ゼブラフィッシュ成体終脳の刺し傷傷害：脊椎動物の脳神経発生·再生を調査する方法

次の実験の全体的な目標は、成体の神経新生と中枢神経系の再生と修復に関与する細胞応答と分子メカニズムを調査することです。ゼブラフィッシュでは、これはまず、成魚のゼブラフィッシュの右頭半球に穿刺して手動で損傷を発生させることによって達成されます。次に、損傷後5日で、魚は犠牲にされ、その脳は解剖され、オメで切片化するためにアロスに埋め込まれます。

次に、脳切片を免疫組織化学によって染色するか、または適切なマーカーを用いたCの2つのハイブリダイゼーションによって染色します。細胞増殖を観察するために、増殖マーカー、PCNA、ラジオグリアマーカーS 100ベータおよびオリの2つのEGFP標識オリゴデンドロサイト前駆細胞のアップレギュレーションを示すグリオ、無形成、およびニューロン新生の結果が得られます刺し傷時に心室ゾーンで標識されました。この技術が既存の方法に対抗する主な利点は、組織または細胞型特異的なアブレーションを生成するためのトランスジェニックアプローチに触れる、その単純さ、速度、および原因効率であり、これにより、短時間で多くの損傷した脳を生成できる。

成魚のゼブラフィッシュに麻酔をかけた後、テキストプロトコルに従って、トリカに浸したティッシュペーパーのブロックに個々の魚をスリットに入れ、上からの光で解剖顕微鏡で観察します。片手で魚をそっと持ち、30ゲージの針が付いた注射器で上から頭にアクセスできるように魚を向けます。一方、針を頭蓋骨を垂直に押し込み、1つの頭蓋半球の内側領域に2ミリメートル以下の深さ

頭部損傷を導入した後、魚を新鮮な魚の水に入れます。完了したら、魚を水流システムに戻します。魚を希望の期間回復させ、テキストプロトコルに従って安楽死させた後、氷の上で犠牲にし、鋭いハサミを使用して鰓の後ろを切り、頭を体から分離します。

1つのXPBSで頭部を5分間インキュベートし、出血を許容します。次に、ヘッドをPBS中の4%パラホルムアルデヒドに移し、摂氏4度で一晩または室温で4時間インキュベートします固定後。ペトリ皿に1つのXPBSを使用して、頭を2回洗います。

次に、解剖顕微鏡で、PBSで脳を慎重に解剖します。目に見える病変のない脳は捨ててください。1.5ミリリットルの100%メタノールで満たされた2ミリリットルの反応チューブに脳を移し、チューブを5回反転させてから、摂氏マイナス20度で少なくとも16時間インキュベートします。

免疫組織化学のために組織を再水和するには、PBS tween 20またはPTWを使用して脳を5回洗浄する前に、下降メタノールシリーズで脳をそれぞれ5分間インキュベートします。それぞれ5分間。次に、脳を埋め込むには、トランスファーピペットを使用して、脳をポリエチレン成形カップトレイの空洞に配置し、600ワットのマイクロ波で加熱することにより、1つのXPBSで2%のアグロスを溶解します。

アグロスを3分間冷ましてから使用してください。次に、片方の脳からPTWを慎重に取り外してから、arosを使用して型を完全に充填します。解剖針を使用して脳をアロスで渦巻き、PTWを洗い流し、腹側を下にして背側を上にして脳を向き、アグロスを冷ます前にまっすぐに配置します。

解剖針を使用して、アグロスブロックを型から取り出します。次に、鋭いかみそりの刃で、脳の後端で爪の頭蓋と平行にアグロスを切ります。次に、ブロックを反転させて後面に立つ前に、脳の前端でアグロスを切断します。

脳の背側と腹側に平行に切り込みを入れて、余分なアグロスを取り除きます。次に、脳を裏返して腹側に置きます。最後に、ブロックを切頭三角形にカットし、セファロンが小さい方の平面に配置されるようにします。

製造元の指示に従ってバイオムを準備した後、1つのXPBSを使用してバッファーバスを満たし、ブレードの底にちょうど到達するようにします。次に、バイブレーターの標本ディスクの上部に瞬間接着剤の小さな点を置きます。次に、脳の後方にあるブロックの平面を瞬間接着剤に慎重に配置します。

ミクロトームマニピュレーターを使用して、試料ディスクをバッファートレイに挿入し、試料ディスクを目的の位置まで回転させます。次に、3mmの六角レンチを使用してネジを締め、マニピュレーターを取り外します。ブロックをバッファーバスに配置して、セファロンが表面のすぐ下にあり、脳の背側がブレードを向いて脳を切片にします。

振動するミクロトームを備えたプレートのウェルに脳あたり1ミリリットルのブロッキングバッファーを追加することにより、切片を収集するための24ウェルプレートを準備します。厚さ50マイクロメートル、毎秒1ミリメートルの速度、70ヘルツの周波数で切片化を開始します。合成ブラシを使用して、ブレードから外れたアロスの薄いスライスを拾い上げ、24ウェルプレートに集めます。

免疫組織化学を行うには、室温で1時間非特異的部位をブロックします。インキュベーション後、バッファーを取り出し、ブロッキングバッファーで希釈した250μLの抗体を添加し、摂氏4度で一晩または室温で2時間インキュベートした後、PTWを使用してサンプルを1分間ずつ3回洗浄します。インキュベート後、二次抗体を室温で2時間

切片を3回洗います。切片の埋込には、水溶性の非蛍光封入剤を使用してください。次に、化合物顕微鏡または共焦点顕微鏡でサンプルを分析します。

適切に行われると、創傷は、物語の手蓋を通って背側から腹側に伸びる病変管につながり、35日後に治癒します。これは以前に免疫組織化学を用いて示されました。この創傷は、PCNAとS 100ベータのアップレギュレーションを引き起こし、病変後3〜7日で重複するパターンを示し、放射状グリア細胞の増殖を示します。

この図は、トランスジェニックオリグ2脳波FP魚に誘発された刺し傷のすぐ近くにオリゴデンドロサイト前駆細胞またはOPCが一過性に蓄積し、病変後35日目までに観察されなくなったことを示しています。病変が適切に導入されていないと、病変管が見えなくなります。PCNAとS 100ベータのアップレギュレーションまたはOPCの蓄積は検出できません。.

ここで提示したように、病変のある魚の脳と野生型の脳の脳における転写調節因子を比較する全身発現スクリーニングにより、テレセファロンで発現し、損傷に応答してアップレギュレーションされる多くの因子が特定されました。ステップ創傷法は、例えば、RNAディープシーケンシングおよび/またはin situハイブリダイゼーションと組み合わせ、ゼブラフィッシュの成体のニューロン新生、再生、および修復に関与する新しい遺伝子を同定するのに役立ちます。