手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル
January 6th, 2013
レーザーマイクロダイセクションでは、実質の微量から選択された細胞の回復を可能にする技術です。ここでは、トランスクリプトーム研究のために使用される手術標本からヒト膵島を取得するためのプロトコルを記述します。我々のプロトコルは、このように彼らのコレクションを容易にして、ヒトβ細胞の内因自家蛍光を向上させます。
こんにちは、私は工科大学のテアハンズ研究所のドルテ、リーンレーザーです。マイクロダイセクションは、非常に少量の親腫瘍から特別な細胞集団を得ることを可能にする技術です。解剖された細胞は、トランスクリプトームおよびプロテオミクス研究、DNA評価、または染色体分析に使用できます。
ここでは、トランスクリプトーム研究に使用する手術標本からヒト膵臓メタ細胞を取得するためのプロトコルを提供します。膵臓組織を細かく切ります。クライオ型の中央に1枚ずつ置き、チルド包埋コンパウンドで覆います。
ティッシュをすぐに冷凍し、冷やした2つの材料ブータンで、摂氏マイナス80度で保存します。セクショニングラベル40の粘着スライドをクラクセスし、Christedチャンバー内で予冷します。凍結組織をOCTコンパウンドで試料ホルダーに固定し、クライオブロックをトリミングします。
厚さ10マイクロメートルの切片を40個カットします。スライドの裏側に指で触れて、セクションを配置する位置だけを温めるために、1つのセクションを1つのスライドに移します。クライオの死んだ内部でセクションを2〜3分間試し、その後マイナス80°Cで保存し、イオン試薬を準備し、セリーヌを除くすべての液体を氷上で冷やします。これにより、マイクロ解剖の前にペット細胞の内因性自家蛍光が増加します。
4つのセクションは毎回ディレーティングされます。一度に 2 つのセクションを処理します。最初にそれらを70%エタノールで30秒間固定します。
次に、5〜6回のクイックディップでセクションを洗います。以下、DPC処理水に。組織を100%エタノールで1分間脱水し、この手順を繰り返し、スライドをセリーヌで4分間インキュベートします。
その間に、別のセクションのペアの脱水を開始します。最後に、暗闇の中でスライドを3〜5分間風乾します。2つのスライドをホイルに背中合わせに配置することにより、組織を湿気から保護し、自家蛍光を漂白から保護します ラップ50mlチューブ 切片の前に、RNAで顕微鏡を洗浄し、接着キャップをロボムーバーに固定します。
スライドをステージに挿入し、キャップに触れずにキャップをセクションに近づけます。自己蛍光の優れた細胞領域を特定することにより、アイレットを位置特定します。ヒトの優れた細胞の内因性自家蛍光は、セットアップでは黄色に見えますが、膵管は明るい緑色の自家蛍光を示します。
フリーハンド選択ツールでより良い細胞領域を選択し、レーザーを開始してそれらをマイクロ解剖します。4つのディレーティングされたクライオセクションのアイレットを40〜60分以内に1つの接着キャップに解剖します。必要に応じて、キャップを顕微鏡のチェックポイントに移動して、キャプチャした組織を確認します。
ロボムーバーのキャップを外し、パイプで配管します。 10マイクロリットルの抽出バッファーを蓋に注入します。キャップを逆さまにして摂氏42度で30分間インキュベートします。
ライセートをスピンダウンし、チューブを標識し、摂氏マイナス80度でRNA抽出が可能になるまで保存します。Ationレーザー、マイクロ解剖、および溶解を40のクライオ解剖すべてで実施します。その後、10個のライセートを結合し、付属のプロトコルに従ってUR PU RNA単離キットを使用してRNA単離を続行し、11マイクロリットルのRNAを取得します。
一般に、マイクロディスクト組織の量とRNA収量との間に直接的な関係は見つかりませんでした 外科医による採取と病理医による検査後の膵臓標本の凍結との間の時間間隔の違いは、回復したRNAの品質と量を部分的に説明できる可能性があります。考慮すべきその他の重要な要素は、より高いRNA完全性を使用して、より低いエネルギーでマイクロ解剖に適用されるレーザーエネルギー、およびレーザーフォーカスとレーザー圧力カッターのポインティングポイントの距離です。また、接着キャップと接着キャップとの距離をできるだけ短くすることで、RNA量を最適化することができます。
レーザーマイクロダイセクション顕微鏡が利用可能であれば、キャプチャープロセス中にマイクロ解剖組織の損失を避けることができます。この手順は、膵臓部分切除術を実施する任意の研究機関で実施できるため、非糖尿病患者と糖尿病患者の両方からヒトのまぶた材料へのアクセスが増加します。
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概要
この記事では、外科標本からヒトの膵臓アイレットを回収するためのレーザーマイクロディセクションのプロトコルを提示します。この技術は、トランスクリプトーム研究のためのベータ細胞の収集を強化します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- トランスクリプトーム学
背景
- レーザーマイクロディセクションは、特定の細胞集団の分離を可能にします。
- 小さな組織サンプルに特に有用です。
- この技術は、トランスクリプトームおよびプロテオミクス解析を含む様々な研究に適用できます。
- 自己蛍光の改善は、対象となる細胞の収集を助けます。
研究目的
- ヒト膵臓アイレットを取得するための詳細なプロトコルを提供すること。
- トランスクリプトーム研究におけるベータ細胞の研究を容易にすること。
- 外科標本からの細胞収集の効率を高めること。
使用方法
- 膵臓組織に適用されるレーザーマイクロディセクション技術。
- 小さな断片に切断した組織サンプルの準備。
- 最適な切断のために組織を冷却された化合物に埋め込むこと。
- さらなる分析のためのベータ細胞の収集。
主要な結果
- ヒト膵臓アイレットの成功した分離。
- ベータ細胞の自己蛍光の改善が観察されました。
- プロトコルはトランスクリプトーム研究に有効であることを示しました。
- 小さなサンプルからの対象となる細胞集団の収集を容易にしました。
結論
- このプロトコルはヒト膵臓アイレットの回収を強化します。
- レーザーマイクロディセクションは細胞分析の有力なツールです。
- 改良された方法は、トランスクリプトーム研究におけるより良い洞察につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables precise isolation of human pancreatic beta cells from limited surgical specimens, addressing a critical bottleneck in transcriptomic studies of diabetes-relevant tissues. By enhancing intrinsic autofluorescence through ice-cold reagent processing, the protocol reduces tissue handling time and improves RNA preservation, directly supporting target validation in metabolic disease research. This approach strengthens mechanistic de-risking by providing purified cell populations for downstream omics applications in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure beta cell populations for pathway analysis in type 2 diabetes models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through rapid, accurate identification of target cells via enhanced autofluorescence, reducing false positives in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by providing consistent, high-integrity RNA inputs from microdissected islets.
- Operational Value: Supports reproducible quantitative outputs essential for screening readiness and platform reuse in biomarker discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by enabling transcriptomic analysis of human pancreatic islets directly linked to diabetic pathophysiology.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supplying defined cell populations for mechanistic follow-up studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis testing in early biology, supporting assay development through standardized inputs, and informing translational decisions via quantitative molecular profiling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating beta cells for functional target validation in metabolic disease models.
- Screening: Delivers assay-ready samples with reproducible RNA yields, critical for screening compound effects on isolated islets.
- Analytics: Generates quantitative transcriptomic readouts that allow comparison between diabetic and non-diabetic states to inform lead identification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing human-relevant samples that bridge in vitro findings to disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for accessing primary human islets across multiple projects, reducing dependency on variable donor sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in beta cell-specific signaling pathways.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through controlled tissue processing and defined dissection parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in human-relevant cells, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diabetes targets based on validated human islet transcriptomic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, cryosectioning, and laser microdissection instrumentation.
- Dependent on access to a PALM MicroBeam system or equivalent LMD platform with AutoLPC capability.
- Necessitates standardized reagent handling protocols to maintain autofluorescence and RNA integrity across users.
- Involves adaptation considerations for varying pancreatic specimen quality and ischemic time between harvest and freezing.
- Limited by RNA yield constraints, necessitating pooling of multiple microdissected samples for sufficient input to downstream kits.
