ザシトロrodentiumマウスモデル：感染性大腸炎に勉強病原体とホスト貢献

この手順の全体的な目標は、グラム陰性ミラーリング病原体であるシトロバクターげっ歯類をマウスに感染させることにより大腸炎を誘発し、胃腸管における病原体と宿主の相互作用の研究を可能にすることです。これは、最初に接種することで達成され、一晩で償還ゼロの文化が実現します。第2ステップでは、マウスを経口強制経口投与により一晩接種して感染させます。

次に、感染後7日目に、最終ステップで盲腸結腸と管腔の内容物が収集されます。組織をプレーティングし、細菌コロニーをカウントし、目的の宿主タンパク質の免疫染色を行います。最終的には、病原体負荷、バリア機能、組織学的損傷、および宿主応答の変化を免疫組織化学によって評価できます。

この方法は、感染性大腸炎の堅牢なモデルを提供し、宿主病原体の相互作用と免疫応答の研究を可能にしますが、結腸がんのリスクに対する細菌感染の影響を調べるためにも適応させることができます。一般に、この方法に不慣れな個人では、マウスの細菌感染に自然に苦労するでしょう、マウスの細菌感染、またはゲージ付き、またはゲージ。まず、滅菌接種ループを使用して、凍結グリセロールストックからLBエレクトロプレートに生存可能なC償還をストリークします。

摂氏37度で一晩インキュベートした後、接種ループを使用してLBプレートからコロニーを3ミリリットルの滅菌lbブロスに移します。次に、ERO Dunum培養物をベンチトップインキュベーションシェーカーで200 RPMで摂氏37度で一晩インキュベートします。翌朝、接種したlbブロスは濁っているように見えるはずです。

培養物を穏やかに攪拌して細菌細胞培養物を均一に分配した後、1ミリリットルのシリンジにブロスを充填し、胃の強制針に取り付けます。首から背中にかけてたるんだ皮膚をフェムと指でしっかりとつかみ、強制用のマウスを選択します。次に、人差し指で動物の頭を引き戻して動物の頭を固定し、食道をまっすぐにして挿入します。

マウスを直立位置に維持し、胃強制針の球根の先端を動物の口の側面に沿って舌の上に向けます。動物の口の天井に沿って針をそっと通し、針を食道に進めます。最後に、注射器を使用して100マイクロリットルの細菌接種物をゆっくりと注入し、次に強制針をそっと取り外します。

マウスを戻した後、アッセイ当日のケージの呼吸数と行動を監視し、今示したようにマウスを首筋にし、次に新たに調製したフィッツィデキストリン150マイクロリットルで動物を強制します。この時点で、強制経口投与の4時間後にケージから食物を取り出し、次に動物の鎮静を行います。心臓穿刺を使用して、麻酔をかけた動物からできるだけ多くの血液を採取します。

凝固を阻止するために、マイクロ遠心チューブ内で血液を最終濃度の3%酸性クエン酸デキストロースに加えます。次に、血液サンプルを1000チーズと摂氏4度で12分間スピンダウンします。次に、血清を収集し、各サンプルの100マイクロリットルでPBSで1〜10および1〜100に希釈します。

これらの2つの希釈で、96ウェルプレートに二重に希釈します。標準曲線を作成するには、元の80ミリグラム/ミリリットルの100マイクロリットルのサンプルを希釈します。フィッツデキストリンは、暗いマイクロ遠心分離管でPBSのマウスを強制経口避妊するために使用されました。

次に、標準サンプルを96ウェルプレートに3重に添加します。次に、蛍光計を使用して各サンプルの蛍光を定量化し、無菌技術を使用してFXIデキストリン濃度を決定し、このステップを開始するには、1ミリリットルの滅菌PBSとオートクレーブ金属ビーズを丸底から2ミリリットルの遠心分離チューブに追加します。次に、各チューブの重量を量ります。

次に、マウスからseumとcolonsを取り除いた後、seumをcolonsから分離し、縦に切り開きます。鉗子で管腔内容物を採取し、内容物をPBSのチューブに加えます。後遺症と結腸組織を滅菌PBSで洗浄してから、別々のチューブに入れます。

次に、組織のチューブを秤量し、ビーズビーターを使用してサンプルを6分間均質化します。30ヘルツで、ウェルあたり180マイクロリットルの滅菌PBSを96ウェルプレートに加えます。次に、均質化された各サンプルを20マイクロリットルを各列の最初のウェルに加え、よく混合します。

前の各ウェルから20マイクロリットルを追加してサンプルを連続希釈し、最初のウェルで10からマイナス1までの希釈を行い、10からマイナス6まで希釈します。次に、各サンプルから各希釈液の10マイクロリットルを、摂氏37度で一晩インキュベートした後、グリッド付きの正方形の底のLBプレートに三重にプレートします。1枚のプレート上のコロニー形成ユニットを数えます。

各サンプルの三重を平均化し、各サンプルがカウントされた希釈率を記録します。平均CFUに50を掛け、サンプルをカウントした希釈係数を掛けると、ミリリットルあたりのCFUが得られます。最後に、組織重量で割って、以前に保存した0.5センチメートルの結腸およびsecum切片の一晩後、形式的および固定後のグラムあたりのCFUを決定します。

翌朝、組織を70%エタノールで洗浄し、カセットに入れて組織学施設に送り、パラフィンに包埋し、ヘマチンとエオシンで染色して組織を脱パリゼーションします。スライドをコプラン染色ジャーに入れ、摂氏65度のウォーターバスで10分間置きます。次に、スライドをキシレンに入れて、2分間を4回洗います。

それぞれに5分間の洗浄を2回行い、エタノール100%を100%にすることでスライドを再水和し、続いて5分間の洗浄を1回行う。エタノール95%、エタノール75%、蒸留水。洗浄したスライドを予温クエン酸ナトリウム緩衝液を入れたコプランジャーに入れ、ジャーをさらに30分間室温で置いた後、ジャーを蒸し器に30分間入れ、スライドをPBS Ziedで5分間3回洗浄します。

スライドが乾いたら、ティッシュの周りをパップペンでマークします。次に、室温の免疫染色水分チャンバー内のブロッキングバッファーで組織をブロックします。1時間後、ブロッキングバッファーを注ぎ出し、50〜100マイクロリットルの一次抗体で4°Cで組織をインキュベートします。

インキュベーション期間後、PBS Aziで組織を3回5分間洗浄します。次いで、スライドを50〜100マイクロリットルの二次抗体にインキュベートし、1時間後に室温で暗所で、スライドを蒸留水で5分間3回洗浄する。最後に、組織を脱水し、スライドをdpi、長期の金封入剤で覆い、次いで蛍光顕微鏡でスライドを観察したカバースリップを塗布する。

この最初の図は、C 57 black sixマウスの血清中、およびToll様受容体からノックアウトマウスまでの血清で測定されたフィッツデキストリンを示しています。これらのマウスは、無傷の腸上皮バリアの存在下で感染時に上皮バリアの完全性が損なわれることがこれまでに発見されています。ZIデキストリンは、この層を通る透過性が不十分です。したがって、血清中のフィッツデキストリン濃度の上昇は、感染時の腸管上皮バリア完全性の障害を示唆しており、この分子が感染していないマウスの対照血清レベルとして漏れることを可能にしています。

フィッツデキストリンによる強制も紹介されています。Assentは、腸上皮細胞に密接に付着できる管腔病原体です。管腔内容物、後遺症および結腸組織中の細菌負荷は、7日目に発生する可能性があります。感染後。

結腸内の細菌量は、グラムあたり約10〜9CFUでピークに達することがわかっています。C 57 PL 6匹のマウスのC DUM感染中に観察された病理のほとんどは、感染後7日目までに結腸の遠位2センチメートルで肉眼的に発生します。結腸粘膜の肥厚、ならびに結腸の短縮および長さは、感染中に正常に観察される。

C 57 PL 6匹のマウスは、免疫細胞の浸潤、結腸陰窩の伸長、および性交細胞の枯渇によって組織学的に特徴付けられる中等度の炎症および病理に苦しむだけです。感染中に蓄積された宿主の応答をさらに特徴づけるために、ゼロ償還免疫蛍光染色は、増殖マーカーなどの目的のタンパク質の変化を調べたり、感染組織内での局在化などの細菌応答の側面を調べたりするために利用できます。この染色技術の一例として、赤で表示される細胞増殖のマーカーである宿主タンパク質KI 67と、感染後12日目に細菌の局在を調べるために緑色で表示されるゼロdeタンパク質涙を調べることがこの図に示されています。

一度習得すると、このテクニックは適切に行われれば数分で実行できます。この手順を試行する際は、マウスが感染していること、および感染の過程を通じて動物の健康状態が監視されていることを確認するために、測定手法を適切に実行することが重要です。過去10年から15年の間、シトロバクターげっ歯類モデルは、epecのような直面する細菌性病原体を一体に付着させる研究のゴールドスタンダードとなっています。

さらに、腸内でのTH17応答の発達など、細菌に対する粘膜免疫応答の研究でよく知られているモデルになっています。