Name: 成体マウスにおける中脳ドーパミンニューロンの数の環境モジュレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶ環境エンリッチメントと性別ペアリングによる成体マウスの中脳ドーパミンニューロン可塑性変化のメカニズム。神経科学と行動生物学の研究に応用可能です。

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この研究は、National Health and Medical Research Council of Australia（NHMRC）プロジェクトの助成金1022839によって支援されました。AJHは、オーストラリア研究評議会(ARC)のFT3フューチャーフェロー(FT100100835)です。Florey Institute of Neuroscience and Mental Healthは、ビクトリア州政府のOperational Infrastructure Support Grantからの支援を認めています。

注：動物のすべての実験手順は、神経科学·精神衛生動物倫理委員会のフローリー研究所によって承認され、オーストラリアの国立保健医療研究評議会に準拠しては、科学的な目的のための動物の管理と使用の実践のためのコード（ 第7版を発行2004）。 1.環境マニピュレーション<ol><li>男女ペアリング<ol><li>性的に成熟した（&gt; 8週齢）、年齢をマッチさせた雄と雌のマウスを使用してください。 注：私たちは、一般的に、C57BL / 6マウスを使用しますが、このプロトコルでスイスマウスを使用して、同じ成果があった。我々は、典型的にはn =（n = 4の男性）は、n = 2オス - オスのペアに分け、各実験についてはn = 8の男性であり、n = 8の雌を使用して2メス - メスのペアた（n = 4匹）、そしてn = 4男女ペア（n = 4の男性であり、n = 4匹）。 </li><li>動物保持施設、グループ社内に到着すると&gt; 3日間、男女別のマウスは、順応する。こことthrougハウトは男女ペアリング、余分な環境刺激を維持する（ 例えば 、周囲温度、光：暗サイクル、食料、水、取り扱いおよびクリーニング）定数またはすべてのマウスに等しく分配する。 </li><li>ランダムにオス - オスペア、メス - メスのペア、または男女ペアに各マウスを割り当てます。食物および水を自由摂取アクセスを分離してきれいなケージ（2匹/ケージ）に各ペアを置き、単純に7日間連続して、この方法でそれらを収容する。 注：ルーチン畜産は、この期間中にOKですが、すべてのマウスに均等に分配されなければならない。男性と女性の同腹仔のペアリングを避けるように注意してください。 </li></ol></li><li>環境強化<ol><li>性的に成熟した（&gt; 8週齢）、年齢をマッチさせた雄または雌のマウスを使用してください。 注：私たちは、一般的にはn = 6 /治療群に分け、各実験のためのn = 18マウスを使用します。 </li><li>動物保持施設に到着すると、グループに収容され、同一規格内に収容された（SH）（ 例えばそれらを保つ</em&gt; 3日間は順応さのために&gt;この段階で）以下の条件を参照してください。ここでは、実験を通して、余分な環境刺激を維持する（ 例えば 、周囲温度、光：暗サイクル、食料、水、取り扱いおよびクリーニング）定数またはすべてのマウスに等しく分配する。 </li><li>環境エンリッチメントを開始するには、無作為に3グループのいずれかに各マウスを割り当てます。SH。実行中のホイール（RW）、または環境濃縮（EE）と一緒に食物および水に自由に摂取と同じ清潔なケージにマウスの各群を配置。 注：すべてのグループのためにここでは、より大きなラット保持ケージ42センチ、幅の広い27センチメートルを測定し、深い16センチメートルを使用した。 <ol><li>また、各グループに以下の環境条件を提供する：床にのみゴミを含んSH（紙ペレットまたはおがくず） SHプラス2走行輪を備えRW。これで元にRWプラス玩具（ロープ、はしご、トンネル、及びそのような空のペーパータオルロールとティッシュペーパーの破片などのオブジェクト）を含むEEplore、遊び、登る、非表示、および巣。 </li><li> 14日間連続して、この方法でそれらを家。 注：ルーチン畜産は、この期間中にOKですが、すべてのマウスに均等に分配されなければならない。 </li></ol></li><li> 1時間/日（同時間毎日）、5日/週のための新規のおもちゃを含むより大きなケージにそれらを一緒に配置することで、追加の「超濃縮&#39;（SE）に従うことを条件EEマウス。 注：ここでは46センチ、幅の69センチメートル長く、そして40センチメートル深いプラスチック浴槽を使用した。 <ol><li>おもちゃの異なるセット各セッションを提示することによって新規性を維持します。香りを除去するために石鹸水と80％エタノールを有するマウスに再提示されるクリーンな玩具。 </li><li>各SEセッションに続いて、彼らのEEケージにマウスを返す。ハンドルSHとRWマウスこの期間を通じて（SE自体を除く）SEマウスと同じ（ 例えば削除してから、そのケージに各SHおよびRWマウスを返す）。 </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li>準備<ol><li>市販されている無菌の浸透圧ポンプと脳注入キットを、使用してください。移植前日、無菌技術を使用して、各ポンプの充填（ポンプの取扱説明書に記載されている）の無菌薬剤または車両溶液とチューブとカニューレを接続することにより、プライムインプラント。それらを一緒に接続し、37℃で一晩滅菌生理食塩水でインキュベートする。交差汚染を避けるために、別々に薬物およびビヒクルで満たされた移植片をインキュベートする。 </li></ol></li><li>手術。 注：実験者の国によっては、特殊な動物実験の許可または引当金は、手術や術後の実験のようなタイプを追求するために必要とされている。 <ol><li>すべての手術用機器を殺菌し、全体で無菌技術を採用しています。 （ 例えば 、空気中で1〜2％イソフルランを使用して）、マウスを麻酔し、ステールに入れてくださいotaxicヘッドフレーム。作業中は麻酔の深さを確認し、必要に応じて、さらに麻酔薬を投与し（有害な足のピンチに手足離脱の例がないことは、十分な麻酔の指標である）。確実に眼を潤滑眼軟膏による乾燥から保護し、そしてマウスの体温は、手順全体を通して通常のままであることをしている。 </li><li>目の間から開始し、頭蓋骨の後縁に2cmの後部を終え、皮膚を通して正中切開を行います。ブラントは、（接続管が完了時に曲げるべきではありません）皮下「ポケット」カニューレが移植された後に、快適にポンプ及び連結チューブにフィットするのに十分な大きさを作成するために離れてマウスの背部の下、基礎となる筋膜から皮膚を解剖。頭蓋骨の背側面上から筋膜をクリアこすり。 </li><li>約1.5ミリメートルの直径歯科用バーを使用して、適切な定位で頭蓋骨にドリルダウンすると、座標until骨の薄い、柔軟な層が残る。ピール離れて細かい鉗子を使用して、この層（これは歯科用バーで、基礎となる硬膜と脳の損傷を避ける）。頭蓋骨は、任意の血液と骨の断片の清掃、それ以上の出血がないことをされていることを確認。 </li><li>カニューレホルダに保持されたカニューレを使用すると、マウスの背中の上に重なる皮下「ポケット」にポンプと接続管を配置。次に、適切な定位座標で、脳の表面にカニューレの先端を配置します。慎重に脳へのカニューレを下げるが、必要な深さの短い約1ミリメートルを停止します。 注：残りの深さは、歯科アクリルの第一層の適用後にネゴシエートされます。 </li><li>頭蓋骨の表面が清潔で乾燥している再確認し、その後、歯科アクリルの小さなボリュームを準備し、頭蓋骨の全露出領域の上にそれを滑らかにするためにつまようじを使用し、目の周りの頭蓋骨を通してバリの穴に含むEカニューレ。アクリルが硬化する前に、カニューレがターゲットに残りの深さを傾ける下げる。 </li><li>歯科アクリルの別の小さなボリュームを準備し、所定の位置にカニューレを固定するために、第1の過だけでなく、カニューレのための白いプラスチックの支持体上にこのレイヤ。必要に応じてアクリルの追加の層を繰り返します。 </li><li>アクリルが硬化した後は、慎重にカニューレホルダーを取り外し、ブタン火炎で加熱さメスの刃を使用して白いプラスチック取り外し可能なカニューレタブを遮断する。最後に、インプラント全体にわたって閉じた皮膚を縫合。 </li></ol></li><li>動物の手術後の治療<ol><li>皮膚の余白に消毒軟膏を適用し、マウスに抗炎症を管理する（ 例えばメロキシカム、3 mg / kgを皮下）。 、フレームからマウスを外し加熱ランプ下に置き、そしてそれが意識を取り戻すまで観察する。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けたマウスを返さないでください。 注：EXPそのような男女のペアリングと環境充実などerimental操作が開始されるか、または早くとも手術翌日再開することができます。 </li><li>自分の体重、毎日の一般的な動作と外観を監視します。局所消毒軟膏と外科的切開の周りに感染の兆候（ 例えば腫脹、発赤、膿）を扱います。必要に応じて、全身鎮痛剤および/ ​​または抗生物質で（&gt; 10％の体重、引きこもり、グルーミングの欠如、「毛羽立ち」、運動機能障害、発作の例えば損失）兆候の病気、痛み、ストレスや不快感を扱います。 </li><li> &gt; 15％の体重減少や​​病気、痛み、ストレスや不快感の症状は、是正処置の1週間以内に回復不能な場合、マウスを安楽死させる。 </li></ol></li></ol> 3.脳組織の調製、免疫組織化学的処理、および立体学<ol><li>かん流<ol><li>すぐに環境/薬物の操作以下、研究のために脳を準備します。 <br/&gt;注：ここに報告する実験ではSNcのTH +ニューロンの数を、異なる処置群のそれぞれにおいて測定して比較した。 </li><li>まずマウス（ 例えば 、100 mg / kgを腹腔内ペントバルビタールナトリウム）を殺すために麻酔薬の過剰摂取を管理する。一度麻酔し、心臓が鼓動を停止する前に、その背中の上でマウスを置くとネクタイまたは両方前肢を突き止める。 </li><li>胸部を覆う皮膚を切り取るメスを使用すると、その後腹腔内にちょうど肋骨の下の筋肉を通して切開する。胸郭の剣状突起上のクランプを配置し、振動板を露出する肝臓から持ち上げて胸郭を持ち上げます。 </li><li>胸郭、肺および心臓を露出させるために頭の上に折り返さできるまで、絞りを介して、大きなハサミを使用して、両側の横方向リブを切断する。細かいハサミを使用すると、左のventriのベースを切断、血液と灌流ソリューションの出口点として右心房に小さな切開を作るクレと左心室、左心房を通ってカニューレを配置し、大動脈に。 </li><li>ヘパリン化温かい（37℃）ポンプその後適所にカニューレを固定し、右心房を出る溶液まで、血管系を介して0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）は、血液が完全に自由である。全体マウスがうまく固定されるまで、次に、血管系を通って（例えば、PBS中の4％パラホルムアルデヒドとして）冷たい（4℃）固定液ポンプ。脳のシンクまで、2〜3日間30％ショ糖を含むPBS中で脳と場所を削除します。 注：組織調製の他のタイプは、対応する研究室の専門知識に応じて適用される場合があります。 </li></ol></li><li>フリーフローティング凍結切片の調製<ol><li>関心の脳領域を通じて連続切片をカットし、PBSでこれらを集める。 注：私たちは、クライオスタットを用いて、40μmの厚さの切片をカット。組織切片の他のタイプはcorrespondiの専門知識に応じて適用されることがありますNGの研究室。 </li></ol></li><li>免疫組織化学<ol><li>目的のタンパク質のための標準的な免疫組織化学を実行します。 48時間4℃で：（400 1）は、ポリクローナル、ビオチン化ヤギ抗ポリクローナルウサギ抗TH、次いで、30分間免疫反応を室温でPBS中の5％正常ヤギ血清および0.3％トリトンX-100で切片をインキュベート2時間室温で：-rabbit（千1）。 </li><li> 18〜20分間、次いで室温でコバルト及びニッケル強化ジアミノベンジジン（0.5mg / ml）をで、1時間、室温で;次に、アビジン - ペルオキシダーゼ（1：500）でインキュベートジアミノベンジジンインキュベーションの最後の3~5分間クロマゲン析出を触媒するために過酸化水素（0.01％）を加える。後に、上記の各ステップの間、セクションの前にPBSで10分間3回洗浄する。 </li><li>ゼラチン化顕微鏡スライド上のセクションをマウントし、空気それらを乾燥し、ニッスル染色（ニュートラルレッド）、アルコール脱水、（X-3B）をクリアし、カバースリップ。 </li></ol></li><lI&gt;立体学<ol><li>公平な立体的な方法を用いて、TH +とTH-のSNc（とVTAおよびLC）ニューロンの合計数を推定。 stereologistが受けた治療に盲目であることを確認してください。相馬直径&lt;5ミクロンに基づいてグリアを除外し、目に見える核を有する細胞のみをカウントします。 </li><li> TH +細胞およびPaxinosとワトソン7の脳地図によると、解剖学的ランドマーク/境界の空間的な位置によってのSNc（とVTAおよびLC）を特定します。 （; X = 100ミクロン、Y = VTAとLCのための100μmのX = Y140μmで、= SNCの140μm）を定期的に予め定められた間隔でカウントフレーム内のTH +細胞（55 X 55ミクロン= 3025ミクロン2）をカウントすべての4番目のセクション内の各核全体に。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

環境の操作 これらの環境の操作（男女ペアリングと環境エンリッチメント）の設計の背後にある動機は、環境かどうかを決定することであった、かつ/または環境によってプロンプト動作は、中脳DAニューロンの数の変化と関連している。焦点は、環境を提供し、中脳DAシグナリングに係合する可能性がある行動を刺激する上でしたので。これらは、反対の性別とのペアリング、車輪、ロープ、はしご、トンネル、探検するオブジェクトの実行へのアクセスを備えた環境エンリッチメント、遊び、登る、非表示、および巣が含まれていた。これらの環境の両方が脳DAニューロンの放電とDA放出（ 例えば 8）の急性の増加と関連している報酬-やる気認知、感情、モーターの動作を、育成するべき。私たちの仮説は、彼らはまた、脳DAのシグナル伝達BRで長持ちの変化に関連付けられていた。中脳DAニューロンの数の変化で約べきだ。ここでは、他の場所6、証拠が、これは確かにそうであることを提示する。 私たちの研究は、それ...

中脳の腹側被蓋領域（VTA）と黒質緻密部（SNC）におけるニューロンによるDArgicシグナリングは報酬やる気認知、感情、モーター行動のために重要であると考えられている。しかし、多すぎたり少なすぎたり、中脳DAシグナリングは、神経学的障害（ 例えば 、パーキンソン病、注意欠陥多動性障害、統合失調症、および薬物嗜癖）の様々な多くの無効症状を引き起こす。増加またはこれらの症状を緩和シグナルDAを減少させる薬物には、しかし、彼らはまた、調節不全シグナリングおよびオフターゲット効果に起因する副作用を生じる。薬物の有効性はまた、脳の応答を代償に起因する経時的に低下する。課題は、したがって、よりター​​ゲットと生理方法で正常な脳DAシグナリングを復元することで、有利なアプローチは、増加または中脳DAニューロンの数を減少させることによってである。 証拠は、SEVのために蓄積してきた成熟した大人の細胞ではDAと他のカテコールアミン代謝および輸送に関与する遺伝子やタンパク質の発現が（1にレビュー）変更可能であることをERAL十年。 THの免疫陰性（TH-）ニューロンの数は逆のパターン（ すなわち増加を示している中脳では、チロシンヒドロキシラーゼ免疫陽性（TH +、DA合成における律速酵素）ニューロンの数は、次の神経毒政権2,3を増加減少その後3）を減少させる。これは、いくつかの細胞による「DA表現型」の利得その後損失と一致している。 TH +およびTH-のSNcニューロンの数は、これらのセル4,5の電気的活性を変化させる種々の処理、以下、等しいが反対方向に変化することが示されている。例えば、小コンダクタンスの注入、カルシウム活性化カリウム2週間の脳に（SK）チャネルアンタゴニストアパミン（同じ量）TH +と増加数が減少νTH-のSNcのmberは4,5ニューロン。対照的に、SKチャネルアゴニスト1-EBIOの注入は、TH +の数を増加させ、（同じ量）TH-のSNcニューロン4,5の数を減少させる。同様の変化が求心性入力4を対象としたいくつかの含むのSNcニューロンの活動を、ターゲットに様々なトリートメント後に見られた。神経活動と求心性入力によるSNcのDArgicニューロンの数のこの明らかな規制は、環境や行動SNCのニューロンの数に影響を与えることができる可能性を高める。異なる環境にさらされる実際成体マウスは、多かれ少なかれ中脳（のSNcおよびVTA）TH +ニューロン、およびこれらの環境による変化の少なくともいくつかの脳6におけるシナプス入力の同時遮断によって廃止されています。この通信の目的は以下のとおりである。（1）当社の環境操作および薬物注入を実装する方法についてさらに詳しく説明します。 （2）電子という我々の主張を支持するさらなるデータを提供するnvironmentは求心性入力を介して 、中脳DAニューロンの数を調節する。

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia</td><td>AHN3640</td><td></td></tr><tr><td>ALZET 浸透圧ポンプ 1002</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004317</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Brain Infusion kit 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004760</td><td></td></tr><tr><td>ALZET カニューレホルダー 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA95015-0530</td><td>0008860</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Monomer Self-curing(歯科用アクリル溶剤)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, オランダ</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Self Curing(歯科用アクリルパウダー)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, オランダ</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>METACAM(メロキシカム)</td><td>Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia</td><td>L10100</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムPentobarbitone</td><td>Lethabarb、Virbac、ミルペラ、ニューサウスウェールズ</td>州<td>、オーストラリア571177</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>化学temecula、CA</td><td>S26リットル</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>メルクミリポア本社&nbsp;、290コンコードロード、ビレリカ、マサチューセッツ州01821</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>ポリクローナルウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ</td><td>メルクミリポア本社&nbsp;、290コンコードロード、Billerica, MA 01821</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>ポリクローナルビオチン化ヤギ 抗ウサギ</td><td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060</td><td>EO432</td><td></td></tr><tr><td>Avidin peroxidase</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>A3151-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Diamino-benzidine</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>D-5637</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>MicroBrightField Bioscience、185 Allen Brook Lane、Suite 101、ウィリストン、バーモント州05495</td><td>n / a</td><td></td></tr></tbody></table>

成体マウスにおける中脳ドーパミンニューロンの数の環境モジュレーション

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

脳や「脳の可塑性」で長持ちの変化は、疾患または損傷後の適応行動と脳の修復を根底にある。さらに、我々の環境との相互作用は、脳の可塑性を誘導することができる。ますます、研究は、脳および行動障害を治療するための有益な脳の可塑性を刺激する環境を識別しようとしている。二つの環境の操作は、増加または成体マウスの脳におけるチロシンヒドロキシラーゼ免疫陽性（TH +、ドーパミンの律速酵素（DA）の合成）ニューロンの数を減少させるが記載されている。第一は、ペアリングの男性と一緒に継続的に男性で約12％、中脳のTH +ニューロンが増加し1週間、のための雌マウスを含むが、女性では約12％、中脳のTH +ニューロンを減少させる。第二は、私は、走行輪、おもちゃ、ロープ、ネスティング材料などを含む「濃縮環境 &#39;（EE）で2週間連続して住宅マウスを含み、男性では約14％、中脳のTH +ニューロンをncreases。さらに、プロトコルは、同時に環境的に誘発される脳の可塑性のメカニズムを識別しやすくするためにこれらの環境の操作中に、中脳に直接薬剤を注入するために記載されている。例えば、より中脳のTH +ニューロンのEE-誘導は中脳の神経細胞へのシナプス入力の同時遮断によって廃止されている。一緒に、これらのデータは、環境に関する情報は、「DA」の遺伝子の発現をオンまたはオフに切り替えるために、中脳のニューロンにシナプス入力を介して中継されることを示している。このように、基礎となるメカニズムを標的と適切な環境刺激、または薬物は、脳DAの不均衡に関連する脳や行動障害を治療するのに役立つかもしれない（ 例えば 、パーキンソン病、注意欠陥多動性障害、統合失調症、および薬物中毒）。

これらの環境の操作にさらさ成体マウスは、中脳の数字（SNCとVTA）を変更されたではなく、LC、TH +ニューロン、及びEEプラスピクロトキシンまたはビククリンどちらの同時中脳注入（GABA受容体拮抗薬）は、よりのSNc TH +のEE-誘導を廃止しているニューロン。これらのデータは、以前に6に掲載された。本発明のデータは、その以前の研究の一環として行わ反復実験でコンパイルされたが、他の場所で公開されていない。 オスとペア女性がでます（ 図1の雌とペアになって、女性よりも少ないTH +のSNcおよびVTAニューロンを持っているのに対し、具体的には、大人の雌マウスとペアリングされている大人の雄マウスは、オスとペアに男性よりも多くのTH +のSNc及びVTA（中脳）神経細胞を持っている6）。これの別の例は直ちにfoはオスとメスのマウスにおけるTH +のSNcニューロンのSEの数平均±を示しており、 図1において、ここで提供されているllowingの男女ペアリング。 7日間の雌...

このプロトコルは、成体マウスの適応行動と脳修復の根底にある環境誘発性の脳変化を研究するための、2つの異なる環境操作と同時脳注入プロトコルを説明しています。

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

本実験の全体的な目的は、マウスの脳可塑性と行動変化を刺激する制御された環境条件を提供することです。これは、オスとメスのペアでの飼育と、対照群としてのオス同士およびメス同士のペアでの飼育を比較することで、長期的な異性ペアリングが脳に及ぼす影響を調べることにより達成されます。あるいは、環境濃縮が脳に及ぼす影響を調べるため、探索や遊びに利用できるさまざまな物体を配置したケージと、標準的な飼育ケージに分けた共同飼育を行うこともできます。これらの環境刺激に加えて、薬物投与などの他の処置を組み合わせることで、観察された脳および行動の変化の背後にあるメカニズムを特定することが可能になります。これらの環境エンリッチメントおよび処置は、中脳のGABA作動性シナプス伝達に依存して、中脳ドパミン作動性ニューロンの数に変化を誘導することが結果から示された。環境エンリッチメントとは、マウスに対する体性感覚、運動、および認知への刺激を増加させるパラダイムである。このアプローチを用いた研究により、多くの疾患モデルにおいて神経可塑性の向上や、学習および記憶の改善が示されている。この手法の意義は、環境要因によってもたらされる成体脳の可塑性のメカニズムを理解することにまで及びます。そしてこれは、脳および精神に関する多くの疾患の治療に関連しています。私たちは、シナプス入力による中脳ニューロン活性の摂動に応じて、中脳ドーパミン作動性ニューロンの数が変化していることに最初に気づいたとき、この手法を着想しました。浸透圧ポンプと脳注入カニューレの視覚的なデモンストレーションは、これらの手順を習得するのが非常に困難な場合があるため、極めて重要です。記述的な説明：性別ペアリングについて。性的に成熟し、週齢を合わせた雌雄のマウスを性別ごとにグループ分けし、同じリター（産子）にならないよう配慮します。各マウスを、オス同士のペア、メス同士のペア、またはオスとメスのペアにランダムに割り当て、餌と水に自由的にアクセスできる清潔な独立ケージに入れます。この環境を性別ペアリング期間中、継続的に維持します。すべての外部からの環境刺激を一定にするか、あるいはすべてのマウスに均等に分散させ、動物を7日間連続して飼育します。環境濃縮のため、性的に成熟した同齢の雄または雌のマウスを、「標準飼育」、「ランニングホイール設置」、「環境濃縮」の3つのグループのいずれかにランダムに割り当て、少なくとも3日間維持します。その後もこの状態を継続してください。14日間、餌と水に自由的にアクセスできるようにします。環境濃縮群では、標準飼育ケージには敷材のみを入れる必要があります。走行ホイール群には敷液に加えて2台の走行ホイールを設置し、環境濃縮群には敷材、2台の走行ホイール、および玩具を設置します。環境濃縮マウスを、新しい玩具が入ったより大きなケージに1日1時間一緒に配置し、さらなるスーパー濃縮（super enrichment）を行う。週5日、毎日同じ時間に、マウスを元の環境濃縮ケージに戻す。各セッション後、セッションごとに異なる玩具セットを提示することで、新規性を維持する。マウスに提示する玩具を、石鹸水および80% ethanolで洗浄します。匂いを除去するため、標準飼育群およびランニングホイール群についても、埋込前日に、同様の手順で同時間だけ同様の処置を行いますが、超エンリッチメント材料は追加しません。無菌操作を用いて、製造者の指示に従い、各滅菌オスモティックポンプ、接続チューブ、およびカニューレに、滅菌した薬剤または溶媒を満たします。その後、各パーツを接続し、手術当日に滅菌生理食塩水中で37°Cで一晩インキュベートします。トゥ・ピンチ（toe pinch）で鎮静を確認した後、動物に眼軟膏を塗布し、ヒートパッドの上に背臥位で配置します。次に、無菌操作を用いて、頭蓋骨の後端から2 cm後方から始まり、両眼の間で終わるように皮膚に正中切開を加えます。鈍的に皮膚を下の筋膜から剥離し、マウスの背中側に沿って、ポンプと接続チューブを余裕を持って収容できる十分な大きさの皮下ポケットを作成します。次に、頭蓋骨の背側にある筋膜をきれいに掻き取り、直径約1.5 mmの歯科用バーを用いて、適切な立体定位座標に従って、薄く柔軟な骨の層が残るまで頭蓋骨を穿孔し、この層を精細鑷子で剥離します。頭蓋骨から血液や骨片を取り除き、出血が止まったら、カニューレホルダーを使用して、作成したポケットにポンプと接続チューブを配置します。次に、カニューレの先端を脳表面の適切な立体定位座標に合わせ、目的の深さより1 mm手前まで、慎重にチューブを脳内に挿入します。頭蓋骨の表面が再び清潔で乾燥していることを確認し、歯科用アクリル樹脂を freshly prepared（調製した直後の状態）で、頭蓋骨の露出部位全体および、アクリルが硬化する前にカニューラ周囲のバーホール内にまで、爪楊枝を用いて平滑に塗布します。その後、カニューラの先端を標的に向けて残りの深さまで挿入します。カニューラが所定の位置に固定されたら、歯科用アクリル樹脂をさらに2層目として頭蓋骨上に塗り、同時にカニューラを固定するための白いプラスチック製サポートの上にも塗り、カニューラを固定します。アクリルが硬化した後、カニューレホルダーを慎重に取り除き、加熱したメスでプラスチック製のカニューレタブを溶かして切断します。次に、インプラント全体を覆うように皮膚を縫合します。皮膚の縁に消毒軟膏を塗布し、動物に抗炎症剤を投与します。最後に、マウスを固定器具から取り出します。ヒートランプの下に置き、動物が完全に回復するまで観察してください。雌の成体マウスと7日間ペアで飼育した雄の成体マウスは、雄同士でペアにした場合よりも、中脳のSNC領域の陽性ニューロンが約12%増加しています。対照的に、オスとペアにしたメスは、メス同士でペアにしたメスよりもTH陽性SNCニューロンが約12%少なくなっています。また、14日間の環境濃縮ペアリングおよびスーパー濃縮を行った成体オスマウスにおいても、TH陽性SNCおよび腹側被蓋野ニューロンの数が増加しました。溶媒を注入した環境濃縮およびスーパー濃縮群の動物では、TH陽性SNCニューロンが約14%増加しています。一方、標準的な飼育環境でvehicleを注入した動物、および環境濃縮に加えて超濃縮飼育を行いGABA$_A$受容体拮抗薬を注入した動物では、この増加は見られません。環境操作を行う際は、騒音を最小限に抑え、ケージ交換を避けるなど、動物への刺激を最小限に留めることが重要です。濃縮環境を構築する際は、多様なネスティング材を用意し、動物のストレスを最小限にするために巣の場所を固定することが極めて重要です。このビデオを視聴することで、脳と行動に変化をもたらすために、成マウスの環境をどのように操作するかについて十分に理解できるはずです。薬剤を取り扱う際は非常に危険な場合があるため、浸透圧ポンプを準備する際は必ず保護衣を着用してください。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

一次解離中脳のドーパミン細胞の培養は、ドーパミン神経細胞のシナプス前の特性の調査を可能にする。彼らはリアルタイムドーパミン放出の動力学とタンパク質/...

げっ歯類の新生児から一次分離した中脳ドーパミン細胞培養

マウスの内側前脳束の片側6-OHDAの病変を行うためのプロトコルが記述されています。このメソッドは、線条体ドーパミンと90.63の&gt;...

パーキンソン病の単方向、病変6-OHDAモデルマウスの開発

ドーパミンは、はっきりとドーパミンニューロンの細胞体と樹状突起を含む脳核、で規制されています。ここでは黒質（SN）とげっ歯類では腹側被蓋野（VTA）の中​​脳核のドーパミン調節では、結果を最大化するために解剖し、サンプル処理のアプローチを説明し、その結果、結論と洞察力。...

黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

一般的にパーキンソン病と運動障害では、高感度かつ信頼性のある行動アッセイは小説潜在治療をテストするために不可欠です。ここでは、黒質線条体系への損傷の程度の差に敏感と前臨床研究のために有用であるマウスのために感覚テストの管理可能なバッテリーを記述します。...

パーキンソン病のマウスモデルにおける感覚運動機能の評価

NF-κB依存性の成人の海馬の神経新生の操作および分析するための方法が説明されています。詳細なプロトコルは、マウスでの認知転帰の調査のための歯状回依存行動試験（空間パターン分離バーンズ迷路と呼ばれる）のために提示されている。この技術は、他の実験設定での調査を可能に役立ちます。...

NF-κB依存性神経新生の調節および分析のための方法

パーキンソン病における感受性メカニズムのマスク解除を行う遺伝子環境相互作用モデル

ドーパミン作動性ニューロンは、脳内で重要な調節役割を果たしています。それらの喪失はパーキンソン病に関連しています。このビデオでは、胚性マウス中脳から中枢ドーパミン作動性ニューロンの初代培養物を生成する方法を示します。このような培養物は、これらのニューロンがさまざまなストレスに対して非常に脆弱であることを研究するのに役立ちます。...

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

パーキンソン病中の中脳ドーパミン作動性ニューロンの変性の原因は完全には理解されていません。細胞培養システムは、これらのニューロンの神経生理学的特性を研究するための重要なツールを提供します。ここでは、神経変性のin...

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

シナプトソーム ドーパミンやドーパミン ・ トランスポーターの機能と線条体組織中ドパミンのレベルを評価することによりマウスにおけるドーパミン恒常性を調査するため高速液体クロマトグラフィー分析を表す実験ツールそれぞれ。ここでドーパミン組織量を測定、ドーパミン ・ トランスポーターの機能を評価するプロトコルを提案する.

高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソーム ドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価

この作品には、標準的な顕微鏡装置 (すなわち、光学顕微鏡 (x、y、z のモーターを備えられたオブジェクト テーブルを使用してマウス中脳ドーパミン作動性神経細胞数の公平な薬剤推定手順プロトコル平面)、およびデジタル画像解析のためのパブリック ドメイン...

光分留と標準的な顕微鏡装置を用いたマウス中脳のドーパミン作動性ニューロン数の薬剤の評価

私たちは、思春期のC57BL/6マウスに対して、男性と女性の両方で機能し、個別の青年期の曝露を可能にする加速社会的敗北ストレスモデルを開発しました。このモデルへの曝露は社会的回避を誘発しますが、敗北した雄と雌のマウスのサブセットでのみ行われます。...

思春期C57BL/6雄雌マウスの社会的敗北ストレスモデル

学ぶ環境エンリッチメントと性別ペアリングによる成体マウスの中脳ドーパミンニューロン可塑性変化のメカニズム。神経科学と行動生物学の研究に応用可能です。

成体マウスにおける中脳ドーパミンニューロンの数の環境モジュレーション

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