黒色腫と扁平上癌幹細胞を用いた新規樹状細胞ワクチンの生成

この手順の全体的な目標は、免疫適格宿主におけるがん幹細胞または CSC ベースの樹状細胞または DC ワクチンの抗腫瘍免疫を評価することです。これは、最初に不均一な腫瘍細胞からアロール陽性アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはA LDH高CSCを単離することによって達成されます。2番目のステップでは、CSC dcsを単離し、ワクチン用のライセートでパルス化します。

次に、CSCライセートPulses DCまたはTP DCワクチンを正常な同系免疫宿主に投与します。次に、最終ステップで、C-S-C-T-P-D-Cワクチンの防御抗腫瘍効果が評価されます。最終的には、ELI SAを実施して、宿主のt細胞と抗体によるC-S-C-T-P-D-Cワクチン誘導性抗CSC免疫を評価することができます。

このプロジェクトは、がん研究の最もエキサイティングな2つの分野、つまりがん幹細胞の分野と腫瘍免疫療法の分野を結集しています。私たちの研究室は、固形腫瘍からがん幹細胞を最初に発見した研究室の1つです。これらは、その成長と転移を促進する癌の種子です。

今日ご紹介するのは、免疫療法を使用してこれらのがん幹細胞を特異的に標的とする新しいアプローチです。私たちは、アルデフルオロアッセイで検出できるアルデヒドデヒドロゲナーゼと呼ばれる特定のマーカーを利用しています。リン・リュー医師とヒューオン・タウ医師がチョウ・リー医師と一緒に働いているのを見ることができます。

これらのがん幹細胞を標的とすることで、多くの種類のがん患者さんの転帰が改善されることを願っています。まず、目的の腫瘍細胞をアロールアッセイバッファーに10倍から6細胞/ミリリットルの濃度で懸濁します。次に、腫瘍細胞の3ミリリットルを除くすべてのサンプルチューブを各サンプルチューブに移し、次のように4本の12×75ミリメートルポリスチレン制御試験管を標識し、未染色のアローアロールとDEABと7つのA Aダを未染色の細胞懸濁液に1ミリリットルを分注し、7つのA AのDチューブと2ミリリットルをアルデフロアチューブに分配します。

次に、5マイクロリットルのDEABをALORとDEABチューブに追加します。チューブを氷の上に置き、10マイクロリットルの活性化アロール基質をアローチューブに混合します。直ちに1ミリリットルの基質溶液をALOR plus DEABチューブに移し、その後、100万細胞あたり2マイクロリットルの活性化ALOR基質を各サンプルチューブに加えます。

すべてのチューブを摂氏37度の水浴で30分間インキュベートし、次に7つのA a dの5マイクロリットルを7つのA a Dチューブに追加し、100万個の細胞あたり1マイクロリットルの7A a dを各サンプルチューブに追加します。これらのチューブを摂氏4度で10分間保持します。室温でGの250倍ですべてのチューブを5分間遠心分離し、蛍光活性化細胞ソーティングのためにペレットをAlde Fluorアッセイバッファーに再懸濁します。

ソーティングゲートを設定するには、alde Fluor plus DEAB細胞をネガティブコントロールとして、7つのA a D染色細胞を生存率コントロールとして使用します。これらのコントロールに基づいて、オーラル陽性のA LDH、高D 5およびSCCの7つの細胞を区別するための歩行を確立する。次に、これを使用して、サンプル細胞をアロー陽性のA LDH、高D 5、およびSCC 7の集団に分類します。

樹状細胞を生成するには、まず、C57、ブラックシックス、およびC3Hマウスから大腿骨と脛骨を単離します。骨を75%エタノールで室温で1分間滅菌し、HBSSで洗浄します。次に、骨の端を切り取り、21ゲージの針を備えた10ミリリットルの注射器を使用して骨髄をシャーレに洗い流し、細胞を数回吸引して分注して単一細胞懸濁液を作成し、細胞をスピンダウンします。

ペレットを5ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に37°Cの水浴中で1分間インキュベートします。細胞をカウントした後、G-M-C-S-FおよびIL 4を添加した培養培地で1ミリリットルあたり6個の細胞に10の1倍に容量を調整します。次に、細胞を摂氏37度、CO2 5%で培養し、3日後に培地とサイトカインをリフレッシュします。

5日目に、未熟な樹状細胞を採取します。細胞をスピンダウンした後、ペレットを5ミリリットルの培養培地に再懸濁し、新たに調製した単離培地に細胞懸濁液をゆっくりと重ねます。細胞を遠心分離した後、再度、培地と単離培地層の間にdcsを回収します。

その後、細胞をカウントした後、容量を1×10に10倍に調整し、培養培地中の6細胞あたり1ミリリットルの濃度に、G-M-C-S-FおよびIL 4を添加して、選別された細胞を急速凍結融解曝露に4回さらし、その後遠心分離して溶解物の膜部分を収集することにより、腫瘍溶解物を作成する。次に、ソーティングされた自家A LDH高細胞からのライセートでDCSをパルスします。CSC TPC を準備するため。

H-T-P-D-Cパルスを調製するために、未分類の不均一腫瘍細胞溶解物を投与するdcsを実験レシピエント動物にワクチンを接種し、パルス細胞の1回10〜6分の1を皮下注射し、ワクチン接種後に各マウスの左脇腹にPBSを100マイクロリットルに懸濁して静脈内注射し、PBSの100マイクロリットル中に5つの腫瘍細胞を不均一に1回10〜5Dを投与してC57黒6レシピエントマウスに挑戦する。SCC 7モデルの場合、皮下モデル。DCワクチンの反対側にPBSの100マイクロリットル中に1回10〜6回目の未分類のSCC7腫瘍細胞をC3Hレシピエントマウスに挑戦させる。

レシピエントC3 Hマウスの脾臓から単一細胞懸濁液を作成します。次に、4日後に適切な刺激を補充した培養培地に固定化された抗CD 3および抗CD 28モノクローナル抗体で脾臓T細胞およびB細胞を活性化し、上清を収集し、次いでインターフェロンγG-M-C-S-FまたはIgGに対する抗体でElizaプレートを摂氏4度で一晩コーティングする。翌日、非特異的結合プレート、標準試料、および採取したばかりの上清をブロックし、洗浄後にプレートを室温でインキュベートし、HRP検出抗体を1時間添加した後、TMB基質を添加します。

最後に、反応を停止してから30分以内に、ELISAプレートリーダーで450ナノメートルの吸光度を測定します。アローは、これらのドットプロットで示されているように、特にこれらのドットプロットで示されているように、2つのがん幹細胞が豊富な集団D5およびSCCセブンを含む複数の悪性腫瘍の幹細胞を単離するためのマーカーとして使用されており、アロー陽性細胞は、培養DファイブおよびSCCセブン腫瘍細胞株の約0.5%および5.2%にそれぞれ寄与しています。採取されたばかりの腫瘍細胞には、in vivoで確立されたD5およびSCC7腫瘍からのアロー陽性細胞の2.5%および4.2%がそれぞれ含まれていることも確認されています。

D-E-A-B-A特異的A LDH阻害剤で処理した腫瘍細胞をネガティブコントロールとして使用した。がん幹細胞の免疫原性は、CSC TPCによって誘導される防御抗腫瘍免疫を、先ほど実証されたワクチン接種モデルを用いて調べることによって評価されました。この表に示すように、H TPCで治療されたマウスは、PBSのみで治療されたマウスよりも肺転移が少なかった。

重要なことに、CSCT PCで治療されたマウスは、H-T-P-D-CまたはPBSのみで治療された動物よりも肺転移が依然として少なかったSCC 7モデルでは、正常なC3 H動物が対照群と比較して今実証されたようにワクチン接種されました。H TPCは中程度の抗腫瘍免疫を誘導し、CSC TPCは有意な腫瘍増殖阻害を誘導した。これらの結果は、CSCが、腫瘍細胞の挑戦に対する防御免疫を誘導するために、従来の未分類の腫瘍細胞よりもdcをロードするためのより効果的な抗原源として使用できる可能性があることを示しています。

観察されたCSC誘導性防御抗腫瘍免疫の根底にあるメカニズムをさらに理解するために、DCワクチン接種動物の細胞を活性化し、そのサイトカイン産生をEISAによって測定しました。これは、D 5 CSC TPCまたはS CCC 7 CSC PCをワクチン接種した動物から採取した細胞によるサイトカイン産生が有意に高かったことを実証したばかりです。次に、D 5 H TPCまたはSCC 7 HTCsをワクチン接種した動物から収穫したもの。今日は、Aloアッセイを使用してがん幹細胞を単離する方法を見てきました。

これらのがん幹細胞は、樹状細胞を利用した免疫療法の開発に利用することができます。これらの免疫療法を単独で、または既存の治療法と組み合わせて使用することで、多くの種類のがん患者の見通しが改善されることを願っています。