Name: 黒色腫と扁平上癌幹細胞を用いた新規樹状細胞ワクチンの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 学ぶ黒色腫と扁平上皮癌のALDH高発現がん幹細胞を用いた樹状細胞ワクチン作成法。免疫活性ホストにおける抗腫瘍免疫誘導メカニズムと評価手法を解説し、従来法より優れた免疫応答を実証する。

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この研究は、ミシガン大学総合がんセンターのウィルとジャンヌ・コールドウェル寄付研究基金によって、そして部分的にはNIH助成金CA82529とギルソンロンゲンボー財団によって支援されました。

1. アルデフルオール染色
<ol><li>細胞サンプル調製:培養腫瘍細胞または採取したばかりの腫瘍サンプルから、腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を調製する。細胞を数え、ALDEFLUORアッセイバッファー内の1 x 106 細胞/mlの濃度に細胞懸濁液を調整します。</li>
	<li>コントロールチューブとして4つの12 mm x 75 mmポリスチレン試験管をラベル:#1:アンステイン、#2:アルデフルオール、#3:アルデフルオール+DEAB、および#4:7AAD。</li>
	<li>これらのコントロールチューブの場合は、1mlの細胞懸濁液を#1に入れ、#4し、チューブ#2に2mlを入れる。5 μl DEAB (ALDH阻害剤) をチューブ#3に加え、氷の上に保管します。その後、チューブ#2に10μl活性化ALDEFLUOR基質を加え、混合し、すぐに1mlの混合物をチューブ#3に移します。</li>
	<li>同時に、ALDEFLUORアッセイバッファー内の1 x 106細胞/mlの細胞(サンプルチューブ)の残りの部分にも、100万個当たりの活性化ALDEFLUOR基質を2μl添加します。</li>
	<li>4つのコントロールチューブとサンプルチューブの両方を37°Cの水浴で30分間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーションに続いて、5 μl 7AADをコントロールチューブ#4に加え、サンプルチューブに1 μl 7AAD 1 x 106 細胞を加えます。4°Cで10分インキュベート。</li>
	<li>250 x g で 5 分間すべてのチューブを遠心分離し、上清を除去します。</li>
	<li>ALDEFLUORアッセイバッファー内の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>フローサイトメトリーベースのソートを実行します。</li>
	<li>DEABを負の対照として処理したALDEFLUOR染色細胞と、生存率制御のためのヨウ化プロピジウム(PI)7AAD-染色細胞を用いて選別ゲートを設定する。これらのコントロールに基づいて、ALDEFLUOR+/ALDH高、D5およびSCC7細胞を区別するゲートが確立された。これらのゲートは、ALDEFLUOR+/ALDH高D5 およびSCC7細胞のために上記で調製されたすべてのサンプル細胞をソートするために使用されます。</li>
</ol>2. がん幹細胞リセートパルス樹状細胞(CSC-TPDC)ワクチンの調製
<ol><li>CO2を用いてマウス(それぞれ同種B6およびC3H)を安楽死させ、大腿骨および脛骨を単離する。</li>
	<li>室温で1分間、骨を75%エタノールに入れます。その後、HBSSを使用して骨を洗います。</li>
	<li>骨を切り落とし、21G針と10mlの注射器を使って細胞を皿に押し込みます。</li>
	<li>吸引し、単一細胞懸濁液を作るために注射器を使用して細胞を吹き飛ばす。</li>
	<li>1,500rpmで5分間遠心分離した後、上清を捨てます。その後、RBCのリシスバッファーに5mlのRBCを加え、37°Cの水浴中に1分間RBCをライシスします。</li>
	<li>細胞数をカウントし、10 ng/ml GM-CSFおよび10 ng/ml IL-4を含む完全培地(CM)中の100万細胞/mlの濃度に細胞懸濁液を調整する。</li>
	<li>細胞を培養し、3日後にCMプラスIL-4およびGM-CSFを補償する。</li>
	<li>5日目 に、未熟樹状細胞(DC)を収穫し、4.2 ml溶液Cプラス1 ml OptiPrep濃度勾配培地を含むDC分離培地を調製する。</li>
	<li>5 ml CM で細胞ペレットを懸濁し、細胞懸濁液を分離培地にゆっくり加えます。室温で2,000rpmで遠心分離機。</li>
	<li>CM と分離メディアの間の DC を収集します。細胞数をカウントし、10 ng/ml GM-CSFおよび10ng/ml IL-4を含む培地中の100万個の細胞/mlの濃度に細胞懸濁液を調整する。</li>
	<li>ALDH高 または未ソートのD5またはSCC7細胞を培地中に懸濁させて腫瘍ライセートを調製し、その後5分間°100 x gでスピンを行い、ライセートの膜部分を回収します。</li>
	<li>CSC-TPDCを調製するために、自己ALDH高細胞のライセートを用いてDCをパルスする。H-TPDCを調製するために、不均一な異種腫瘍細胞リセートを有するパルスDC。DCと腫瘍細胞のライセートの比率は同じである。</li>
</ol>3. 有効性のワクチン接種と評価
<ol><li>正常B6マウスを2,500D5 CSC-TPDCまたはD5 H-TPDC腫瘍細胞を皮下(s.c)でそれぞれワクチンを接種する。正常なC3H動物 をワクチン 接種.c 5,000 SCC7 CSC-TPDCまたはSCC7 H-TPDC腫瘍細胞をそれぞれ有する。</li>
	<li>ワクチン接種後、20日後にCO2を用いてマウスを安楽死させる異種D5腫瘍細胞を有するB6マウスに挑戦する。肺を収穫し、肺の転移を列挙する。</li>
	<li>SCC7モデルでは、DCワクチンの反対側に未分類のSCC7腫瘍細胞 s.c を有するC3Hマウスに挑戦する。腫瘍のサイズを監視します。</li>
	<li>実験の最後にCO2を用いてB6マウスとC3Hマウスを安楽死させる。最初のワクチンの後34日目に、CO2でマウスを安楽死させ、同時に無菌処置で各群の脾臓を採取する。</li>
	<li>hrIL-2 または LPS プラス抗 CD40 (FGK45) mAb 腹水を含む CM で固定化抗 CD3 プラス抗 CD28 mAbs を使用して脾臓 T および/または B 細胞を活性化します。</li>
	<li>活性化後、上清を収集し、ELISAアッセイに使用してください。</li>
	<li>ELISAアッセイの場合、IFNγ、GM-CSFおよびIgGの抗体を4°C O/Nでコートします。</li>
	<li>ブロッキングバッファーの適用後、サンプルと標準を追加し、室温でインキュベートします。</li>
	<li>プレートを洗浄し、インキュベーション用のHRP検出抗体とTMB基質を添加します。</li>
	<li>反応を停止した後、30分以内に450 nmのELISAプレートリーダーの吸光度を測定します。</li>
</ol>

<ol><li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1%2Fp53-mediated+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li>
<li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li>
<li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li>
<li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice%3A+an+opposite+effect+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li>
<li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li>
<li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li>
<li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine%3A+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li>
<li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li>
<li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li>
<li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li>
</ol>

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SCIDマウスなどの免疫不全宿主は、宿主内の適応免疫の欠如によるCSCの免疫学的評価を妨げる。本研究では、免疫能力を有する宿主におけるCSCの免疫原性を評価し、患者の設定をより厳密に模倣する可能性がある。濃縮CSCsは免疫原性であり、選択されていない腫瘍細胞のライセートパルスDCと比較して、そのライセートがワクチンとしてDCにロードされると、より効果的な腫瘍保護免疫を誘導する可能性があります。 機械学的に、CSC反応性抗体およびT細胞8 の選択的誘導ならびに1型サイトカインの産生、 例えば IFNγおよびGM-CSFの産生によって保護が与えられた。
樹状細胞ベースワクチンや養子T細胞移動を含む現在の免疫療法のほとんどは、腫瘍分化抗原を標的にするように設計されています。CSCは、これらの分化された抗原を発現しない可能性があるため、これらの免疫学的標的を免れてもよい。対照的に、がん幹細胞を特異的に標的化するように設計されたCSCワクチンは、この特殊な癌細胞集団を破壊し、腫瘍の再発および転移を予防することによってワクチンの治療効果を向上させる可能性がある。
培養した腫瘍細胞と採取したばかりの腫瘍の両方で、高アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に基づいて、フローサイトメトリーによりCSC濃縮集団を同定した。このようなALDH高細胞は、CSC-TPDCsを生成するためにDCをパルスする抗原源として使用されるフロー選別によって単離することができた。 これらの結果は、培養腫瘍細胞から、または臨床応用のために採取したばかりの腫瘍から分離されたCSCを使用する可能性を明らかにした。
臨床的に関連するためには、ワクチンを治療環境で調べる必要があります。これらの実験は現在、当研究室で行われています。

癌幹細胞は、従来の化学療法および放射線療法1,2に対して比較的耐性である。一方、この細胞集団は、従来の癌治療1-4後の癌の再発および進行を担う細胞である可能性がある。がん幹細胞上の分化腫瘍抗原の発現が不足しているため、がん幹細胞は、主に分化した腫瘍細胞上の抗原を標的にするように設計された癌に対する治療の現在の免疫学的介入を免れる可能性がある。したがって、がん幹細胞を特異的に標的化および破壊する新戦略の開発は、現在の癌治療の治療効果を高めるという約束を保持し得る。このため、2つの動物腫瘍(黒色腫D5および扁平上皮癌SCC7)から癌幹細胞(CSC)を豊富に含む集団を単離し、抗原提示細胞(樹状細胞、DC)をパルスする抗原源として使用し、CSC-TPDCワクチンを調製した。次に、同種免疫担当宿主、B6マウスおよびC3HマウスにおけるCSC-TPDCワクチンによって誘導された抗腫瘍免疫をそれぞれ評価した。CSC-TPDC誘導抗腫瘍効果は、我々のグループ5,6によって以前に使用された未並種の異種腫瘍細胞(H-TPDC)および他の研究者7 が前臨床試験および臨床試験の両方で使用したリセートでパルスされた従来のDCワクチンと比較した。

<table><tbody><tr><td>ALDHEFLOUR KIT</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>マウス IL-4</td><td>Pepro Tech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>マウス GM-CSF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>マウス GM-CSF ELISA KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>555167</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep 密度勾配 培地</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D1556</td><td></td></tr><tr><td>BD OptEIA TMB 基質試薬セット</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS アリア セルソーター</td><td>BD Biosciences</td><td>336834</td><td></td></tr><tr><td>Kcjunior</td><td>Bio-Tek Instruments</td><td>176058</td><td></td></tr></tbody></table>

黒色腫と扁平上癌幹細胞を用いた新規樹状細胞ワクチンの生成

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

我々は、マウスメラノーマD5シンジニアスからC57BL/6マウスまでの癌幹細胞(CSC)エンリッチ集団と、ALDEFLUOR/ALDHをマーカーとして使用するC3Hマウスに対する扁平上癌SCC7シンジニアスを同定し、細胞リセートをパルス樹状細胞(DC)に対する抗原の供給源として免疫原性を試験した。ALDH高CSC ライセートでパルスされたDCは、モデルと肺転移の設定およびs.cの両方で、並べ替えられていない腫瘍細胞ライセートのライセートでパルスされたDCよりも有意に高い保護抗腫瘍免疫を誘導 した。腫瘍の成長設定, それぞれ.この現象は、CSCワクチン誘発性体液性ならびに細胞抗CSC応答によるものであった。特に、CSC-DCワクチンを受けた宿主から単離された脾細胞は、パルスドDCワクチンを受けた宿主から単離された脾細胞よりも有意に高い量のIFNγおよびGM-CSFを産生した。これらの結果は、アジュバントの設定で臨床使用のための自家CSCベースの治療ワクチンを開発するための努力を支持する。

ALDEFLUOR/ALDHは、多発性悪性腫瘍8-11で幹細胞を単一マーカーとして使用されている。我々は、ALDEFLUORをマーカーとして用い、2つの腫瘍モデルD5およびSCC7における癌幹細胞濃縮集団を同定した。マウス黒色腫B16-D5および扁平上皮癌SCC7のALDEFLUOR+細胞を検出した。ALDEFLUOR+細胞が、それぞれ培養されたD5およびSCC7の腫瘍細胞株に約0.5%および5.2%の寄与を示した(図1)。確立された腫瘍から採取したばかりの腫瘍細胞を分析し、ALDEFLUOR+細胞の存在を確認した。 図1にも示すように、 インビボ 樹立D5およびSCC7腫瘍からALDEFLUOR+細胞の2.5%および4.2%がそれぞれ存在した。これらの分類D5およびSCC7 ALDEFLUOR+/ALDHの高い 集団の腫瘍原性および自己再生能力を、同系免疫担当宿主、C57BL/6およびC3Hマウスでそれぞれ8個評価した。
我々は、動物実験と臨床試験5,6の両方で、異種の未分類の腫瘍細胞ライセートをパルスDC(H-TPDC)に使用した。CSCの免疫原性を調べるために、ALDH高 CSCを単離し、CSCのリセートでDCをパルスしてCSC-TPDCを生成し(図2)、従来のがんワクチンコントロールとしてH-TPDCを使用して、CSC-TPDCが腫瘍増殖を予防するのに有益な効果があるかどうかを検査しました。
CSC-TPDCによる保護抗腫瘍免疫を調べることにより、CSCの免疫原性を評価した。D5モデルでは、ナイーブ免疫担当マウスをs.c CSC-TPDCまたはH-TPDC(同じlysate:DC比)でワクチン接種した。 制御グループは生理的な(PBS)を受け取った。最後のワクチンの1週間後、マウスは未分類のD5腫瘍細胞を静脈内(すなわち)で挑戦し、肺を3週間後に採取して肺転移を列挙した。表1に示すように、PBS群と比較して、H-TPDCで治療されたマウスは肺転移が少ない。重要なことに、CSC-TPDCで治療されたマウスは、両方の実験でH-TPDCワクチン群よりも肺転移が有意に少なかった。SCC7モデルでは、正常なC3H動物をs.cにSCC7 CSC-TPDCまたはH-TPDCをそれぞれ右脇腹にワクチン接種し、続いて未ソートのSCC7腫瘍細胞を左脇腹に.cに挑戦した。PBS群と比較して、H-TPDCは腫瘍増殖に対して控えめな抗腫瘍免疫を誘導した。しかし、コントロール群とH-TPDC群の両方と比較した場合にCSC-TPDCで治療したマウスでは腫瘍増殖の有意な抑制があった(p<0.05,図3)。これらの結果は、CSCが腫瘍細胞の挑戦に対する保護免疫を誘導する従来の未分類の腫瘍細胞よりもDCをロードするより効果的な抗原源として使用できることを示している。
観察されたCSC誘導保護抗腫瘍免疫の根底にあるメカニズムをさらに理解するために、実験の最後にDCワクチン接種を受けた動物から脾臓を採取した。脾臓細胞は、抗CD3/CD28/IL-2または抗CD3/CD28/IL-2+ LPS/抗CD40によって活性化された。次いで、培養上清を収集し、サイトカインおよび抗体の発現を検出した。 D5 CSC-TPDCまたはSCC7 CSC-TPDCでワクチン接種された動物から脾臓細胞によるIFNγおよびGM-CSFの産生が有意に高かった(図4)。さらに、D5 H-TPDCまたはSCC7 H-TPDCと比較して、D5 CSC-TPDCまたはSCC7 CSC-TPDCでワクチン接種された動物から採取されたLPS/抗CD40活性化脾臓細胞によるIgG産生が有意に(p<0.05)高かった。これらの抗体は、それぞれD5およびSCC7 CSCに結合することが判明し、そのような結合は、補体8の存在下でCSCリシスをもたらす可能性がある。
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> 図 1. ALDHFluOR+/ALDH高集団 は、培養された新鮮なマウスD5黒色腫およびSCC7扁平上皮細胞腫瘍と同様に、高い集団を検出した。 腫瘍細胞は、特定のALDH阻害剤である50 mmol/L DEABで治療し、陰性対照として使用した。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> 図 2. 樹状細胞系癌幹細胞ワクチンの生成 CSC-TPDCおよびH-TPDCの調製のために、骨髄由来樹状細胞をそれぞれALDH高 または未分類の腫瘍細胞ライセートでパルスした。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> 図 3. CSCリセートパルスDC(CSC-TPDC)ワクチンは 、s.c においてより効果的な保護抗腫瘍免疫を誘導する可能性がある。SCC7腫瘍モデル。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> 図 4. CSC-TPDCでワクチン接種された免疫能力宿主におけるより強力な全身細胞応答. 脾細胞は、H-TPDCまたはCSC-TPDCワクチン接種を受けた動物から採取し、示されるように活性化した。次いで、ELISAを用いてサイトカイン検出のために培養上清を回収した。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a>

同系免疫担当宿主において評価された癌幹細胞(CSC)ベース樹状細胞(DC)ワクチンは、異種バルク腫瘍細胞でパルスされた従来のDCワクチンよりも有意に高い抗腫瘍免疫を示した。

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

本手順の全体的な目的は、免疫能を有するホストにおいて、がん幹細胞（CSC）またはCSCベースの樹状細胞（DC）ワクチンの抗腫瘍免疫を評価することです。まず、不均一な腫瘍細胞から、アルデヒド脱水素酵素陽性またはALDH highのCSCを単離します。次に、CSC由来のDCを単離し、ワクチン用のライセートでパルス処理します。次に、CSCライセートパルスDCまたはTP DCワクチンを、正常な同系免疫能を有するホストに投与します。そして最終ステップとして、C-S-C-T-P-D-Cワクチンの抗腫瘍保護効果を評価します。最終的に、ELI SAを実施することで、ホストのT細胞および抗体によるC-S-C-T-P-D-Cワクチン誘発性の抗CSC免疫を評価できます。本プロジェクトでは、がん研究における最もエキサイティングな2つの領域である、がん幹細胞と腫瘍免疫療法の分野を融合させています。当研究室は、固形癌におけるがん幹細胞を世界で最初に見出した研究グループの一つです。これらのがん幹細胞は、がんの増殖および転移を推進する「種」となるものです。本日は、これらのがん幹細胞を特異的に標的とする、免疫療法を用いた新しいアプローチをご紹介します。私たちは、Alde fluoro assayで検出可能なアルデヒド脱水素酵素と呼ばれる特定のマーカーを利用します。Lin Liu博士とHuon Tau博士が、Chow Lee博士と共に作業を行う様子をご覧いただきます。これらのがん幹細胞を標的とすることで、多くの種類のがん患者の治療成績が向上することを期待しています。まず、目的の腫瘍細胞をアッセイバッファーに懸濁し、濃度を1×10⁶ cells/mLに調整します。次に、腫瘍細胞のうち3 mLを除いた全量を各サンプルチューブに分注し、4本の12×75 mmポリスチレン製コントロール試験管に、unstained、ALOR、ALOR plus DEAB、7-AADとそれぞれラベルを貼ります。unstainedおよび7-AADのチューブに細胞懸濁液を1 mLずつ、ALORのチューブに2 mL分注します。次に、ALOR plus DEABチューブに5 µLのDEABを加えます。チューブを氷上に置き、ALORチューブに10 µLの活性化alor基質を加えて混合します。直ちに基質溶液1 mLをALOR plus DEABチューブに移し、その後、各サンプルチューブに細胞100万個あたり2 µLの活性化alor基質を加えます。すべてのチューブを37 °Cの水槽で30分間インキュベートし、次に7-AADチューブに7-AADを5 µL、各サンプルチューブには細胞1 million個あたり1 µLの7-AADを添加します。これらのチューブを4 °Cで10分間保持します。すべてのチューブを室温で250 ×gで5分間遠心分離し、ペレットをAldeFluorアッセイバッファーに再懸濁して、フローサイトメトリー（FACS）に供します。ソーティングゲートを設定するには、Aldefluor plus DEAB処理細胞を陰性コントロールとして、7-AAD染色細胞を生存率コントロールとして使用します。これらのコントロールに基づき、Aldefluor陽性、7-AAD低、D5およびSCC7細胞を識別するためのゲートを設定します。その後、これを用いてサンプル細胞をAldefluor陽性、7-AAD低、D5およびSCC7の各集団にソートします。樹状細胞を生成するために、まずC 57BL/6マウスおよびC3Hマウスから大腿骨と脛骨を単離します。骨を75% ethanolで室温にて1分間滅菌し、その後HBSSで洗浄します。次に、骨の両端を切り落とし、21G針を装着した10 mLシリンジを用いて骨髄をペトリ皿に洗い出します。細胞を数回吸引および分注して単細胞懸濁液を作成し、その後、細胞を遠心分離して回収します。ペレットを5 mLの赤血球溶血バッファーに懸濁し、37 °Cのウォーターバスで1分間インキュベートします。細胞数をカウントした後、GM-CSFおよびIL-4を添加した培地を用いて、細胞密度を1 × 10⁶ cells/mLに調整します。その後、細胞を37 °C、5% CO₂条件下で培養し、3日ごとに培地とサイトカインを更新します。5日目に、未熟樹状細胞を回収します。細胞を遠心分離した後、ペレットを5 mLの培地で再懸濁し、その後、調製したばかりの分離培地の上に細胞懸濁液をゆっくりと重層します。再び細胞を遠心分離し、培地層と分離培地層の間にあるDCを回収します。その後、細胞数をカウントし、GM-CSFおよびIL-4を添加した培地を用いて、細胞濃度を1×10⁶ cells/mLに調整します。次に、ソートした細胞を迅速な凍結融解に4回さらし、続いて遠心分離を行うことで、ライセートの膜画分を回収し、腫瘍ライセートを作成します。その後、ソートした自己ALDH high細胞由来のライセートでDCをパルスし、CSC TPCを調製します。H-T-P-D-Cパルスを調製し、未分別の不均一な腫瘍細胞溶解物を用いてDCsを刺激し、実験動物にワクチン接種を行う。パルス細胞 1×10⁶個を100 µLのPBSに懸濁し、各マウスの左側腹部に皮下注射する。ワクチン接種後、C57BL/6受容マウスに不均一なD5腫瘍細胞 1×10⁵個を100 µLのPBSで静脈内投与し、チャレンジを行う。SCC7モデルでは、DCワクチンの反対側に、未分別のSCC7腫瘍細胞 1×10⁶個を100 µLのPBSでC3H受容マウスに皮下注射してチャレンジを行う。レシピエントのC3 Hマウスの脾臓から単一細胞懸濁液を作成します。次に、適切な刺激剤を添加した培地中で、固定化抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体を用いて脾臓のT細胞およびB細胞を活性化させます。4日後、上清を回収し、インターフェロンγ、GM-CSF、またはIgGに対する抗体をELISAプレートにコーティングし、4°Cで一晩置きます。翌日、非特異的結合をブロックし、標準品および先ほど回収した上清を分注して室温でインキュベートします。洗浄後、HRP検出抗体を添加して1時間置き、その後TMB基質を添加します。最後に、反応停止後30分以内にELISAプレートリーダーを用いて450 nanometersで吸光度を測定します。Alorは、D5およびSCC7の2つの癌幹細胞濃縮集団を含む複数の悪性腫瘍において、幹細胞を単離するためのマーカーとして使用されてきました。これらのドットプロットに示されているように、培養されたD5およびSCC7腫瘍細胞株において、Alor陽性細胞はそれぞれ約0.5%および5.2%寄与しています。また、in vivoで確立されたD5およびSCC7腫瘍から採取した新鮮な腫瘍細胞においても、Alor陽性細胞がそれぞれ2.5%および4.2%含まれていることが判明しています。D-E-A-B-A特異的A LDH阻害剤で処理した腫瘍細胞を陰性対照として使用しました。がん幹細胞の免疫原性は、前述のワクチン接種モデルを用いて、CSC TPCによって誘導される保護的な抗腫瘍免疫を調べることで評価しました。本表に示すように、H TPCで処理したマウスは、PBSのみで処理したマウスよりも肺転移の数が少なくなりました。重要なことに、CSCT PCで処理したマウスは、H-T-P-D-CまたはPBSのみで処理した動物よりも肺転移がさらに少なかった。SCC sevenモデルにおいて、対照群と比較して、正常なC3 H動物に上述の通りワクチン接種を行った。HTPCは緩やかな抗腫瘍免疫を誘導したが、CSCT PCは著しい腫瘍増殖抑制を誘導した。これらの結果は、腫瘍細胞の攻撃に対する防御免疫を誘導するために、従来の分画されていない腫瘍細胞よりも、CSCがDCへのローディングに有効な抗原源として利用できる可能性を示唆している。観察されたCSC誘導性の抗腫瘍保護免疫の根底にあるメカニズムをさらに理解するため、DCワクチン接種動物から採取した細胞を活性化し、そのサイトカイン産生量を先ほど実演した方法でELISAにより測定しました。その結果、D5 CSC TPCsまたはSCC7 CSC PCsを接種した動物から採取した細胞では、D5 HTPCsまたはSCC7 HTCsを接種した動物から採取した細胞よりも、サイトカイン産生量が有意に高いことが示されました。本日は、がん幹細胞を単離するためのAlamar assayの使用方法について解説しました。これらのがん幹細胞は、樹状細胞を利用した免疫療法の開発に使用できます。これらの免疫療法を単独で、あるいは既存の治療法と組み合わせて使用することで、多くの種類のがん患者さんの見通しが改善されることが期待されます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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Transimmunization (TI) デバイスまたはプレートと関連するプロトコルは、実験的な設定で、体外光化学療法 (ECP) の主要な機能を再現するために開発されており、生理活性、チューナブル樹状の生産を可能にします癌免疫療法のための細胞...

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黒色腫と扁平上癌幹細胞を用いた新規樹状細胞ワクチンの生成

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