領域を示しており、スケールバーは100ミクロンを表しています。この画像は、前の画像に示したのと同じ部位からの個々のニューロン細胞体の配向選好を示しています。好ましい刺激方向の整理されたマップは、画像化された領域を中心とする風車の特異点の周囲に見られます。ここでは、固有信号イメージングで得られた方位マップを示します。黒い四角形は、前の 2 つの光子画像に示されている領域に対応しています。この画像は、1つのニューロンの樹状突起と細胞体を配向マップで重ね合わせたものです。ニューロンは、2光子誘導下でAlexa floor 5 94でエレクトロポレーションされました。Z スタックを in vivo で収集し、樹状突起プロセスをソフトウェアとして Neuro Lucid を使用してオフラインで追跡しました。配向マップは、シングルセルエレクトロポレーションの前に内因性シグナルイメージングを使用して取得されました。スケールバーは100ミクロンを表します。皮質層1からのこの10ミクロンのZ投影は、頂端樹状突起を示しています。赤い矢印は樹状突起に沿った棘を示し、皮質層2から3のこれらの10ミクロンのZ突起は、赤い矢印で示された棘と白い矢印で示された軸索を持つ基底樹状突起を示しています。この方法は、さまざまな空間スケールで皮質の機能マップを研究し、特定の関心領域のニューロンを正確に標的にするのに役立ちます。このマップ内では、方位選択マップを調べる方法の適用を実証しましたが、網膜、トッピー、眼球優位、方向などの他の視覚特徴マップ、または体細胞感覚や聴覚をコードするマップなど、機能的に組織化されたマップを持つ他の感覚モダリティに拡張できます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

新皮質のマイクロ回路のネットワークのダイナミクスを理解するために、それは同時に、神経細胞の多数のアクティビティを記録することが不可欠です。のin...

レイヤーin vivoでの2光子カルシウムイメージングマウスの2 / 3

本稿では、限られた抑制性ニューロン集団でGFPを発現するトランスジェニックマウスにおける細胞全体の録音でレーザ走査光刺激を組み合わせたアプローチを紹介します。手法は特異的な阻害皮質ニューロンの局所シナプス回路の広範なマッピングと定量分析が可能になります。...

レーザースキャニングの光刺激によって抑制神経回路のマッピング

蛍光色素ラベル解剖投影に基づくニューロンの亜集団の逆行性輸送。標識された軸索は、視覚的に対象とすることができます...

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

ニューロンにおける経験依存的分子変化は行動の課題に応じて適応する脳の能力のために不可欠である。アン...

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

生きている動物のTime-lapse imaging...

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

私たちは、全細胞パッチクランプおよびマウス脳の急性組織切片における樹状突起および海馬ニューロンのスパインにおける細胞内ナトリウム過渡の多光子イメージングによる神経活性化合物の焦点UV誘導光活性化の組合せを記載。...

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

このビデオは、Thy1-GFPトランスジェニックラインのin vivo...

同時2光子<em&gt;インビボ</emマウス脳梁膨大後部皮質におけるシナプス入力とシナプス後ターゲットの&gt;イメージング

全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2...

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

ここで組織をクリア、蛍光標識と、それによって、大脳新皮質の細胞型の三次元組織の可視化を可能にするマウスの脳組織の大規模なイメージング手順をについて説明します。...

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

マイクロプリズムレンズは、1光子顕微鏡と2光子顕微鏡の両方に対応したヘッドプレートと光学設計と一体化することで、頭部を固定した状態でのよく制御された実験や、自由に動く動物の自然な行動課題など、さまざまな条件下で垂直カラム内の神経応答を測定する上で大きな利点を発揮します。...

自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング

このプロトコルは、複数の記憶関連脳領域にまたがるニューロンおよびアストロサイトからのカルシウム信号を同時に記録する方法を包括的に説明し、学習および記憶行動のパラダイムにおける応用を示しています。...

学習および記憶行動中の複数の脳領域にわたるアストロサイト-ニューロン活動を記録するための二色ファイバーフォトメトリー法

学ぶ 内因性シグナル光学イメージングと二光子顕微鏡を組み合わせた新皮質ミクロドメイン標的ニューロン標識法。この手法により、機能マップに基づく高精度なニューロン構造・機能解析が可能となる。

特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識

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