マウスにおけるアテローム性動脈硬化症に対する筋内膜過形成を誘発する。つの有効なモデルの導入

本実験の全体的な目的は、異なるメカニズムで大動脈狭窄を誘発する2つの有効な動物モデルを紹介することです。1つ目のモデルは、大動脈にバルーンカテーテルを挿入し、内膜中膜増殖を誘導する方法です。まず、腎下腹部大動脈を露出させ、クランプします。

次に、大動脈を横切るように切開して開き、バルーンカテーテルを挿入します。その後、カテーテルを膨らませて大動脈の内皮を剥離させ、手術を完了します。2つ目のモデルは、動脈硬化プラークを作成するために、APOE欠損トランスジェニックマウスに食事操作を行うものです。

これらのマウスは標準的な条件下で飼育され、4〜6ヶ月間、高脂質のウェスタンダイエットを投与されます。最終的に、外科的に誘発された筋内膜増殖と食事制限モデルの組織学的解析により、それぞれ異なる管腔狭窄が生じることが示されます。本日は、バルーンカテーテルを用いて血管損傷を誘発するマウスモデルと、動脈硬化モデルという、管腔狭窄を誘発するための2つの異なるモデルをご紹介します。

欧米型食（Western diet）を投与したトランスジェニックマウスを用いたバルーンカテーテルモデルは、狭窄分野における重要な課題の解決に寄われてくれます。動脈硬化の病態生理を研究するためには、トランスジェニックホモ接合体upper E変異マウスモデルが用いられます。また、内膜増殖モデルには、体重約25 gのC57BL/6Jマウスを使用してください。

通常の飼料を用いて、通常条件下で維持します。2% isof fluorine でマウスを麻酔した後、腹部の被毛を刈り取り、鎮痛のためにカルプロフェンを皮下投与します。次に、ポビドンヨードと 80% ethanol で皮膚を2回交互に消毒します。

次に、足指を挟んで反射が消失しているか確認します。白線に沿って皮膚と筋肉を分離し、手術を開始します。続いて、腸管を生理食塩水で湿らせた手袋で包み、慎重に脂肪組織を取り除いて、腹部大動脈を露出させます。

次に、腎下大動脈を分岐部まで露出させます。その際、分枝血管を損傷しないよう注意してください。その後、大動脈をクランプします。

まず、血流を遮断するために、腎下大動脈の近位側にマイクロサージカルクランプを装着します。次に、大動脈分岐部の隣に2つ目の遠位クランプを装着します。血流が遮断されたら、近位クランプに近い大動脈に小さな切開を加えます。

カテーテルを大動脈の遠位クランプ側に向かって挿入し、内皮損傷を作ります。カテーテルのバルーンを膨らませ、注意深くゆっくりと近位クランプ側へカテーテルを引き抜きながら、大動脈の内皮を剥離させます。この操作を2回繰り返し、計3回の大動脈内でのバルーン膨張を行います。

次にカテーテルを取り除き、10 au prolineの連続縫合を用いて大動脈の切開部を閉じてください。縫合後、AOR自切部位に出血がある場合は、慎重に遠位側のクランプを開きます。その後、再びクランプを閉じ、出血部位を特定して、断続縫合を追加して止血します。

出血がないことを確認し、近位クランプをゆっくりと開きます。切開部の遠位側で大動脈の拍動が確認できるはずです。次に、腸管をC2に配置します。

次に、6本のOTTプロリン連続縫合を用いて、筋層から腹壁を閉鎖します。続いて、5本のOTT縫合で皮膚を閉鎖し、マウスをケージに戻します。術後の3日間は、疼痛管理のため、飲料水にメタゾールを添加して投与します。

回復まで約28日間、動物を観察します。動脈硬化モデルについては、4週齢のA POE欠損マウスを用意してください。これらのマウスを、高脂質ウェスタンダイエットを投与し、標準条件下で4～6か月間飼育します。

実験期間中、この食事を維持します。大動脈を採取する6時間前に、餌へのアクセスを遮断します。その後、前節に記載の方法に従って、マウスを手術の準備に回します。

胸腔を開いて手術を開始します。次に、心尖部を切り離し、大動脈根部から4%パラホルムアルデヒド3 mLを緩やかな圧力で灌流して、大動脈を固定します。その後、大動脈根部から分岐部までを遊離させます。

脂肪組織を可能な限り除去します。次に、大動脈弓を切り取り、4%パラホルムアルデヒドに保存します。その後、心臓と大動脈樹をPBSを入れたシリコンラインディッシュに移します。

大動脈樹の一端を切断し、細いピンでシリコン層上に固定します。大動脈を縦方向に切り開き、大動脈組織を室温のPBSに数分間浸します。その後、組織を50%エタノールで1回すすぎ、Sudan溶液のバスに浸します。

3. 染色液で約15分間染色します。染色後、余分なSudanのみを取り除くため、組織を50% ethanolで数秒間素早く洗浄します。洗浄しすぎると染料が過剰に除去されるため、直ちに組織を蒸留水で洗浄し、イメージングに進みます。筋内膜増殖モデルでは、内皮剥離させたマウスの大動脈を採取し、パラフィン包埋後、chromeで染色しました。chrome染色切片において内膜と中膜の厚さを測定し、比率を算出しました。

コンピュータ解析後に比率を算出する方法を用い、最大プラーク厚はコンピュータモルフォツリーにより、ルーメンにおける最大内膜厚として測定した。ルーメン閉塞率は、元のルーメンに対する新しい内腔の比率として算出した。プラーク面積は、元のルーメンから新しい内腔を差し引くことで算出した。

同様の解析を、動脈硬化モデルの大動脈弁、大動脈弓、および下行大動脈のトリクローム染色横断面に対して、動脈硬化モデルのみで実施した。下行大動脈を縦に切開し、スーダンレッドで染色した。両モデルの解析のため、コンピューターを用いてプラーク面積および大動脈全面積を測定した。

管腔の閉塞、形態、および細胞性などの疑問を解消するために、組織病理学的検査や共焦点免疫蛍光顕微鏡観察などの他の手法を行うことができます。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。