Name: ザシトロrodentiumマウスモデル：感染性大腸炎に勉強病原体とホスト貢献 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 学ぶCitrobacter rodentiumを用いたマウス感染性大腸炎モデルの構築方法。経口投与による感染誘導、組織採取、免疫組織化学による病原体負荷と宿主応答の評価手法を解説する。

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この作品は、クローン病と潰瘍性大腸炎カナダの財団（CCFC）と健康研究（CIHR）のためのカナダの研究所からBAV、営業の補助金によって支えられている。 GBはCIHR卒業学生の身分によって賄われていた。 BAVは、小児消化器病の小児IBDの研究カナダリサーチチェアの腸管と肝疾患（子）財団議長児です。

1。 シトロrodentium接種およびマウスの経口胃管栄養の準備<ol><li>準備し、オートクレーブルリアベルターニ培地（LB）。 </li><li>実行可能なCを得る滅菌白金耳またはピペットチップを用いてLB寒天プレート上に凍結グリセロールストックとストリークからrodentium。 37℃で一晩インキュベートする。接種ループまたはピペットチップを用いてLBプレートからコロニーを持つファルコン培養管の滅菌LB培地3 mlを接種する。接種物の調製は、無菌技術を使用して行われるべきである。 </li><li> Cをインキュベートrodentium文化好気的に37℃、200rpmでベンチインキュベーションシェーカーで一晩。接種LBブロスは、一晩培養した後に濁って見えるはずです。 </li><li>一晩 、100μlの各マウスを強制経口投与した1mlシリンジに取り付け胃管栄養針をひっくり返した電球を使用して、 rodentium文化 。しっかりと首と背中の上にたるんだ皮膚をつかんで優しく首筋マウスを、親指と指を使って。頭部を固定し、強制給餌針の挿入のための食道をまっすぐに人差し指で動物の頭を後ろに引きます。 </li><li>直立姿勢でマウスを維持し、その口の側面に沿って、その舌の上に強制飼養針のバルブ先端を向ける。そっと口の屋根に沿って針を渡し、食道の下のそれを進める。この手順の中で感じた何らかの抵抗がある場合は、強制飼養針を取り外し、それを再挿入してください。 </li><li>ゆっくり細菌接種の100μlを注入し、静かに強制飼養針を外します。そのケージに戻した後、マウスの呼吸と動作を監視します。 </li></ol>注意： <ul><li>ステップ2および3で、またスープ自体のない細菌汚染がないことを確実にするために一晩培養する無菌LBブロス3mlで無菌技術を用いて鷹の培養管を準備します。 LBブロスで一晩培養した後に明らかに表示されます。 </li><li&gt;は静かに細菌の等しい用量は、ステップ4で、各マウスに配信されるように強制経口投与のための注射器をロードする前にファルコンチューブ内の文化を攪拌。 </li><li>それが24時間以上にわたって接種されている場合は一晩培養した培養液は捨てられるべきです。 </li><li>すべてのC. rodentiumの感染や感染動物の筐体は、バイオセーフティレベル2の施設で実施されなければならない。 </li></ul> 2。 Cの結腸上皮関門透過性を測定するrodentium感染マウス<ol><li>所望の時点、感染後に障壁の完全性を測定します。 </li><li>アッセイ当日、4 kDaのフルオレセインイソチオシアネート（FITC）デキストランは150μlの各マウスを強制経口投与し、標準曲線を準備するために80ミリグラムミリリットル-1の濃度になるように生理食塩水（PBS）に溶解し、リン酸緩衝十分な準備をします。 </li><li> FITC-デキストラン150μlの首筋マウスと強制経口投与。この時点でケージから餌を撤回します。 </li><li> 4時間後にマウスを麻酔gavagingと心臓穿刺を介して、できるだけ多くの血液（約450μl）のように収集しています。血液凝固を阻止するためにマイクロチューブに3パーセント酸 - クエン酸デキストロースの最終濃度に血液を追加します。マウスを安楽死させると細菌数（ステップ3.1から3.5）をPBS中結腸組織を収集し、組織固定のためにホルマリン、最終的には免疫蛍光染色10％（ステップ4.1から4.8）であった。 </li><li> 4℃で遠心機で12分間、1,000×gで血液サンプルをスピン血清を採取し、PBS中の1/10、1/100に希釈します。複製し、96ウェルプレートに、これらの2つの希釈で各試料100μlを加える。 </li><li> 800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、0μg/ mlの：標準曲線を準備するには、以下の濃度になるようにPBSでマウスを強制経口投与するために使用した元の80ミリグラムml -1の FITC-デキストランを薄める。三重で96ウェルプレートに各濃度の100μlを添加する。 </li><li> wavファイルで励起蛍光光度計を用いて、各サンプルの蛍光を定量485nmおよび535nmの発光波長のelength。 </li><li>標準曲線をプロットすることにより、生データを分析します。入力各サンプル中のFITC-デキストランの濃度を決定するために標準曲線によって生成された直線の方程式に各サンプルの生データ。 </li></ol>注意： <ul><li>手順4以降では、氷の上に血液サンプルを保持し、光への曝露を最小限に抑えます。 </li><li>重篤な組織損傷がこのポイントの後に発生するようにした時点で、または前に上皮バリアの完全性を測定する場合は、7日後の感染症は、最適です。深刻な被害が出現する前に、障壁の完全性を測定することは、あなたが Cの間に透磁率の最大の違いを判別することができマウス系統間でrodentium感染 。 </li><li>感染していないコントロールマウスも上皮バリアの完全性のためにテストされていることを確認します。 </li></ul> 3。 Cの組織における細菌負荷の測定rodentium感染マウス<ol><li> 1ミリリットル滅菌PBS追加ndはラウンドビーズオートクレーブした金属は無菌操作を用いて、2 mlの遠心チューブを底を打った。各動物から採取した個々の組織は、別々のPBSのチューブ内に配置されます。組織の添加前にチューブの重量を量る。 </li><li>マウスの盲腸および結腸を削除します。結腸から盲腸を分離し、鉗子を用いて管腔内容物を押し出す。 PBSのチューブにコンテンツを追加します。 10％ホルマリン固定のために遠位結腸と盲腸から0.5cmのセクションを分離した後、縦方向に残存結腸と盲腸を開き、チューブに組織を配置する前に、滅菌PBSで洗浄カット。 </li><li>組織をPBSチューブを計量した後、30 Hzで6分間ビーズビーターを使用してサンプルをホモジナイズする。 </li><li>無菌技術を用いて、96ウェルプレートにウェル当たり180μlの滅菌PBSを追加します。各行の最初のウェルに各均質化したサンプル20μlを添加する。よく混和して、連続的に希釈し、10 -1（最初の我々から希釈液を得るために、各ウェル以前から20μlを添加10 -6〜LL）。グリッド付きの正方形の底のLBプレートに三連で各試料からの各希釈液10μlをプレート。 37℃で一晩インキュベート℃、 </li><li>次に平均コロニー形成単位（CFU）、3カウントを数えて、各サンプルがカウントされたときの希釈を記録します。オリジナル1mlの試料20μlを使用したのと、50で平均CFUを掛けて、サンプルはCFU / mlで、結果としてカウントされたときの希釈率。最後に、CFU / gを決定するために組織重量で割る。 </li></ol> 4。組織学的評価と感染結腸組織の免疫蛍光染色<ol><li>ステップ3.2のように組織を採取します。ホルマリンで一晩ストア組織は、その後、70％エタノールで洗浄してください。パラフィンの組織を埋め込むと染色に5μmの切片を切った。組織学的評価のためにヘマトキシリン​​·エオシン染色および免疫蛍光染色のため、次のステップに進みます。 </li><li>場所のスライドで、前染色組織を脱パラフィンする65 10分間℃の水浴中でコプリン染色壺を置く。次に、2分間ずつ4回の洗浄のためにキシレンのプレーススライド。 95％エタノール、75％エタノールとdH 2 0：スライドは、次のそれぞれに1 5分間洗浄に続いて100％エタノールで2つの5分間の洗浄、再水和されるべきである。これらの洗浄は有害な蒸気への暴露を避けるために、ドラフト内で行う必要があります。 </li><li>あらかじめ温めておいたクエン酸ナトリウム緩衝液、その後30分間蒸し器に場所とコプリンジャーに入れ、スライドは、その後30分間放置します。このプロセスは、潜在的な抗原部位を取り出すホルマリン固定により形成されたタンパク質のクロスリンクが解除されます。 </li><li> 5分間、3回PBSアジドで洗ってください。 PAPのペンで組織の周りに乾いたスライドやマーク領域は、組織に局在染色試薬を維持し、疎水性の障壁を作成することができます。 </li><li>免疫染色水分チャンバ内のブロッキングバッファーを用いて室温で1時間（ 例えば 、α-ヤギ血清）のブロック組織。 </li><li>堅苦しい薄める抗体希釈バッファーを使用して所望の濃度に進抗体。ブロッキングバッファーを捨て、組織に一次抗体を50から100μlを添加する。 2時間4℃で一晩または室温でインキュベートする。 </li><li> 5分間、3回PBSアジドで洗ってください。暗闇の中で1時間室温でインキュベートする組織や抗体希釈バッファーで希釈した二次抗体の50〜100μlを添加する。 5分間、3回のdH 2 Oで洗浄します。 </li><li> DAPIはゴールドマウント培地を延長し、カバースリップを適用追加、スライドを脱水。蛍光顕微鏡下でスライドを表示します。 </li></ol>注意： <ul><li> PBSアジドは、ステップ4以降の洗浄培地で細菌の増殖を回避するための代替として新たに調製し、PBSで置換することができる。 </li></ul>

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<li>Simmons, C. P., Clare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+B+lymphocytes+and+CD4%2B+T+cells+in+immunity+to+infection+by+the+attaching+and+effacing+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).</li>
<li>Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Roles+of+Notch+and+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+Pathways+in+the+Regulation+of+Hyperplasia+and%2For+Colitis+in+Response+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection.</a> Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).</li>
</ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

シトロrodentium感染は、感染症およびマウスにおける大腸炎の両方を研究するための貴重なモデルを提供します。このユニークなモデルは、両方のホストの応答だけでなく、細菌の病原性の性質の特徴付けを可能にします。手順では、このプロトコルの詳細は、このモデルの成功した使用を概説した。 大腸炎を誘発し、応答を解析するときに留意すべきは、このプロトコルにはいくつか重要なステップがあります。まず、新鮮な一晩の準備LBブロスでrodentiumの接種は、マウスの正常な感染症のために必要です。 10 8 -10 9生物の線量が接種をシェーカーにまたは長期間室温でベンチの上に残っている場合、マウスのほとんどの株を感染させるために必要とされるように、文化の中で残っている十分な生菌が存在しません感染時に大腸炎を誘導した。それは前に細菌接種を攪拌することも重要である各マウスは、細菌の等しい線量を受けることを保証するために、感染症のために注射器をロードする。感染の末端上に組織を採取する際、発生することが適切...

腸内細菌の病原体による感染症は、下痢や腸上皮バリア機能障害を含むだけでなく腸の病理と病態生理として、消化管（GI）炎症をトリガします。細菌の病原体は、そのホストの消化管と同様に、このような感染症から身を守る特定の宿主応答を植民地になることによって病原性のメカニズムがよく理解されていない、腸内細菌感染症のモデリングでしかし最近の進歩は、これらのプロセスの理解を助けるために始めている。腸内細菌はまた、炎症性腸疾患（IBDs）にリンクされている。 IBDsクローン病（CD）とUCは慢性腸の炎症や組織の損傷によって特徴付けられる原因不明の複雑な疾患である。腸炎の多くのマウスモデルは、IL10などの遺伝的に改変された菌株での自発的な炎症から、存在している - / - マウスでは、化学の課題に対するデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）やdのような化合物とinitrobenzeneスルホン酸（DNBS）1。これは、IBD患者に存在する不適応な慢性炎症性応答は感染性大腸炎のモデルの研究はまた、潜在的に病原性のホストを定義するための大きな可能性を提供していますので、腸内細菌に腸管粘膜免疫系の異常被ばくによって遺伝的に感受性の個体で2を開発するという仮説が立てられている。腸内細菌への応答シトロrodentium誘発性大腸炎は、腸内細菌とIBDの病因の潜在的メカニズムのさらなる理解への宿主応答の解析を可能にする、よく1,3特徴付けられている感染性大腸炎の希少なモデルの一つであり、不可欠なステップ小説予防及び治療処置を開発インチ C. rodentiumは密接に重要なヒトに関連している（/ E）はグラム陰性取り付けると控えめ、ネズミ特有の細菌性病原体である病原体の病原性大腸菌大腸菌 （EPEC）及び腸管出血性大腸菌大腸菌 （EHEC）3-8。 / Eの病原体の家族が親密に宿主細胞上の非侵襲的な台座のような構造を形成し、盲腸と結腸上皮の根尖宿主細胞膜に付着。 Cと経口チャレンジ10 8 -10 9生物のrodentiumは陰窩、単核球の免疫細胞浸潤および杯細胞枯渇3,4の大腸過形成または伸長によって特徴付けられる感染性大腸炎の堅牢なモデルを生成します。植民地化の初期のサイトでは、数時間チャレンジ後、盲腸のパッチで2〜3日後に感染3遠位結腸に進行が続いています。免疫応答性マウス系統では、病原体のクリアランスは3〜4週間感染1,3,4後に達成される。しかし、多くの遺伝的に改変された菌株、 すなわち遺伝子欠損またはノックアウト（ - / - ）マウスは、increaを表示することが見出されている誇張された損傷および/ ​​または慢性の感染症や炎症9-14の結果感染に対する感受性をセッド。これらのノックアウト株ではこの感染性大腸炎モデルの使用は、生得的なシグナル伝達タンパク質を欠いている多くは、腸の感染症や炎症の解決に不可欠ないくつかの宿主タンパク質を明らかに不可欠となっています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> L培地</td><td> ABM </td><td> G247 </td><td> 1リットルの水にLBの粉末25グラムを追加します。使用前にオートクレーブ。 </td></tr><tr><td>グリッド付きの正方形の底板</td><td>フィッシャー</td><td> 08から757-11A </td><td></td></tr><tr><td>ファルコン培養管</td><td>ザルスタット</td><td> 62.515.006 </td><td></td></tr><tr><td>電球は胃管栄養針をひっくり返した</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 18060から20 </td><td></td></tr><tr><td> 1mlシリンジ</td><td> BD Biosciences社</td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 4 kDaのFITC-デキストラン</td><td>シグマ</td><td> FD-4 </td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>シグマ</td><td> C7129 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>フィッシャー</td><td> D16.1 </td><td></td></tr><tr><td>クエン酸デキストロース</td><td></td><td></td><td> 20mMのctiric酸、110mMのクエン酸ナトリウム、5 mMのブドウ糖</td></tr><tr><td>黒色96ウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td> 07-200-762 </td><td></td></tr><tr><td>メタルビーズ（5mm）を</td><td>キアゲン</td><td> 69989 </td><td></td></tr><tr><td> 10％ホルマリン</td><td>フィッシャー</td><td> 5F93-4 </td><td></td></tr><tr><td> 5mlのバイアル</td><td> DiaMed </td><td> STK3205 </td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>フィッシャー</td><td> H345-23 </td><td></td></tr><tr><td>エオシン</td><td>フィッシャー</td><td> E511-100 </td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャー</td><tD&gt; HC700-1GAL </td><td></td></tr><tr><td>ツイーン20 </td><td>シグマ</td><td> P5927 </td><td></td></tr><tr><td>コプリン染色瓶</td><td> VWR </td><td> 47751-792 </td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム緩衝剤</td><td></td><td></td><td> 10mMのクエン酸ナトリウム、0.05％ツイーン20、pH6.0の</td></tr><tr><td>パパニコロウペン</td><td> Cedarlane </td><td> Mu22 </td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>シグマ</td><td> G902-3 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td>フィッシャー</td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>シグマ</td><td> T8532 </td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> SZ002 </td><td></td></tr><tr><td>ブロッキングバッファーを</td><td></td><td></td><td> 2％ヤギ血清、1％BSA、0.1％トリトンX-100、0.05％のTween20、0.05％ナトリウムアジ化ナトリウム、0.01MのPBS、pH7.2中、4でミックス＆℃で保存</td></tr><tr><td>抗体希釈バッファー</td><td></td><td></td><td> 0.1％トリトンX-100、0.1％BSA、0.05％アジ化ナトリウム、0.04％EDTAを</td></tr><tr><td> TIR用のブロッキングバッファー＆抗体希釈バッファー</td><td></td><td></td><td>上記のようにしますが、洗剤の添加（トリトンX-100、Tween 20）でなくても同じレシピ</td></tr><tr><td> DAPIでゴールド褪色防止試薬を延長</td><td>インビトロジェン</td><td> P-36931 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャー</td><td> 12.54SE </td><td></td></tr><tr><td>ベンチインキュベーションシェーカー</td><td> Barnsteadラボライン</td><td>マックスQ4000 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光光度計</td><td>パーキンエルマー</td><td> Victor2D </td><td></td></tr><tr><td>冷凍遠心器</td><td>ベックマン·コールター</td><td>微量22R</td><td></td></tr><tr><td>蒸し器</td><td>ブラック＆デッカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>アクシオImage.Z1 </td><td></td></tr></tbody></table>

ザ<em&gt;シトロrodentium</em&gt;マウスモデル：感染性大腸炎に勉強病原体とホスト貢献

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

このプロトコルは、感染症や大腸炎の堅牢なモデルを生成するために必要な手順と同様に、マウスでシトロrodentium感染を特徴付けるために使用方法を概説します。C. rodentiumは密接に臨床的に重要なヒト病原体の病原性大腸菌に関連しているグラム陰性、マウスの特定の細菌性病原体である大腸菌と腸管出血性大腸菌大腸菌 。 Cと感染時にrodentium、免疫応答性マウスは、ささやかな、一時的な体重減少と下痢に苦しんでいます。組織学的には、腸陰窩の伸長、免疫細胞の浸潤、および杯細胞の枯渇が観察される。感染のクリアランスは3〜4週間後に達成される。感染後の異なる時点で腸上皮バリアの完全性、細菌負荷、および組織学的損傷の測定は、感染に感受性マウス系統の特性評価を可能にします。 病原性機構細菌の病原体は、そのホストの腸管を植民地と同様に、このような感染症から身を守る、特定のホストの応答が十分に理解されてs。したがってC.腸内細菌感染のrodentiumモデルは 、これらのプロセスの我々の理解を助けるための貴重なツールとして機能します。腸内細菌はまた、炎症性腸疾患（IBDs）にリンクされている。これは、IBD患者で見られる不適応な慢性炎症性応答が腸内細菌に腸の粘膜免疫系の異常な暴露後遺伝的に感受性の個人で開発したという仮説が立てられている。したがって、感染性大腸炎のモデルの研究では、腸内細菌への潜在的病原宿主応答を定義するための大きな可能性を提供しています。C. rodentium誘発性大腸炎は、IBDの病因の潜在的なメカニズムの理解を促進し、腸内細菌に対する宿主応答の解析が可能になり、そのような希少なモデルです。小説の予防や治療法の開発に欠かせない。

標準的な感染実験では、マウスは、100μlの一晩の強制経口投与によって、約2.5×10 8 CFUに感染しているrodentium文化 。 CとC57BL / 6マウスの感染ささやかな、一時的な体重減少と下痢でrodentium結果 。 C57BL / 6マウスを持つまれな出来事が、動物が病気になると安楽死が必要な場合があります。したがって、マウスは異なる株が感染症の影響を受けている程度を判断するために、体重減少などpiloerect毛皮や猫背の姿勢などの苦痛の症状の程度を監視する必要があります。 図1〜図4に示された結果は、凍結グリセロールストックから調製した一晩培養した培養液を使用して行う感染症の代表的なものである。 7日、感染後に、マウスを麻酔し、血液が心臓穿刺を介して収集された。血清で測定図1 FITC-デキストランC57BL / 6マウスのと同様に、以前に感染9時に損なわ上皮バリアの完全性...

シトロrodentium感染は腸内細菌感染症を勉強するだけでなく、マウスでは免疫応答や大腸炎をホストするための貴重なモデルを提供します。このプロトコルは、障壁の完全性、病原体負荷と病原体と宿主マウス感染性大腸炎への貢献を徹底特性評価を可能にする組織学的損傷の測定の概要を説明します。

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

この手順の全体的な目的は、グラム陰性鏡像病原体であるCitrobacter rodentをマウスに感染させて大腸炎を誘導し、胃腸管における病原体と宿主の相互作用を研究することです。これは、まずCitrobacter rodentのオーバーナイト培養液を接種し、次に、そのオーバーナイト接種液を経口ゾンデで投与してマウスに感染させることで達成されます。次に、感染後7日目の最終ステップで、盲腸、結腸および管腔内容物を回収します。組織をプレートに播種して細菌コロニー数を算出し、目的の宿主タンパク質について組織免疫染色を行います。最終的に、免疫組織化学染色を通じて、病原体量、バリア機能、組織学的損傷および宿主応答の変化を評価することができます。この手法は感染性大腸炎の堅牢なモデルを提供し、宿主と病原体の相互作用および免疫応答の研究を可能にするだけでなく、細菌感染が大腸がんのリスクに及ぼす影響を調べるために応用することも可能です。一般的に、この手法に慣れていない者は、マウスへの細菌感染や、その操作に苦慮することがあります。まず、滅菌済みの白金線を用い、凍結グリセロールストックから生存しているC redemptionをLB電極プレート上に画線して培養を開始してください。37 °Cで一晩インキュベートした後、白金 loopを使用して、LBプレートからコロニーを3 mLの滅菌済みLBブロスに転移させます。次に、E. coli DH5α（※原文ERO Dunumは誤記の可能性があるため文脈に応じた菌株名）培養液を、ベンチトップインキュベートシェーカーを用いて37 °C、200 RPMで一晩好気的に培養します。翌朝、接種したLBブロスは濁っているはずです。培養液を穏やかに撹拌して細菌細胞を均一に分散させた後、1 mLシリンジに培養液を充填し、胃管用針を装着します。親指と他の指でマウスの首と背中の緩い皮膚をしっかりと掴み、胃管挿入用の個体を選択します。次に、人差し指で動物の頭部を後方に引き、頭部を固定して食道を直線状に伸ばし、挿入しやすくします。マウスを直立させた状態で、経口ゾンデ（胃管）のバルブチップを動物の口の脇に沿わせ、舌の上を通します。針を口蓋に沿って慎重に挿入し、食道へと進めます。最後に、シリンジを用いて細菌接種液 100 µL をゆっくりと注入し、その後、慎重にゾンデを抜去します。マウスをケージに戻した後、アッセイ当日の呼吸数と行動を観察します。デモンストレーションした通りにマウスの項皮を保持し、調製したばかりのfitzy dextrin 150 microlitersを動物に経口投与します。この時点でケージから餌を取り除き、投与から4時間後に動物を鎮静させます。麻酔をかけた動物から、心穿刺を用いて可能な限り多くの血液を採取します。凝固を防ぐため、血液をマイクロ遠心チューブに入れ、最終濃度が3%となるようにクエン酸デキストロース溶液を加えます。次に、血液サンプルを4°C、1000×gで12分間遠心分離します。その後、血清を回収し、PBSを用いて1:10および1:100に希釈し、各サンプルを100 µLずつ分注します。これら2つの希釈液を96ウェルプレートにデュプリケートで分注します。標準曲線を調製するために、マウスの経口投与に使用した元の80 mg/mLのFitz Dextrinサンプル100 µLを、遮光マイクロ遠心チューブ内でPBSを用いて希釈します。次に、標準試料を96ウェルプレートに3連で分注します。その後、フルオリメーターを用いて各試料の蛍光強度を定量し、FXIデキストリン濃度を決定します。無菌操作を用い、まず2 mLラウンドボトム遠心チューブに滅菌済みPBS 1 mLとオートクレーブ済みメタルビーズを加えてください。その後、各チューブの重量を量ります。次に、マウスから盲腸と結腸を摘出した後、盲腸と結腸を切り離し、それぞれ縦方向に切開します。ピンセットで管腔内容物を回収し、PBSが入ったチューブに加えます。盲腸および結腸組織を滅菌PBSで洗浄し、それぞれ別のチューブに移します。次に、組織が入ったチューブの重量を測定し、ビーズミルを用いてサンプルを6分間ホモジナイズします。96ウェルプレートの各ウェルに、滅菌PBSを180 µLずつ分注します。その後、各行の最初のウェルに、ホモジナイズした各サンプルを20 µLずつ加え、十分に混合します。各前のウェルから20 µLずつ加え、最初のウェルの10⁻¹から10⁻⁶までの段階希釈系列を作成します。次に、各サンプルの各希釈液10 µLを、グリッド付きの平底LBプレートに3連で播種し、37 °Cで一晩培養します。1枚のプレート上のコロニー形成単位（CFU）を計測します。各サンプルの3連系の平均を算出し、各サンプルの計測時の希釈倍率を記録します。平均CFUに50およびサンプルの計測時の希釈倍率を掛け合わせ、1ミリリットルあたりのCFUを算出します。最後に、あらかじめ保存しておいた0.5センチメートルの結腸および盲腸切片を一夜かけてホルマリン固定した後の組織重量で除し、1グラムあたりのCFUを決定します。翌朝、組織を70% ethanolで洗浄し、カセットに入れて組織学施設へ送り、パラフィン埋没およびヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織の脱パラフィン処理を行います。スライドをコプラン染色瓶に入れ、65 °Cの恒温水槽で10分間処理します。次に、スライドをキシレンに入れ、2分間の洗浄を4回繰り返します。各スライドを100% ethanolで2回5分間洗浄して親水化し、続いて95% ethanol、75% ethanol、および蒸留水の順に、それぞれ5分間ずつ1回ずつ洗浄します。洗浄したスライドを、あらかじめ加温したクエン酸ナトリウム緩衝液が入ったコプランジャーに入れ、さらに30分間室温に置いた後、スチーマーに入れて30分間処理します。その後、スライドをPBSで5分間ずつ3回洗浄します。スライドが乾いたら、組織の周囲をパップペンでマークします。次に、免疫染色用加湿チャンバー内で、室温にてブロッキングバッファーを用いて組織をブロッキングします。1時間後、ブロッキングバッファーを捨て、50から100 µLの一次抗体中で組織を4 °Cで一晩インキュベートします。インキュベーション期間の後、組織をPBS Aziで5分間、3回洗浄します。次に、50〜100 µLの二次抗体を用いて、室温・暗所で1時間インキュベートした後、蒸留水で5分間、3回洗浄します。最後に、組織を脱水し、dpi prolonged gold mounting mediumで封入した後、カバーガラスを被せ、蛍光顕微鏡でスライドを観察します。この最初の図は、C 57 black sixマウスおよびtoll-like receptor 2ノックアウトマウスの血清で測定されたFitz dextrinを示しています。後者のマウスでは、正常な腸管上皮バリアが存在する場合でも、感染中に上皮バリアの完全性が損なわれることが以前に判明しています。ZI dextrinはこの層を透過しにくい性質を持っています。したがって、血清中のFitz dextrinレベルの上昇は、感染中に腸管上皮バリアの完全性が損なわれ、この分子の漏出が起こったことを示唆しています。対照として、非感染マウスの血清レベルも示しています。フィッツデキストリンを用いたガバージュ（経口投与）についても説明します。Assentは、腸上皮細胞に密着して付着することができる腔内病原体です。腔内内容物、盲腸、および結腸組織における細菌量は、感染後7日目に測定できます。結腸内の細菌数は、1グラムあたり10の9乗CFU付近でピークに達することが分かっています。C57PL/6マウスにおけるC. dum科の感染時に観察される病理学的変化の大部分は、感染後7日目までに、肉眼的に結腸の遠位2cmで発生します。感染中には、通常、結腸粘膜の肥厚および結腸の短縮が観察されます。C 57 PL sixマウスでは、免疫細胞の浸潤、結腸陰窩の伸長、および杯細胞の減少という組織学的特徴によって定義される、中程度の炎症と病理学的変化のみが認められます。感染中に誘発される宿主応答をさらに詳細に解析するために、免疫蛍光染色の手法を用いて、増殖マーカーなどの目的タンパク質の変化を調べたり、感染組織内での局在などの細菌応答の側面を検討したりすることが可能です。本図では、この染色技術の例として、感染後12日目における宿主タンパク質KI 67（細胞増殖マーカー、赤色で表示）およびzero deタンパク質tear（緑色で表示）を染め分け、細菌の局在を解析した結果を示しています。この手法に習熟すれば、適切に実施することで数分で完了させることができます。この手順を行う際は、マウスへの感染を確実にするため、および感染期間を通じて動物の健康状態を監視するために、ゲージング技術を正しく行うことが重要です。過去10年から15年にわたり、Citrobacter齧歯類モデルは、EPECなどの付着・侵入性細菌病原体の研究におけるゴールドスタンダードとなっています。さらに、腸管内におけるTH 17応答の形成など、細菌に対する粘膜免疫応答を研究するための広く認められたモデルとなっています。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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出典: Winston, J. A. ほか 臨床的に関連性のある クロストリジウム・ディフィシル 株のセフペラゾン処理マウスモデルR20291。 J. Vis. Exp. (2016年)このビデオは、抗生物質前処理マウスに クロストリジウム・ディフィシル...

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臨床的に関連のセフォペラゾン処理されたマウスモデル<em&gt;クロストリジウム・ディフィシル</em&gt;ひずみR20291

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マウスの遠位人工肛門、転用 c57bl/6 マウス大腸炎の新たなモデル

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免疫不全マウスへのCBir1 TCRトランスジェニックCD4+ T細胞の養子移入による腸管炎症の誘導

学ぶCitrobacter rodentiumを用いたマウス感染性大腸炎モデルの構築方法。経口投与による感染誘導、組織採取、免疫組織化学による病原体負荷と宿主応答の評価手法を解説する。

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