塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

この手順の全体的な目標は、塩基対分解能D-N-A-C-P-G、亜硫酸化によるシトシンと組み合わせた制限酵素消化に基づくメチル化分析のためのシーケンシングライブラリを生成することです。これは、最初に高品質のDNAのMSP1制限酵素消化を行い、次に末端修復、メチル化アダプターのテーリングおよびライゲーションを行うことによって達成されます。次のステップは、亜硫酸塩変換によって選択されたフラグメントのサイズに対して亜硫酸塩変換を実行することです。

フラグメントはPCRを使用して増幅されます。最後のステップは、品質管理とシーケンシングの実行、そしてデータの視覚化と分析です。最終的に、重亜硫酸塩シーケンシングのリダクション表現を強化すると、CGリッチゲノム遺伝子座におけるシチジンメチル化パターンの定量的な塩基対分解能が検出されます。

この手法がマイクロアレイなどの他のDNAメチル化法と比較した場合の主な利点は、少量の材料投入量を利用して、塩基対の分解能と生物学的に関連性のある部位で高カバレッジのD-N-A-C-P-Gメチル化データを生成できることです。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、従来のアッセイでカバーされていた領域を超えたエピジェネティックなパターンを探求することに興味を持ったときでした。私たちは、マイクロアレイから塩基対分解能DNAメチル化データの生成に移行するためのこの技術を開発し、他の次世代技術から生成されたデータと統合することに興味を持っていました。

この方法は、エピジェネティクスの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、生物学的サンプルのエピジェネティックなパターン化や不均一性を、正常な対照や他の病状と比較した場合などです。一般的に、この方法に不慣れな人は、手順の長さ、多数の特定の要件、およびMamieフォールを生成するライブラリの独自のシーケンシング特性のために、難しいと感じるでしょう。

私たちの研究室の研究専門家は、この手順のデモンストレーションを支援します このプロトコルを開始するため。まず、MSP One 制限酵素消化、鈍的末端修復反応、および 3 つの主要末端での 1 つのヌクレオチド付加を受けたゲノム DNA サンプルの精製アリコートを調製します。この時点で、DNA産物はアダプターライゲーションの準備が整い、10マイクロリットルのA-A-L-D-N-Aサンプルを0.2ミリリットルのPCRチューブに移し、チューブを氷上に置くことができます。

さらに、アダプター分子のアリコートを氷上に置きます。次に、ライゲーション試薬ミックスを氷上で調製します。ライゲーション試薬とアダプター分子の両方をDNAサンプルに加え、数回上下にピペットで動かして混合します。

PCRチューブをサーマルサイクラーに挿入し、ライゲーション反応を翌日16°Cで一晩進行させます。磁気ビーズまたはシリカカラムベースの固相DNA抽出キットを使用してライゲーション産物を精製します。精製プロセスの最後のステップで。

30マイクロリットルのDNAフリーウォーターを加えてDNAを溶出します。精製されたDNA産物は、25ナノグラム以上の総DNAから開始したサンプルに必要になるまで、摂氏マイナス20度で保存することができます。PI and prepなどの自動ゲル抽出装置を使用して、150塩基対から400塩基対の長さのライゲーション製品を選択します。

EthereumブロマイドやサイバーグリーンなどのDNA可視化色素は、フォークされたアダプター結合フラグメントのDNA移動特性を変化させる可能性があるため、アグロスカセットから必ず除外してください。標準的なアグロスゲルベースのサイズ選択プロトコルは、プロトコルのこのステップでも使用して、ピピン2%色素フリーのarosカセット上にDNA電気泳動を設定することができます。Pippin Prepコンソールで新しいプロトコルを作成し、カセットとして2%DFマーカーLオプションを選択します。

次に、[use internal standards] オプションを有効にし、リファレンスレーン番号が 150 塩基対から 400 塩基対までの DNA フラグメントを単離するためのレーン番号と一致することを確認します。収集モードとして範囲オプションを選択し、次の制限パラメータを入力します:ベースペアの開始には135、ベースペアの終了には410、ベースペアの足には240。これにより、電気泳動場を電気溶出出力ポートに位置合わせするように装置に指示します。

その範囲内のDNA断片が出口の近くを移動している場合。プロトコールファイルを保存した後、装置のセットアップ時にPippen Prepの標準的な操作手順に従って、ゲルカセットと装置のサンプルローディングウェルを準備します。電気泳動用のDNAサンプルを調製するには、所定のライゲーション後サンプルの30マイクロリットルのアリコートに10マイクロリットルのDNAマーカーを添加し、混合物をゲルカセットにロードします。

まず、各サンプルから40マイクロリットルの電気泳動バッファーを取り出します。次に、40マイクロリットルのサンプルマーカー混合物を個々のウェルにピペットで移し、容量を交換します。コンソールに戻り、保存したプロトコルをロードし、開始を押して電気泳動を開始します。

プログラムが240塩基対に達したら、ステップを一時停止し、ピペットで各出力ポートから40マイクロリットルのouitを手動で収集します。これらのフラクションを下位ライブラリフラクションとしてラベル付けします。下部ライブラリフラクションを回収した後、直ちに40マイクロリットルの新鮮な電気泳動バッファーを加えてアウトレットポートを洗浄します。

バッファーを少なくとも3回ピペッティングして上下させ、次にスネットを吸引します。この洗浄をさらに2回繰り返して、出口から短い長さのDNA種の痕跡をすべて取り除きます。次に、40マイクロリットルの電気泳動バッファーをサンプルに加えます。

elucianポートをしっかりと密閉し、実行ボタンを押してelucianプロセスを再開します。410塩基対の設定でEllucianプログラムが完了したら、すべての出口ポートから40マイクロリットルのイヌイットを収集し、これらのフラクションを上部ライブラリフラクションとしてラベル付けします。この時点で、両方のライブラリー画分はゲル化されており、すでに重亜硫酸塩変換が行われています。

市販のキットを使用して、両方のライブラリー画分で重亜硫酸塩変換アッセイを実施します。変換プロセスの最終ステップで、DNAサンプルを40マイクロリットルのDNAフリー水で溶出します。重亜硫酸塩変換後、得られたDNAライブラリー断片は、各DNA分子のアダプター末端でハイブリダイズするプライマーを使用して濃縮PCR増幅を受けます。

濃縮PCRの準備をするには、まず、硫化物変換されたサンプルの40マイクロリットルアリコートごとに160マイクロリットルのPCRマスターミックスを追加します。次に、得られた200マイクロリットルの混合物を4つの50マイクロリットルのアリコートに分割します。別々のPCRチューブに入れます。

チューブをサーマルサイクラーに入れ、変換されたDNAテンプレートを増幅します。濃縮後、4つのPCR後生成物を1つの1.5ミリリットルチューブに引き込み、市販のPCRクリーンアップキットでDNAを精製します。マグネティックビーズ固相抽出キットを使用してPCR産物を精製する場合は、まず組み合わせた下部ライブラリPCR産物をビーズ中の総容量の1.7倍と混合することにより、標準的な操作手順を変更してください。

次に、組み合わせた上部ライブラリーPCR産物を、ビーズ中の総容量の1.1倍と混合します。次に、70%エタノール洗浄ステップまでメーカーのプロトコルに従い、精製プロセスの最後のステップで各洗浄量を800マイクロリットルに変更する必要があります。50 μLのDNAフリー溶出バッファーでDNAを溶出します。

精製したライブラリーを、必要になるまでマイナス20°Cで保存し、二本鎖DNAに選択的な蛍光ベースのアッセイを使用して、各ライブラリー画分の濃縮後のDNA含有量を定量します。さらに、バイオアナライザーを使用して、濃縮後のライブラリのサイズと品質を評価します。塩基対で表される平均DNA長を使用して、特定のライブラリー画分の実効DNAモル濃度を計算します。

モル濃度がわかったら、DNAの遊離水を使用して、対応する上部および下部のライブラリ画分をそれぞれ2ナノモルの最終濃度まで希釈します。下部と上部のライブラリペアを1つのチューブに結合して、それぞれ20マイクロリットルの2ナノモルホールライブラリ混合物を作成します。これで、プールされたサンプルをシーケンシングする準備が整いました。

E-R-R-B-Sなどのシーケンシング関連アッセイでは、上部および下部のライブラリ分子の品質とサイズ分布が、最終的なシーケンシングデータの品質を決定する重要な要素です。従来の手動ゲル抽出プロトコルと比較すると、E-R-R-B-Sプロトコルで使用される自動ゲル抽出装置は、一貫したサイズ分布を生成し、クロスサンプル汚染の可能性を最小限に抑えます。次に、BIS亜硫酸変換ライブラリー分子をシーケンシングのために送ると、すべてのDNA鎖からの生データが得られ、任意の鎖について、最初の3つのヌクレオチドの直後に各ヌクレオチド位置のデータ品質が劇的に増加することが示されています。

この3つのヌクレオチドのコンセンサス配列が大部分のライブラリ分子についてCGGで設定されているため、データは、E-R-R-B-Sプロトコルが、主に隣接するゲノムフラグメントの望ましいセットを含むライブラリコレクションを生成したことを示唆しています。MSPでは、1つの制限ダイジェストを俯瞰的に終了します。E-R-R-B-Sプロトコールは、全ゲノムにわたるシチジンメチル化部位の塩基対分解能データを得ることができます。

例えば、12番染色体がここに示されている。このプロトコルは、ゲノムワイドなCPGの縮小された表現をカバーしています。このビデオを見た後、基本分解能D-N-A-C-P-Gメチル化データを生成するためのE-R-R-B-Sライブラリの準備方法をよく理解しているはずです 一度習得すると、この手法は適切に実行すれば4日で実行できます。

この手順を試行する際は、高品質のDNAから開始し、記載されているすべてのステップを含め、推奨されるパラメータを使用してバイサルフェート変換と配列の効率を検証することを忘れないでください。フェニルやクロロホルムの取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行するときは、化学フードでの作業や適切な廃棄物処理などの一般的な予防措置を常に講じる必要があります。

この手順に従います。スパイロシーケンシングやマスアレイエピタイプなどの他の方法を実行して、所見を検証できます。さらに、遺伝子発現プロファイリングを実施して、検出されたDNAメチル化パターンの生物学的意義を決定することができます。

限られた量のインプット材料から塩基対分解能DNA、メチル化パターンを生成する能力により、これまで不可能だった希少な細胞集団のプロファイリングが可能になりました。また、エピジェネティックな制御と疾患の不均一性を調査するために、臨床サンプルの大規模なコホートのプロファイリングも可能になりました。