手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル
2013年1月6日
レーザーマイクロダイセクションでは、実質の微量から選択された細胞の回復を可能にする技術です。ここでは、トランスクリプトーム研究のために使用される手術標本からヒト膵島を取得するためのプロトコルを記述します。我々のプロトコルは、このように彼らのコレクションを容易にして、ヒトβ細胞の内因自家蛍光を向上させます。
こんにちは、私は工科大学のテアハンズ研究所のドルテ、リーンレーザーです。マイクロダイセクションは、非常に少量の親腫瘍から特別な細胞集団を得ることを可能にする技術です。解剖された細胞は、トランスクリプトームおよびプロテオミクス研究、DNA評価、または染色体分析に使用できます。
ここでは、トランスクリプトーム研究に使用する手術標本からヒト膵臓メタ細胞を取得するためのプロトコルを提供します。膵臓組織を細かく切ります。クライオ型の中央に1枚ずつ置き、チルド包埋コンパウンドで覆います。
ティッシュをすぐに冷凍し、冷やした2つの材料ブータンで、摂氏マイナス80度で保存します。セクショニングラベル40の粘着スライドをクラクセスし、Christedチャンバー内で予冷します。凍結組織をOCTコンパウンドで試料ホルダーに固定し、クライオブロックをトリミングします。
厚さ10マイクロメートルの切片を40個カットします。スライドの裏側に指で触れて、セクションを配置する位置だけを温めるために、1つのセクションを1つのスライドに移します。クライオの死んだ内部でセクションを2〜3分間試し、その後マイナス80°Cで保存し、イオン試薬を準備し、セリーヌを除くすべての液体を氷上で冷やします。これにより、マイクロ解剖の前にペット細胞の内因性自家蛍光が増加します。
4つのセクションは毎回ディレーティングされます。一度に 2 つのセクションを処理します。最初にそれらを70%エタノールで30秒間固定します。
次に、5〜6回のクイックディップでセクションを洗います。以下、DPC処理水に。組織を100%エタノールで1分間脱水し、この手順を繰り返し、スライドをセリーヌで4分間インキュベートします。
その間に、別のセクションのペアの脱水を開始します。最後に、暗闇の中でスライドを3〜5分間風乾します。2つのスライドをホイルに背中合わせに配置することにより、組織を湿気から保護し、自家蛍光を漂白から保護します ラップ50mlチューブ 切片の前に、RNAで顕微鏡を洗浄し、接着キャップをロボムーバーに固定します。
スライドをステージに挿入し、キャップに触れずにキャップをセクションに近づけます。自己蛍光の優れた細胞領域を特定することにより、アイレットを位置特定します。ヒトの優れた細胞の内因性自家蛍光は、セットアップでは黄色に見えますが、膵管は明るい緑色の自家蛍光を示します。
フリーハンド選択ツールでより良い細胞領域を選択し、レーザーを開始してそれらをマイクロ解剖します。4つのディレーティングされたクライオセクションのアイレットを40〜60分以内に1つの接着キャップに解剖します。必要に応じて、キャップを顕微鏡のチェックポイントに移動して、キャプチャした組織を確認します。
ロボムーバーのキャップを外し、パイプで配管します。 10マイクロリットルの抽出バッファーを蓋に注入します。キャップを逆さまにして摂氏42度で30分間インキュベートします。
ライセートをスピンダウンし、チューブを標識し、摂氏マイナス80度でRNA抽出が可能になるまで保存します。Ationレーザー、マイクロ解剖、および溶解を40のクライオ解剖すべてで実施します。その後、10個のライセートを結合し、付属のプロトコルに従ってUR PU RNA単離キットを使用してRNA単離を続行し、11マイクロリットルのRNAを取得します。
一般に、マイクロディスクト組織の量とRNA収量との間に直接的な関係は見つかりませんでした 外科医による採取と病理医による検査後の膵臓標本の凍結との間の時間間隔の違いは、回復したRNAの品質と量を部分的に説明できる可能性があります。考慮すべきその他の重要な要素は、より高いRNA完全性を使用して、より低いエネルギーでマイクロ解剖に適用されるレーザーエネルギー、およびレーザーフォーカスとレーザー圧力カッターのポインティングポイントの距離です。また、接着キャップと接着キャップとの距離をできるだけ短くすることで、RNA量を最適化することができます。
レーザーマイクロダイセクション顕微鏡が利用可能であれば、キャプチャープロセス中にマイクロ解剖組織の損失を避けることができます。この手順は、膵臓部分切除術を実施する任意の研究機関で実施できるため、非糖尿病患者と糖尿病患者の両方からヒトのまぶた材料へのアクセスが増加します。
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概要
本記事では、外科手術検体からヒト膵島を回収するためのレーザーマイクロダイセクションのプロトコルを紹介します。この手法により、トランスクリプトーム解析に向けたベータ細胞の回収効率が向上します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- トランスクリプトーム解析
背景
- レーザーマイクロダイセクションにより、特定の細胞集団を単離することが可能です。
- この手法は、特に少量の組織サンプルに有用です。
- 本技術は、トランスクリプトーム解析やプロテオーム解析を含む、さまざまな研究に適用できます。
- 自家蛍光を改善することで、標的細胞の回収が容易になります。
研究目的
- ヒト膵島を取得するための詳細なプロトコルを提供すること。
- トランスクリプトーム研究におけるベータ細胞の研究を促進すること。
- 手術検体からの細胞回収効率を向上させること。
使用された手法
- 膵臓組織に適用されたレーザーマイクロダイセクション技術。
- 組織サンプルを小さく切断することによる調製。
- 最適なダイセクションのための、冷却化合物への組織の包埋。
- さらなる解析のためのベータ細胞の回収。
主要な結果
- ヒト膵島アイレットの分離に成功した。
- ベータ細胞の自家蛍光の改善が観察された。
- 本プロトコルがトランスクリプトーム研究に有効であることが示された。
- 少量のサンプルから標的細胞集団の回収が容易になった。
結論
- 本プロトコルは、ヒト膵島細胞の回収率を向上させます。
- レーザーマイクロダイセクションは、細胞解析において有用なツールです。
- 手法の改善により、トランスクリプトーム研究におけるより深い知見が得られる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
レーザーマイクロダイセクションにより、限定的な外科的検体からヒト膵β細胞を精密に単離することが可能となり、糖尿病関連組織のトランスクリプトーム研究における重大なボトルネックが解消されます。氷冷試薬による処理で固有の自発蛍光を増強させることで、本プロトコルは組織のハンドリング時間を短縮し、RNAの保存性を向上させ、代謝疾患研究におけるターゲットバリデーションを直接的に支援します。このアプローチは、初期探索ワークフローにおけるダウンストリームのオミクス解析に向けて精製された細胞集団を提供し、メカニズム解明によるリスク低減を強化します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：2型糖尿病モデルにおけるパスウェイ解析のために、純粋なβ細胞集団を単離することで、治療仮説の検証を可能にします。
- 運用的価値：強化された自家蛍光による標的細胞の迅速かつ正確な同定を通じて、生物学的リスクの低減を促進し、標的選択における偽陽性を減少させます。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： マイクロダイセクションで回収した膵島から、一貫性のある高完全性のRNAインプットを提供することで、アッセイ標準化のための検証済み生物学的システムを準備します。
- 運用的価値： バイオマーカー探索パイプラインにおけるスクリーニング準備およびプラットフォームの再利用に不可欠な、再現性のある定量的なアウトプットを支援します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：糖尿病の病理生理に直接関連するヒト膵島（膵島細胞）のトランスクリプトーム解析を可能にすることで、疾患との関連性を維持します。
- 運用的価値：メカニズムの追跡研究に不可欠な定義済み細胞集団を提供することで、発見から前臨床検証までの継続性を確保します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期生物学における仮説検証を可能にし、標準化されたインプットを通じてアッセイ開発を支援し、定量的な分子プロファイリングによってトランスレーショナルな意思決定に情報を与えることで、研究のディスカバリー・コンティニュアム（発見の連続体）に統合されます。
- ディスカバリーバイオロジー：代謝性疾患モデルにおける機能的なターゲット検証のためにベータ細胞を単離することで、パスウェイの解明と生物学的リスクの軽減を支援します。
- スクリーニング：再現性のあるRNA収量を持つアッセイ準備済みサンプルを提供し、単離された膵島に対する化合物の影響をスクリーニングする際に不可欠な役割を果たします。
- アナリティクス：糖尿病状態と非糖尿病状態の比較を可能にする定量的なトランスクリプトーム解析結果を生成し、リード化合物の同定に役立てます。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでの知見を疾患メカニズムへと橋渡しするヒト由来の関連サンプルを提供し、前臨床段階への継続性を確保します。
- エンタープライズ再利用：複数のプロジェクトにわたって一次ヒト膵島にアクセスできる再利用可能な能力を確立し、変動しやすいドナーソースへの依存度を低減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：β細胞特有のシグナル伝達経路におけるメカニズム的な曖昧さを排除し、予測の信頼性を高める。
- 運用的価値：組織処理の制御と解剖パラメータの明確化により、標準化と再現性を向上させる。
- 戦略的価値：ヒトに関連する細胞におけるターゲットエンゲージメントの早期評価を可能にし、後期段階の生物学的リスクを軽減することで、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：検証済みのヒト膵島トランスクリプトームプロファイルに基づき、糖尿病ターゲットのリスク調整後の優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- 組織学、凍結切片作成、およびレーザーマイクロダイセクション装置に関する専門知識が必要です。
- AutoLPC機能を備えたPALM MicroBeamシステムまたは同等のLMDプラットフォームへのアクセスが前提となります。
- ユーザー間で自家蛍光およびRNAの完全性を維持するため、標準化された試薬取り扱いプロトコルが必要です。
- 膵臓検体の品質や、採取から凍結までの虚血時間のばらつきに応じた調整が必要となります。
- RNA収量に制約があるため、後続のキットに十分な入力を確保するには、マイクロダイセクションした複数のサンプルをプールする必要があります。
