Name: 塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 学ぶ強化された減少表現重亜硫酸塩シークエンシング法による塩基対解像度のDNAメチル化解析。制限酵素処理と重亜硫酸塩変換を組み合わせ、少量試料から高カバレッジのエピジェネティクスデータを取得する技術です。

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オリジナルのERRBSレポートの著者全員に感謝します。技術支援を提供してくださったMame Fallに感謝します。Weill Cornell Medical College Epigenomics Coreの技術サービスと支援に感謝します。この作業は、Sass Foundation Judah Folkman Fellowship、FGBへのNCI K08CA169055とASH-AMFDP12005、NIH R01HG006798 and R01NS076465、Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) から CEM への資金提供、AMM への LLS SCORE 助成金 (7006-13) によって支援されました。

実行されるすべての手順は、医療機関動物実験委員会のインディアナ大学大学院によって承認され、健康ガイドラインの国立研究所に従っている。 1.手術手技<ol><li> NIHガイドライン25に従って無菌滅菌手袋を使用して、この手順の間に技術、機器、および無菌手術野を維持します。 （完全なリストに特異的な試薬/機器の表を参照）、それらをオートクレーブで手術を開始する前に、ツールを滅菌する。動作中のツールを殺菌するためにガラスビーズ滅菌器を使用してください。 </li></ol> 2.麻酔と準備<ol><li>獣医イソフルラン気化器システムを用いて、0.9リットル/分の酸素と2.5％のイソフルランの混合物で麻酔ボックス内にマウスを麻酔。マウスを箱から取り出す前に、身体の位置の変化に応答しないことを確認してください。 </li><li> MOUに眼軟膏を適用します乾燥からそれらを保護するために、それ自体の目。 </li><li>ノーズコーンにあるボックスからのガスの流れを切り替えます。コー​​ンの内側の鼻と口を備えた外科用パッドと吸収ベンチ紙で覆われて加熱されたパッドの上に真正面からその左側にマウスを置きます。継続的にマウスの呼吸のリズムと速度を監視し、必要に応じてイソフルランレベルを調整 - 麻酔の適切なレベルを維持するために、（2.5の間で3％イソフルラン）、および総鎮静を確認するために、つま先ピンチ反射を使用しています。 </li></ol> 3.外科的アプローチ<ol><li>合わせて、手術野でステレオスコープを集中。それは視野の端に沿って配置されるように、ノーズコーンとテープを上下に調整する。 </li><li>マウスは、その左側に横たわっていると、切開が行われる耳の後ろの領域を露出させ、ノーズコーンに右耳の端をテープで固定します。後耳介静脈が耳全体に水平に移動することを確認してください。 Tの正しい配置に注意してください彼は耳の動物とテーピングはすぐに顔面神経を見つけるために重要である。 </li><li>にし、70％エタノールで耳の後ろに毛皮を湿らせ、かみそりまたは外科用メスの刃を使用して、手術部位を剃る。毛皮を事前に湿潤この解剖学的位置に簡単に剃ることができます。 </li><li> 70％エタノールに続くようなベタジン外科スクラブ（7.5％ポビドンヨード）などのヨウ素溶液、で皮膚をきれいにしてください。徹底的に領域を消毒するために、この清掃をさらに2回繰り返します。 </li><li> 、切開する耳の突起にエリア後方に尾側耳から後耳介静脈をトレースする場所を決定する。隆起に3ミリメートルの後部 - 春のはさみを使用して、4ミリメートル切開2を作る。 </li><li>鈍的切開を使用して皮下脂肪および筋膜を通して解剖。 、血管または筋肉組織を簡単に破損する可能性があるため、ハサミで直接切断しないでください。 </li><li>出血が発生した場合は、無菌の綿棒で手術部位に圧力を適用する少なくとも30秒間。重要な流体損失が発生した場合、25または27 G針を使用して0.9％滅菌生理食塩水までの0.5mlを腹腔​​内にマウスを注入する。 </li><li>顔面神経を見つけるために、いくつかの主要なランドマーク、脊髄副神経、外耳道を使用し、（後述）二腹筋を前方。顔面神経の枝が可視化されるまで、これらのランドマークの周りに解剖。それは明らかにし、筋膜の層が下にある構造に付着されたときに神経が重要な白色固体構造として表示されます。 <ol><li>皮下脂肪と筋膜が解剖された後、僧帽筋を支配するために頭蓋骨の尾の部分から移動する脊髄副神経を検索します。顔面神経は、脊髄アクセサリ神経に深い。 </li><li>真珠のような白に見え、顔面神経への吻側見ることができる軟骨外耳道を探す。 </li><li>の上部とC上に位置し、前二腹筋の筋腹を探す顔面神経にaudal。 </li></ol></li><li>顔面神経の主枝を可視化されると、茎乳突孔からその起源を見つけるために背側にそれらをトレースします。細かい使用すると、開いて新しく高度な面積を維持するために背側鉗子を移動した後、開いた手術部位を保持する神経のパス以下の春のはさみのヒントを進めるためにデュモン鉗子＃45分の5をひっくり返した。 </li><li>この時点で、頬骨と顔面神経の幹、頬、および限界下顎枝を可視化する。 注：一時的な分岐が孔に近い見つかります。近い顎にその上下に限界下顎神経の枝、従って、これらの神経枝は、このレベルでは表示されません。 <ol><li>神経切断を行う場合は、先端の細い鉗子で軽く神経を安定させ、春のはさみで神経を切った。脳幹から神経をavulsing防ぐために、ピンセットで神経にあまりにも多くのトラクションを適用することは避けてください。押す互いに離れる切り株、または全く再接続が発生しないことを保証するために、遠位神経の部分をカットし、削除する。 </li><li>挫滅損傷を実行した場合は、すべての軸索を切断する一定の圧力を用いて30秒間の神経を圧縮するデュモン＃45分の5鉗子を使用し、最初のクラッシュサイトに直交する第2の角度でこのクラッシュを繰り返します。そうでなければ怪我は動物の間一貫性がなくなります、30秒のクラッシュ時の圧力の可変量を適用することは避けてください。 </li></ol></li></ol> 4.閉会と回復<ol><li>下にある構造上の脂肪と筋肉を再配置します。 </li><li>切開のエッジを近似すると7.5ミリメートルの創傷クリップを使用して傷を閉じます。縫合糸または接着剤は、創傷閉鎖のためにも許容される。術後の鎮痛薬は、この時点で提供することができる。 </li><li>マウスの耳からテープを外します。イソフルランの流れをオフにして、マウスが1分30秒純酸素を呼吸することができます。 PL麻酔から回復する寝具で空のケージにマウスをエース。 </li><li>マウスが回復されると、顔面神経麻痺の確証的兆候がその挙動を調べる。ウィスカーが麻痺して戻って頬に向かって傾斜してなり、鼻がずれてしまう、との目は、空気のパフに応じて点滅しません。 </li><li>ハウス動物共同で、彼らが女性である場合は、手術後。彼らはより積極的であり、強制的に感染につながる、彼らのcagemateの創傷クリップを削除する傾向があるため、共同で雄マウスを収納しないでください。必要であれば、この時点では術後の鎮痛薬を提供します。 </li><li>全く感染または他の合併症は術後に発生していないことを確認するために操作した後、数日間一日一回のマウスを監視します。彼らは自分の上で落ちていない場合は、10日手術後 - 7創傷クリップを外します。 </li><li>目のまばたき反射が再いずれかになるまで、毎日の角膜合併症を防ぐために、罹患した眼に眼軟膏を潤滑適用カバーまたは安楽死まで、。 </li></ol>

著者らは、開示する利害の競合がない。

生体関連ゲノム領域におけるシトシンのメチル化のプロトコル提示収量の塩基対解像度データ。出発物質の50 ngのために最適化されて書かれたプロトコルは、しかし、それは、入力材料の範囲（5ngのまたは複数）26を処理するように適合させることができる。 表6に見られるように、これは、プロトコルのステップのいくつかの調整が必要となる。ERRBSライブラリはペアエンド配列決定およびさらなるゲノムカバーに適しているシング長い51サイクルより読み込むことによっても達成することができる。多重化された配列決定は、サンプルあたりのコストプロトコルを提供するが、これはデータに表さCpG部位当りの縮小範囲（ 図5および表8）になり、かつ当たり高いカバー力を必要とする分析を実行するために、カバレッジの十分な深さが得られないであろうCpG部位（Landan ら 33で説明した例のように）。最後に、このプロトコル（または重亜硫酸塩ベースのprotocol）はメチル-シトシンとヒドロキシメチルシトシン46,47を区別することができません。しかしながら、他のプロトコルと統合することができる生成されたデータは、異なる修飾を線引きする48,49をもたらし、他のシトシン修飾は最近、関心があるべきであり、50を報告した。 図3A-Cに示されており、一回シークエンシングのためにプールのような高品質のライブラリが表示されます両方のライブラリ留分から等しいモルの寄与を表す図3Gに示すようにトレース（赤トレース）が得られる。ライブラリ調製障害は手順中の任意の工程から生じ得る。分解したDNAが処理される場合は、このプロトコルで説明シングパラメータを使用してのMspI断片が濃縮され、したがって、低いのCpGカバレッジされていないライブラリになります。酵素は、非機能的または不注意の反応のいずれかから除外された場合、プロトコルが期待ライブラリをもたらさないであろう。ライゲーションREAた場合ctionは非効率的であり、アダプタは、予想よりも高濃度であり、および/または使用したプライマー濃度は、ライブラリー、障害が発生することができ、最終的な増幅工程のための制限試薬である。 （バイオアナライザ結果の〜150 bpのピークと見られ; 図3D-F）過剰アダプタは、ライブラリ内にも、ライブラリと過剰のアダプターの両方の無差別クラスタリングにシークエンシングを妨害する。そのようなライブラリは、明らかに正常にシーケンスかもしれないが、読み込みのかなりの部分は、単にアダプタのシーケンスになります。過剰のアダプタがライブラリに認められた場合、それは材料が数量比をアダプタために最適な入力素材を使用して利用可能な場合、ライブラリの準備を繰り返すのがベストです。最後に、ライブラリの効率的なPCR増幅を確実にするために、より低いおよびより高いライブラリ画分を亜硫酸水素塩変換し、PCR濃縮ステップを通して別々の試料として維持されている。これを怠ると、Pの間に、増幅の微分効率を生み出すのCR（ 図3G青のトレースに見られるように）上位と下位画分の反応および配列決定の際に、各ライブラリの画分に覆われたそれぞれのゲノム遺伝子座の不均等な表現の可能性。ユーザーがすぐに生成されているライブラリーを増幅するために必要な最適なPCRサイクルのさらなる滴定亜硫酸水素塩変換後に定量的PCRステップを含むように選択してもよい。 ERRBSライブラリ調製プロトコルは、特定の試薬が推奨されているいくつかの重要なステップがあります。エンドリペア工程では、四ヌクレオチドdNTPミックスの使用は、MspIで酵素スター活性に起因するものと、元のDNAサンプルに存在する剪断DNA断片として、CGオーバーハングを含有していない製品の最終修復を可能にする。これが結果に改善されたのCpG表現になる。連結工程では、ライゲーションをReactiことを保証するために高濃度リガーゼ（200万単位/ ml）およびメチル化アダプターを使用することが重要である上は効率的であり、亜硫酸水素塩変換が正確なデータの位置合わせのための不可欠なアダプター配列に影響しないこと。 PCR工程では、亜硫酸水素塩処理したGCリッチなDNA断片を増幅することができるポリメラーゼを用いて、高い特異性のために必要である。最後に、過剰のアダプターおよびプライマーの除去を確実にするために、（例：アジェンコートAMPure XP）SPRIビーズ精製は、連結およびPCR産物の単離のために列に基づいたアッセイではなく、推奨されます。 高品質のデータを生成するためには、効率的な亜硫酸水素塩変換を保証することが重要である。提示制御は、ユーザーにシークエンシングに先立って変換効率を決定する能力を提供しています。代替として、そのようなラムダDNAなどの非ヒトDNA、内部対照（スパイクイン）として使用することができる。による種の違いにより、このタイプの制御は、直接下流の配列決定に含めることができる（ 例えば、ユーによって使用されるような、 ら 34）。しかし、スパイク-iの場合利用sの、それを一意に増幅され、独立して、ライブラリーの配列決定の前に配列決定されない限り、ライブラリの配列決定に先立って変換効率を決定するために使用することができない。決定された換算率は、非CpG部位でのメチル化状態に基づいている。これは、非CpGコンテキストで高いシトシンメチル化の文脈で使用するのに適切でないかもしれない（例えば、胚性幹細胞）と平行サンプルまたは変換効率を評価する他の手段は、この目的のために利用することができる。 ERRBSライブラリの配列に固有であるアドレスには、いくつかの注意事項があります。配列決定されたライブラリの画分の最初の3つの塩基が原因のMspI認識切断部位にほぼ一様に非ランダムである（C ^ CGG; 図4B、Cを参照のこと）。低い品質に重要なデータの損失の可能性で、この結果は、シークエンシング時に見かけ上高いクラスター密度にもかかわらず、貧しいクラスタのローカリゼーションの結果を読み込みます。この障壁を克服するために、専用の制御​​車線として独立したレーン（PHIX制御や他のライブラリタイプ）の高い複雑さのライブラリが含まれています。高い複雑さのライブラリーは、配列決定され、最初の4つの塩基は、A、C、TおよびGのバランスの表現を含む端部を有する。適切なコントロールレーンは、RNA-seqの、チップ配列、全ゲノム配列決定、または配列決定機メーカー（ 例えば PHIXコントロールV3）によって提供されるコントロールなどのライブラリが含まれています。各配列決定実行の対照レーンとして指定する場合は、クラスタの位置を検出するために配列決定の最初の4つの塩基の間に利用される行列生成のための基礎として役立つことができる。高い品質が5.2によりCpG部位あたりの平均カバレッジを上げる（n = 4）をしますキャプチャさ読み込む。代替的に、この技術的な困難は、以前23に記載のようにダーククエンシングアプローチを用いて克服することができる。その他のシーケンシング基準は製造業者のプロトコルごとの標準操作手順に従ってください。のCpG Cあたりの最後に、報道データ分析のための芳泉は、目的の生物学的質問によってユーザによって部分的に案内される。 10倍のカバレージ閾値は、関心のものであるべきであるが、このしきい値を下げることができ、高いカバレッジ分析アプローチを与える。 ERRBSデータ解析の完全な議論はしかし、差別的メチル化シトシンと地域は、オープンソースツール31,51-53を用いて決定することができる、この記事の範囲を超えています。追加の分析の考慮事項とアプローチは54,55を十分に記載されており、読者は計画された分析に最も適切なツールについての文献を検索することが奨励されている。 他の公開方法と比較して、ERRBSは再現性の記載された歩留まり率が高いように行う4日間のプロトコルを提供しています。それのMassARRAY EpiTYPER 26標準金に比べて検証された、費用対効果の高いカバレッジデータ用であり、各種の入力材料に適応可能であるおよび配列決定アプローチ（臨床サンプル処理及び他の低周波の細胞型に有利な）量。これは、ゲノムワイドな結合転写因子、クロマチンリモデリング、エピジェネティックマークと関心のある他のシトシン修飾プロファイリング他の技術と分析、生物学的に関連する遺伝子座での塩基対の分解能を提供し、統合的に使用することができる。データがこのような研究で使用ERRBSは、総合的な分子的アプローチに貢献し、生物学的なモデルとヒト疾患の研究では、高次元解析を可能にすることができる。

シトシン（5-メチル）におけるDNAメチル化インプリンティング、X染色体不活性化、開発、および遺伝子発現1-8の調節を含むがこれらに限定されない生物学的過程、種々の哺乳動物細胞において重要なエピジェネティックなマークである。悪性および他の疾患におけるDNAメチル化パターンの研究は、疾患特異的パターンを決定し、疾患の病因と潜在的なバイオマーカーの発見9-17の理解に貢献してきました。 DNAのメチル化状態のためのエピゲノムを調べる多くのプロトコルがある。これらは、親和性に基づく、制限酵素ベース、および下流マイクロアレイまたは配列決定プラットフォームを利用して亜硫酸水素塩変換ベースのアッセイに分けることができる。さらに、複合重亜硫酸塩制限分析18および減少表現重亜硫酸塩シークエンシング（のCFM.rrb 19）、を含むがこれらに限定されますが、いないこれらの一般的なカテゴリを埋めるいくつかのプロトコルがあります。 </P&gt; のCFM.rrbはもともとマイスナーらによって記載された。19,20。プロトコルは、費用対効果の高い21,22で定量的な塩基対の解像度データが得られた重亜硫酸塩シークエンシング、続くGCリッチなゲノム領域を豊かにする手順を紹介しました。 GCに富む領域はMspIを（C ^ CGG）制限酵素によって標的化される、およびシトシンのメチル化は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、続いてシトシンの重亜硫酸塩変換（ウラシルに修飾されていないシトシンの脱アミノ化）によって解決される。のCFM.rrbは、遺伝子のプロモーターおよび全ゲノム配列決定のために必要な画分におけるCpGアイランドの大部分をカバー。しかしのCFM.rrbは、CpGの海岸と生物学的関連性の他の遺伝子間領域の限られた範囲を持っていた。いくつかのグループは、これらのゲノム領域23-25 ​​の方法論と結果の報道に改良元のレポート以降に更新のCFM.rrbプロトコルを公開している。強化されたの減少表現重亜硫酸塩Sequencing（ERRBSは）のCFM.rrbに比べライブラリ準備の修正および代替データ整列アプローチ26を含む。 ERRBSは生成されたデータで表現CpGの高い数をもたらし、26を尋問すべてのゲノム領域のカバレッジを増加させた。この方法は、ヒト患者及び他の動物標本26-30におけるDNAメチル化パターンを解決するために使用されている。 ERRBSプロトコルが完了し、代表的なヒトDNAを使用して生成されたデータに必要なすべてのステップにオファーの詳細を説明した（サンプルは、以前に報告され、非識別患者サンプル31から得られ、正常なヒトのドナーからのCD34 +骨髄サンプルされた）。プロトコルは、サンプルあたりの処理時間が短縮され、ライブラリーサイズの選択において高い精度を可能にする自動化されたサイズ選択プロセスを含む。プロトコルは、確立された分子生物学技術のシリーズを組み合わせた。高分子量DNAはワット消化エンド修理、-テーリング、およびメチル化されたアダプターの連結に続いてメチル化非感受性制限酵素（MspIで）i番目。 GCリッチフラグメントのサイズ選択は、亜硫酸水素塩変換し、配列決定の前にPCR増幅に続いている。重亜硫酸塩変換は、以前に32に記載されているとデータ分析やアプリケーションの詳細なレビューはお薦めや参照が読者の使用のために含まれていますが、この論文の範囲を超えている。プロトコルは、4日間にわたって行われ、小さな入力（50 NG以下）材料量に適していることができます。差動メチル化部位と領域決定のためだけでなく、エピジェネティックな多型検出のためだけでなく、十分なCpG部位当りの高いカバレッジ記載収量データなどのプロトコルは、 ら 33 Landanに記載されているように。

<table><tbody><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106M</td><td>100,000 units/ml</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>MspI 酵素用反応バッファー; プロトコルステップ 1.2</td></tr><tr><td>フェノール溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td>10&nbsp;mM トリス HCl、pH&nbsp;8.0;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td> で安全<td>と取り扱いに関する説明を参照してください http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td>19-22 mg/ml</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>3 M, pH 5.2</td></tr><tr><td>Ethanol</td> <td>で安全と取り扱いに関する指示を参照してくださいSigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200プルーフ、分子生物学用</td></tr><tr><td>バッファー EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl、pH 8.5</td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン (トリス)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1 M、pH 8.5溶液を調製</td></tr><tr><td>トリス-エチレンジアミン四酢酸 (TE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>メーカーの推奨</td></tr><tr><td>に従って1x緩衝液に希釈T4 DNA リガーゼ反応バッファー</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td>10x 濃度</td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド三リン酸 (dNTP) 溶液ミックス</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>各ヌクレオチド</td></tr><tr><td>T4 DNA ポリメラーゼ ニュー</td><td>イングランド バイオラボ</td><td>M0203L</td><td>3,000 単位/ml</td></tr><tr><td>DNA ポリメラーゼ I、ラージ (Klenow) フラグメント</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0210L</td><td>5,000 単位/ml</td></tr><tr><td>T4ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>ニューイングランドBiolabs</td><td>M0201L</td><td>10,000単位/ ml</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>プロトコルステップ2.3</td></tr><tr><td>2'-デオキシアデノシン5'-三リン酸(dATP)</td><td>Promega</td><td>U1201</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Klenowフラグメント(3'&rarr;5' exo-)</td> <td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td>5,000 units/ml</td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>プロトコルステップ3.3</td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202M</td><td>2,000,000 units/ml</td></tr><tr><td>メチル化アダプター オリゴキット</td><td>Illumina</td><td>ME-100-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>磁気ビーズ精製ステップ (ステップ 4.3 および 8.2) を実装するプロトコル セクションで使用されます。使用前に室温に平衡化してください。</td></tr><tr><td>Pippin Prep ゲルカセット、2% アガロース、色素フリー</td><td>Sage Science</td><td>CDF2010</td><td>内部標準</td></tr><tr><td>認定 低範囲ウルトラアガロース</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td>トリス-ホウ酸-EDTA (TBE) バッファー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>50 bp DNA ラダー</td><td>NEB</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Dye, Orange (6x)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>メス&nbsp;ブレード&nbsp;いいえ&nbsp;11</td><td>フィッシャー科学</td><td>の3120030</td><td></td></tr><tr><td>QIAquickのゲルの抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNAのメチル化のキット</td><td>Zymoの研究</td><td>D5001</td><td>プロトコルのステップ6.2で使用</td></tr><tr><td>EZ DNAのメチル化ライトニング キット</td><td>Zymoの研究</td><td>D5030</td><td>ステップ6.2</td></tr><tr><td>のための代議 普遍的なメチル化された人間のDNAの標準的な</td><td>Zymoの研究</td><td>D5011</td><td>バイサルファイト変換制御として使用</td></tr><tr><td>FastStart ハイフィデリティPCRシステム</td><td>ロシュ</td><td>03553426001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA 高感度アッセイキット</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>Q32854</td><td>蛍光ベースのDNA定量アッセイ; プロトコルステップ1.1、9.1、10.1で使用</td></tr><tr><td>DynaMag-2 マグネット</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>高感度DNAキット</td><td>アジレントテクノロジー</td>ズ<td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 バイオアナライザー</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td><td>Illumina</td><td>GD-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3-HS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3002</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA サンプル調製</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>多重化ライブラリに使用されるバーコードアダプター。多重化プロトコルの補足ファイルを参照してください。</td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr>ボル<tr><td>テックスミキサー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドライブロックヒーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲル電気泳動システム</td>電気泳動電源<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲルdoc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVまたはブルーライトトランスイルミネーター</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

塩基対解像度でdnaメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNAメチル化パターンのマ​​ッピングが重く正常および疾患組織中で検討されている。種々の方法は、細胞中のシトシンメチル化パターンを調べるために確立されている。全ゲノムバイサルファイトシークエンシングの減少表現は、GCリッチなゲノム遺伝子座での定量的な塩基対の分解能シトシンメチル化パターンを検出するために開発された。これは、亜硫酸水素塩変換に続いて、制限酵素の使用を組み合わせることによって達成される。強化縮小表現重亜硫酸塩シークエンシング（ERRBS）が覆われ、生物学的に関連するゲノム遺伝子座を増加し、ヒト、マウス、および他の生物由来のDNA中のシトシンのメチル化をプロファイルするために使用されている。 ERRBSは、ライブラリーの調製において使用するための低分子量フラグメントを生成するために、DNAの制限酵素消化を開始する。これらの断片は、次世代配列決定のための標準ライブラリ構築にかけられる。最終amplificati前の非メチル化シトシンの重亜硫酸塩変換ステップに覆われたゲノム遺伝子座におけるシトシンのメチル化レベルの定量的なベースの解像度を可能にします。プロトコルは、4日以内に完了することができる。指定されたシーケンシング対照レーンを使用した場合、配列決定最初の3つの塩基で低複雑度にもかかわらず、ERRBSライブラリは、高品質のデータを得る。マッピングおよびバイオインフォマティクス解析は、次に実行され、歩留まりのデータを容易にゲノムワイドな様々なプラットフォームと一体化することができる。 ERRBSは、実現可能な研究用途の範囲内で、ヒト臨床サンプルおよび適用を処理すること小さな入力材料量を利用することができる。生成されたビデオは、ERRBSプロトコルの重要なステップを示しています。

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencingは、制限酵素消化とシトシンバイサルファイト変換を組み合わせたDNAメチル化解析のためのシーケンシングライブラリを調製する方法です。このプロトコルでは、50 ngの出発物質が必要であり、GCリッチゲノム領域での塩基対分解能データが得られます。

塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

この手順の全体的な目標は、塩基対分解能D-N-A-C-P-G、亜硫酸化によるシトシンと組み合わせた制限酵素消化に基づくメチル化分析のためのシーケンシングライブラリを生成することです。これは、最初に高品質のDNAのMSP1制限酵素消化を行い、次に末端修復、メチル化アダプターのテーリングおよびライゲーションを行うことによって達成されます。次のステップは、亜硫酸塩変換によって選択されたフラグメントのサイズに対して亜硫酸塩変換を実行することです。フラグメントはPCRを使用して増幅されます。最後のステップは、品質管理とシーケンシングの実行、そしてデータの視覚化と分析です。最終的に、重亜硫酸塩シーケンシングのリダクション表現を強化すると、CGリッチゲノム遺伝子座におけるシチジンメチル化パターンの定量的な塩基対分解能が検出されます。この手法がマイクロアレイなどの他のDNAメチル化法と比較した場合の主な利点は、少量の材料投入量を利用して、塩基対の分解能と生物学的に関連性のある部位で高カバレッジのD-N-A-C-P-Gメチル化データを生成できることです。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、従来のアッセイでカバーされていた領域を超えたエピジェネティックなパターンを探求することに興味を持ったときでした。私たちは、マイクロアレイから塩基対分解能DNAメチル化データの生成に移行するためのこの技術を開発し、他の次世代技術から生成されたデータと統合することに興味を持っていました。この方法は、エピジェネティクスの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、生物学的サンプルのエピジェネティックなパターン化や不均一性を、正常な対照や他の病状と比較した場合などです。一般的に、この方法に不慣れな人は、手順の長さ、多数の特定の要件、およびMamieフォールを生成するライブラリの独自のシーケンシング特性のために、難しいと感じるでしょう。私たちの研究室の研究専門家は、この手順のデモンストレーションを支援します このプロトコルを開始するため。まず、MSP One 制限酵素消化、鈍的末端修復反応、および 3 つの主要末端での 1 つのヌクレオチド付加を受けたゲノム DNA サンプルの精製アリコートを調製します。この時点で、DNA産物はアダプターライゲーションの準備が整い、10マイクロリットルのA-A-L-D-N-Aサンプルを0.2ミリリットルのPCRチューブに移し、チューブを氷上に置くことができます。さらに、アダプター分子のアリコートを氷上に置きます。次に、ライゲーション試薬ミックスを氷上で調製します。ライゲーション試薬とアダプター分子の両方をDNAサンプルに加え、数回上下にピペットで動かして混合します。PCRチューブをサーマルサイクラーに挿入し、ライゲーション反応を翌日16°Cで一晩進行させます。磁気ビーズまたはシリカカラムベースの固相DNA抽出キットを使用してライゲーション産物を精製します。精製プロセスの最後のステップで。30マイクロリットルのDNAフリーウォーターを加えてDNAを溶出します。精製されたDNA産物は、25ナノグラム以上の総DNAから開始したサンプルに必要になるまで、摂氏マイナス20度で保存することができます。PI and prepなどの自動ゲル抽出装置を使用して、150塩基対から400塩基対の長さのライゲーション製品を選択します。EthereumブロマイドやサイバーグリーンなどのDNA可視化色素は、フォークされたアダプター結合フラグメントのDNA移動特性を変化させる可能性があるため、アグロスカセットから必ず除外してください。標準的なアグロスゲルベースのサイズ選択プロトコルは、プロトコルのこのステップでも使用して、ピピン2%色素フリーのarosカセット上にDNA電気泳動を設定することができます。Pippin Prepコンソールで新しいプロトコルを作成し、カセットとして2%DFマーカーLオプションを選択します。次に、[use internal standards] オプションを有効にし、リファレンスレーン番号が 150 塩基対から 400 塩基対までの DNA フラグメントを単離するためのレーン番号と一致することを確認します。収集モードとして範囲オプションを選択し、次の制限パラメータを入力します:ベースペアの開始には135、ベースペアの終了には410、ベースペアの足には240。これにより、電気泳動場を電気溶出出力ポートに位置合わせするように装置に指示します。その範囲内のDNA断片が出口の近くを移動している場合。プロトコールファイルを保存した後、装置のセットアップ時にPippen Prepの標準的な操作手順に従って、ゲルカセットと装置のサンプルローディングウェルを準備します。電気泳動用のDNAサンプルを調製するには、所定のライゲーション後サンプルの30マイクロリットルのアリコートに10マイクロリットルのDNAマーカーを添加し、混合物をゲルカセットにロードします。まず、各サンプルから40マイクロリットルの電気泳動バッファーを取り出します。次に、40マイクロリットルのサンプルマーカー混合物を個々のウェルにピペットで移し、容量を交換します。コンソールに戻り、保存したプロトコルをロードし、開始を押して電気泳動を開始します。プログラムが240塩基対に達したら、ステップを一時停止し、ピペットで各出力ポートから40マイクロリットルのouitを手動で収集します。これらのフラクションを下位ライブラリフラクションとしてラベル付けします。下部ライブラリフラクションを回収した後、直ちに40マイクロリットルの新鮮な電気泳動バッファーを加えてアウトレットポートを洗浄します。バッファーを少なくとも3回ピペッティングして上下させ、次にスネットを吸引します。この洗浄をさらに2回繰り返して、出口から短い長さのDNA種の痕跡をすべて取り除きます。次に、40マイクロリットルの電気泳動バッファーをサンプルに加えます。elucianポートをしっかりと密閉し、実行ボタンを押してelucianプロセスを再開します。410塩基対の設定でEllucianプログラムが完了したら、すべての出口ポートから40マイクロリットルのイヌイットを収集し、これらのフラクションを上部ライブラリフラクションとしてラベル付けします。この時点で、両方のライブラリー画分はゲル化されており、すでに重亜硫酸塩変換が行われています。市販のキットを使用して、両方のライブラリー画分で重亜硫酸塩変換アッセイを実施します。変換プロセスの最終ステップで、DNAサンプルを40マイクロリットルのDNAフリー水で溶出します。重亜硫酸塩変換後、得られたDNAライブラリー断片は、各DNA分子のアダプター末端でハイブリダイズするプライマーを使用して濃縮PCR増幅を受けます。濃縮PCRの準備をするには、まず、硫化物変換されたサンプルの40マイクロリットルアリコートごとに160マイクロリットルのPCRマスターミックスを追加します。次に、得られた200マイクロリットルの混合物を4つの50マイクロリットルのアリコートに分割します。別々のPCRチューブに入れます。チューブをサーマルサイクラーに入れ、変換されたDNAテンプレートを増幅します。濃縮後、4つのPCR後生成物を1つの1.5ミリリットルチューブに引き込み、市販のPCRクリーンアップキットでDNAを精製します。マグネティックビーズ固相抽出キットを使用してPCR産物を精製する場合は、まず組み合わせた下部ライブラリPCR産物をビーズ中の総容量の1.7倍と混合することにより、標準的な操作手順を変更してください。次に、組み合わせた上部ライブラリーPCR産物を、ビーズ中の総容量の1.1倍と混合します。次に、70%エタノール洗浄ステップまでメーカーのプロトコルに従い、精製プロセスの最後のステップで各洗浄量を800マイクロリットルに変更する必要があります。50 μLのDNAフリー溶出バッファーでDNAを溶出します。精製したライブラリーを、必要になるまでマイナス20°Cで保存し、二本鎖DNAに選択的な蛍光ベースのアッセイを使用して、各ライブラリー画分の濃縮後のDNA含有量を定量します。さらに、バイオアナライザーを使用して、濃縮後のライブラリのサイズと品質を評価します。塩基対で表される平均DNA長を使用して、特定のライブラリー画分の実効DNAモル濃度を計算します。モル濃度がわかったら、DNAの遊離水を使用して、対応する上部および下部のライブラリ画分をそれぞれ2ナノモルの最終濃度まで希釈します。下部と上部のライブラリペアを1つのチューブに結合して、それぞれ20マイクロリットルの2ナノモルホールライブラリ混合物を作成します。これで、プールされたサンプルをシーケンシングする準備が整いました。E-R-R-B-Sなどのシーケンシング関連アッセイでは、上部および下部のライブラリ分子の品質とサイズ分布が、最終的なシーケンシングデータの品質を決定する重要な要素です。従来の手動ゲル抽出プロトコルと比較すると、E-R-R-B-Sプロトコルで使用される自動ゲル抽出装置は、一貫したサイズ分布を生成し、クロスサンプル汚染の可能性を最小限に抑えます。次に、BIS亜硫酸変換ライブラリー分子をシーケンシングのために送ると、すべてのDNA鎖からの生データが得られ、任意の鎖について、最初の3つのヌクレオチドの直後に各ヌクレオチド位置のデータ品質が劇的に増加することが示されています。この3つのヌクレオチドのコンセンサス配列が大部分のライブラリ分子についてCGGで設定されているため、データは、E-R-R-B-Sプロトコルが、主に隣接するゲノムフラグメントの望ましいセットを含むライブラリコレクションを生成したことを示唆しています。MSPでは、1つの制限ダイジェストを俯瞰的に終了します。E-R-R-B-Sプロトコールは、全ゲノムにわたるシチジンメチル化部位の塩基対分解能データを得ることができます。例えば、12番染色体がここに示されている。このプロトコルは、ゲノムワイドなCPGの縮小された表現をカバーしています。このビデオを見た後、基本分解能D-N-A-C-P-Gメチル化データを生成するためのE-R-R-B-Sライブラリの準備方法をよく理解しているはずです 一度習得すると、この手法は適切に実行すれば4日で実行できます。この手順を試行する際は、高品質のDNAから開始し、記載されているすべてのステップを含め、推奨されるパラメータを使用してバイサルフェート変換と配列の効率を検証することを忘れないでください。フェニルやクロロホルムの取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行するときは、化学フードでの作業や適切な廃棄物処理などの一般的な予防措置を常に講じる必要があります。この手順に従います。スパイロシーケンシングやマスアレイエピタイプなどの他の方法を実行して、所見を検証できます。さらに、遺伝子発現プロファイリングを実施して、検出されたDNAメチル化パターンの生物学的意義を決定することができます。限られた量のインプット材料から塩基対分解能DNA、メチル化パターンを生成する能力により、これまで不可能だった希少な細胞集団のプロファイリングが可能になりました。また、エピジェネティックな制御と疾患の不均一性を調査するために、臨床サンプルの大規模なコホートのプロファイリングも可能になりました。

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