新規タスクを使用した片側子宮頸SCI後前肢の機能を評価する：四肢ステップ交替、姿勢の不安定やパスタの取り扱い

本手順の全体的な目的は、頚髄損傷後の機能的欠損および回復を評価することです。まず、動物がハンドリングや試験環境に慣れるようにトレーニングを行います。次に、ラットの肢の交互歩行能力を評価します。

次に、重心の変化に対する反応能力と、それに応じた適切な姿勢調整能力を動物で評価します。最後に、パスタを食べるという動作を必要とする巧緻運動操作タスクを用いて、4肢および四肢の機能分析を行います。最終的に、頸髄損傷後の欠損状態の違いを示す結果を得ることができ、これにより、解剖学的な違いと相関する機能的欠損に基づいて動物をグループ分けすることが可能になります。

フットプリントゲート解析などの既存の手法と比較して、ここで述べる手法の主な利点は、使用方法が非常に簡単であり、高価な装置やソフトウェアを必要としない点にあります。これらの手法は、脊髄損傷後の機能的回復に関する知見を提供しますが、パーキンソン病、脳卒中、またはその他の運動機能不全を引き起こす神経疾患などの他の疾患モデルにも適用可能です。本研究に使用する動物は、手術の2〜3週間前にC3-C4側方脊髄損傷を処置したものとします。動物をハンドリングに慣れさせ、四肢の滑り、踏ん張り、または引きずりを防ぐためにサンドペーパーが敷かれた試験環境に適応させてください。

4肢歩行交互テストは、動物が前肢をすべて使用できているかを確認するためのものであり、このテストは開始前に毎日実施することが可能です。まず、動物の抵抗がなくなり、筋肉が弛緩していることを確認します。次に、テーブルの上で動物の前肢のみに荷重させた状態、または身体をテーブルに対してほぼ90度に保った車輪付き手押し車のような姿勢（ホイールバロウ・ポジション）で保持します。動物が手に委ねてリラックスした様子を見せたら、動物を前方へ押し、テーブルの表面に沿って移動させます。

ラットが表面を移動する際に、前肢を交互に使用しているかを確認し、記録します。動物を片手で保持した状態でこのテストを少なくとも2回繰り返し、その後、もう一方の手で保持した状態でさらに2回繰り返します。

ラットが正常にステップ交互動作を示した場合は、最初のステップの後に5秒間の待機時間を設けて再度テストを行い、遅延後も交互動作のパターンが維持されるかを確認します。結果をメモし、スコアシートに記録してください。姿勢不安定性テストでは、動物がバランスを取り戻すために前肢でステップを踏むまでにかかる距離を測定します。

交互歩行テストと同様に、動物の筋肉の緊張が解けるまで待機します。サンドペーパーを敷いたテーブルの上で、動物の体がテーブルに対してほぼ90度の角度になるように車輪走行（wheelbarrow）の姿勢をとらせ、片方の前肢を動物の胴体に軽く固定し、上から見たときに鼻先がゼロラインに合うように調整します。次に、ラットを前方へ動かします。これにより動物の重心が移動し、バランスを取り戻そうとして歩行が刺激されます。

ラットが2回足を踏み出した後の鼻の新しい位置を特定し、これら2回の歩行の平均値を、ステップを誘発させるために必要な距離として使用します。結果をテキストプロトコルに記載されている姿勢不安定性試験スコアシートに記録してください。各肢について5回ずつテストを行います。

パスタ操作テストでは、標準的なパスタを食べるのにかかる時間と、各セッションにおける前肢の優先性を測定します。手術の1〜2週間前から、ベースライン測定の準備として、ホームケージ内でラットに4.0 centimeterの細いスパゲッティを毎日5〜6本与えます。次に、ラットをテストチャンバーに入れ、4本の肢の使用を容易に観察できるよう、チャンバーの前方にパスタを配置します。その後、パスタを1本ずつ食べるのにかかる時間を記録します。

1セッションにつき、動物に少なくとも3個の餌を食べさせてください。動物が食事中に停止した場合は、タイマーを一時停止させます。また、動物が食事を再開したときにタイマーを再始動させてください。

トレーニング期間中に、ラットが少なくとも3日間、安定したパスタ摂食時間を示した時点で、ベースライン記録によるデータ収集が可能です。テキストプロトコルに付属のパスタハンドリングスコアシートを用い、チャンバー前方の床にパスタを置いてください。ラットがパスタ1片を食べるのにかかった時間、どの前肢が使用されたか、およびここに示す前肢ステップ交互動作テストにおける前肢の位置を記録します。外科的な脊髄損傷後、前肢の交互使用が可能であった動物は50%であり、交互使用に成功した個体のうち、5秒間の遅延後にも肢の交互使用が可能であったのは50%でした。

これらの所見を解剖学的研究と相関させたところ、交互に歩行する個体（alternators）では、病変対側において温存された皮質脊髄路および後索の面積が有意に広いことが明らかになり、前肢の歩行交互試験が病変の重症度だけでなく、病変の片側性をも予測できることが示されました。この試験を用いることで、病変の重症度に基づいたグループ分けが可能になります。例えば、4肢運動機能尺度（four limb locomotor scale）の測定値を病変の重症度に基づいて分類することで、より明確な結果を得ることができます。

ここでは、姿勢不安定性テストから収集されたデータにより、脊髄損傷後の同側肢、病変側肢、および対側肢における変化が示されています。脊髄の一側性病変は、機能障害のある肢や影響を受けた肢だけでなく、機能障害のない肢にも変化を引き起こす可能性があります。頸髄損傷後に姿勢不安定性テストを用いたところ、病変の状態による有意な影響があることが実証されました。

さらに、負傷した動物のIPS病変側における肢の変位は、偽手術を受けた動物と比較して有意に長くなっていました。この図に示されているように、負傷後の慢性期において、対側病変側の肢の変位距離は偽手術群よりも大幅に短かった一方で、偽手術群と病変群のいずれの動物も、パスタを食べるのに要した時間は同様でした。しかし、偽手術群と交互動作が可能な病変群の動物はいずれも試験期間中に両前肢を使用してパスタを食べたのに対し、重度の負傷により交互動作ができなくなった動物で、同側病変側の前肢を使用してパスタを食べることができた割合はより低い結果となりました。

正しく実施すれば、これらのテストはラット1匹あたり5分未満で完了できます。ここで述べる行動テストは、足の踏み外し（foot fault）シリンダー前肢好みのテストなどの既存の他の行動テストや、肢機能評価スケール（limb locomotive scale）テストと組み合わせて使用することができ、頚髄損傷後の動物の患側（ipsilateral）および健側（contralateral）の肢機能を完全に評価することが可能です。