黒色腫と扁平上癌幹細胞を用いた新規樹状細胞ワクチンの生成

本手順の全体的な目的は、免疫能を有するホストにおいて、がん幹細胞（CSC）またはCSCベースの樹状細胞（DC）ワクチンの抗腫瘍免疫を評価することです。まず、不均一な腫瘍細胞から、アルデヒド脱水素酵素陽性またはALDH highのCSCを単離します。次に、CSC由来のDCを単離し、ワクチン用のライセートでパルス処理します。

次に、CSCライセートパルスDCまたはTP DCワクチンを、正常な同系免疫能を有するホストに投与します。そして最終ステップとして、C-S-C-T-P-D-Cワクチンの抗腫瘍保護効果を評価します。最終的に、ELI SAを実施することで、ホストのT細胞および抗体によるC-S-C-T-P-D-Cワクチン誘発性の抗CSC免疫を評価できます。

本プロジェクトでは、がん研究における最もエキサイティングな2つの領域である、がん幹細胞と腫瘍免疫療法の分野を融合させています。当研究室は、固形癌におけるがん幹細胞を世界で最初に見出した研究グループの一つです。これらのがん幹細胞は、がんの増殖および転移を推進する「種」となるものです。

本日は、これらのがん幹細胞を特異的に標的とする、免疫療法を用いた新しいアプローチをご紹介します。私たちは、Alde fluoro assayで検出可能なアルデヒド脱水素酵素と呼ばれる特定のマーカーを利用します。Lin Liu博士とHuon Tau博士が、Chow Lee博士と共に作業を行う様子をご覧いただきます。

これらのがん幹細胞を標的とすることで、多くの種類のがん患者の治療成績が向上することを期待しています。まず、目的の腫瘍細胞をアッセイバッファーに懸濁し、濃度を1×10⁶ cells/mLに調整します。次に、腫瘍細胞のうち3 mLを除いた全量を各サンプルチューブに分注し、4本の12×75 mmポリスチレン製コントロール試験管に、unstained、ALOR、ALOR plus DEAB、7-AADとそれぞれラベルを貼ります。unstainedおよび7-AADのチューブに細胞懸濁液を1 mLずつ、ALORのチューブに2 mL分注します。

次に、ALOR plus DEABチューブに5 µLのDEABを加えます。チューブを氷上に置き、ALORチューブに10 µLの活性化alor基質を加えて混合します。直ちに基質溶液1 mLをALOR plus DEABチューブに移し、その後、各サンプルチューブに細胞100万個あたり2 µLの活性化alor基質を加えます。

すべてのチューブを37 °Cの水槽で30分間インキュベートし、次に7-AADチューブに7-AADを5 µL、各サンプルチューブには細胞1 million個あたり1 µLの7-AADを添加します。これらのチューブを4 °Cで10分間保持します。すべてのチューブを室温で250 ×gで5分間遠心分離し、ペレットをAldeFluorアッセイバッファーに再懸濁して、フローサイトメトリー（FACS）に供します。

ソーティングゲートを設定するには、Aldefluor plus DEAB処理細胞を陰性コントロールとして、7-AAD染色細胞を生存率コントロールとして使用します。これらのコントロールに基づき、Aldefluor陽性、7-AAD低、D5およびSCC7細胞を識別するためのゲートを設定します。その後、これを用いてサンプル細胞をAldefluor陽性、7-AAD低、D5およびSCC7の各集団にソートします。

樹状細胞を生成するために、まずC 57BL/6マウスおよびC3Hマウスから大腿骨と脛骨を単離します。骨を75% ethanolで室温にて1分間滅菌し、その後HBSSで洗浄します。次に、骨の両端を切り落とし、21G針を装着した10 mLシリンジを用いて骨髄をペトリ皿に洗い出します。細胞を数回吸引および分注して単細胞懸濁液を作成し、その後、細胞を遠心分離して回収します。

ペレットを5 mLの赤血球溶血バッファーに懸濁し、37 °Cのウォーターバスで1分間インキュベートします。細胞数をカウントした後、GM-CSFおよびIL-4を添加した培地を用いて、細胞密度を1 × 10⁶ cells/mLに調整します。その後、細胞を37 °C、5% CO₂条件下で培養し、3日ごとに培地とサイトカインを更新します。

5日目に、未熟樹状細胞を回収します。細胞を遠心分離した後、ペレットを5 mLの培地で再懸濁し、その後、調製したばかりの分離培地の上に細胞懸濁液をゆっくりと重層します。再び細胞を遠心分離し、培地層と分離培地層の間にあるDCを回収します。

その後、細胞数をカウントし、GM-CSFおよびIL-4を添加した培地を用いて、細胞濃度を1×10⁶ cells/mLに調整します。次に、ソートした細胞を迅速な凍結融解に4回さらし、続いて遠心分離を行うことで、ライセートの膜画分を回収し、腫瘍ライセートを作成します。その後、ソートした自己ALDH high細胞由来のライセートでDCをパルスし、CSC TPCを調製します。

H-T-P-D-Cパルスを調製し、未分別の不均一な腫瘍細胞溶解物を用いてDCsを刺激し、実験動物にワクチン接種を行う。パルス細胞 1×10⁶個を100 µLのPBSに懸濁し、各マウスの左側腹部に皮下注射する。ワクチン接種後、C57BL/6受容マウスに不均一なD5腫瘍細胞 1×10⁵個を100 µLのPBSで静脈内投与し、チャレンジを行う。SCC7モデルでは、DCワクチンの反対側に、未分別のSCC7腫瘍細胞 1×10⁶個を100 µLのPBSでC3H受容マウスに皮下注射してチャレンジを行う。

レシピエントのC3 Hマウスの脾臓から単一細胞懸濁液を作成します。次に、適切な刺激剤を添加した培地中で、固定化抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体を用いて脾臓のT細胞およびB細胞を活性化させます。4日後、上清を回収し、インターフェロンγ、GM-CSF、またはIgGに対する抗体をELISAプレートにコーティングし、4°Cで一晩置きます。翌日、非特異的結合をブロックし、標準品および先ほど回収した上清を分注して室温でインキュベートします。洗浄後、HRP検出抗体を添加して1時間置き、その後TMB基質を添加します。

最後に、反応停止後30分以内にELISAプレートリーダーを用いて450 nanometersで吸光度を測定します。Alorは、D5およびSCC7の2つの癌幹細胞濃縮集団を含む複数の悪性腫瘍において、幹細胞を単離するためのマーカーとして使用されてきました。これらのドットプロットに示されているように、培養されたD5およびSCC7腫瘍細胞株において、Alor陽性細胞はそれぞれ約0.5%および5.2%寄与しています。また、in vivoで確立されたD5およびSCC7腫瘍から採取した新鮮な腫瘍細胞においても、Alor陽性細胞がそれぞれ2.5%および4.2%含まれていることが判明しています。

D-E-A-B-A特異的A LDH阻害剤で処理した腫瘍細胞を陰性対照として使用しました。がん幹細胞の免疫原性は、前述のワクチン接種モデルを用いて、CSC TPCによって誘導される保護的な抗腫瘍免疫を調べることで評価しました。本表に示すように、H TPCで処理したマウスは、PBSのみで処理したマウスよりも肺転移の数が少なくなりました。

重要なことに、CSCT PCで処理したマウスは、H-T-P-D-CまたはPBSのみで処理した動物よりも肺転移がさらに少なかった。SCC sevenモデルにおいて、対照群と比較して、正常なC3 H動物に上述の通りワクチン接種を行った。HTPCは緩やかな抗腫瘍免疫を誘導したが、CSCT PCは著しい腫瘍増殖抑制を誘導した。これらの結果は、腫瘍細胞の攻撃に対する防御免疫を誘導するために、従来の分画されていない腫瘍細胞よりも、CSCがDCへのローディングに有効な抗原源として利用できる可能性を示唆している。

観察されたCSC誘導性の抗腫瘍保護免疫の根底にあるメカニズムをさらに理解するため、DCワクチン接種動物から採取した細胞を活性化し、そのサイトカイン産生量を先ほど実演した方法でELISAにより測定しました。その結果、D5 CSC TPCsまたはSCC7 CSC PCsを接種した動物から採取した細胞では、D5 HTPCsまたはSCC7 HTCsを接種した動物から採取した細胞よりも、サイトカイン産生量が有意に高いことが示されました。本日は、がん幹細胞を単離するためのAlamar assayの使用方法について解説しました。

これらのがん幹細胞は、樹状細胞を利用した免疫療法の開発に使用できます。これらの免疫療法を単独で、あるいは既存の治療法と組み合わせて使用することで、多くの種類のがん患者さんの見通しが改善されることが期待されます。