Name: 一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶ一本鎖DNAタイルを用いた複雑なDNAナノ構造の自己集合手法。ゲル電気泳動と原子間力顕微鏡で構造を検証し、ナノテクノロジー研究の基盤となる正確なサンプル調製プロトコルを習得する。

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この作品は、米海軍研究若手研究プログラム賞N000141110914、海軍研究助成N000141010827のオフィス、NSFキャリアアワードCCF1054898、NIHディレクターの新イノベーター賞1DP2OD007292のオフィスと（PY）は生物学的にインスパイア工学部スタートアップ基金ウィス研究所によって資金を供給させました清華 - 北京（BW）はライフサイエンススタートアップ基金センター。

<ol><li>Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+junctions+and+lattices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid junctions and lattices.</a> J. Theor. Biol. 99 (2), 237-247 (1982).</li>
<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-crossover+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li>
<li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li>
<li>Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-templated+self-assembly+of+protein+arrays+and+highly+conductive+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires.</a> Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).</li>
<li>Rothemund, P. W. K., Papadakis, N., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithmic+self-assembly+of+DNA+Sierpinski+triangles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles.</a> PLoS Biol. 2 (12), e424(2004).</li>
<li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li>
<li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite-size%2C+fully-addressable+DNA+tile+lattices+formed+by+hierarchical+assembly+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Finite-size, fully-addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45 (5), 735-739 (2006).</li>
<li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li>
<li>Schulman, R., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+crystals+with+a+programmable+kinetic+barrier+to+nucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Synthesis of crystals with a programmable kinetic barrier to nucleation.</a> Proc. Natl Acad. Sci. USA. 104 (39), 15236-15241 (2007).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li>
<li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+DNA+tube+circumferences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321 (5890), 824-826 (2008).</li>
<li>Sharma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+self-assembly+of+DNA+tubules+through+integration+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles.</a> Science. 323 (5910), 112-116 (2009).</li>
<li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li>
<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li>
<li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li>
<li>Zheng, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+molecular+to+macroscopic+via+the+rational+design+of+self-assembled+3D%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+crystal.+Nature%22%5BJournal%5D)">From molecular to macroscopic via the rational design of self-assembled 3D.</a> DNA crystal. Nature. 461 (7260), 74-77 (2009).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li>
<li>Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystalline+two-dimensional+DNA+origami+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Crystalline two-dimensional DNA origami arrays.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (1), 264-267 (2011).</li>
<li>Zhao, Z., Liu, Y., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+DNA+origami+tiles+into+larger+structures+using+preformed+scaffold+frames%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Organizing DNA origami tiles into larger structures using preformed scaffold frames.</a> Nano Lett. 11 (7), 2997-3002 (2011).</li>
<li>Woo, S., Rothemund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+molecular+recognition+based+on+the+geometry+of+DNA+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures.</a> Nat. Chem. 3 (8), 620-627 (2011).</li>
<li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li>
<li>Lin, C., Liu, Y., Rinker, S., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+tile+based+self-assembly%3A+building+complex+nanoarchitectures%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">DNA tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures.</a> ChemPhysChem. 7 (8), 1641-1647 (2006).</li>
<li>Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+based+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials based on DNA.</a> Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 65-87 (2010).</li>
<li>Voigt, N. V., Nangreave, J., Yan, H., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami%3A+a+quantum+leap+for+self-assembly+of+complex+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">DNA origami: a quantum leap for self-assembly of complex structures.</a> Chem. Soc. Rev. 40 (12), 5636-5646 (2011).</li>
<li>Wei, B., Dai, M., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+Shapes+self-assembled+from+single+stranded+DNA+tiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex Shapes self-assembled from single stranded DNA tiles.</a> Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).</li>
<li>Wei, B., Wang, Z., Mi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniquimer%3A+software+of+de+novo+DNA+sequence+generation+for+DNA+self-assembly%3A+an+introduction+and+the+related+applications+in+DNA+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Theor.+Nanosci%22%5BJournal%5D)">Uniquimer: software of de novo DNA sequence generation for DNA self-assembly: an introduction and the related applications in DNA self-assembly.</a> J. Comput. Theor. Nanosci. 4 (1), 133-141 (2007).</li>
<li>Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+design+of+sequences+for+nucleic+acid+structural+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Struct.+Dyn%22%5BJournal%5D)">De novo design of sequences for nucleic acid structural engineering.</a> J. Biomol. Struct. Dyn. 8 (3), 573-581 (1990).</li>
<li>Hansma, H. G., Laney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+to+mica+correlates+with+cationic+radius%3A+assay+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy.</a> Biophys. J. 70 (4), 1933-1939 (1996).</li>
<li>Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+nucleic+acid+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free nucleic acid logic circuits.</a> Science. 314 (5805), 1585-1588 (2006).</li>
<li>Yin, P., Choi, H. M. T., Calvert, C. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+biomolecular+self-assembly+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming biomolecular self-assembly pathways.</a> Nature. 451 (7176), 318-322 (2008).</li>
</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言している。

構造形成工程では、自己組織化DNAナノ構造のDNA鎖の混合物（ 例えば 、15 mM）のマグネシウムカチオンの適切な濃度を維持することが重要です。同様に、アガロースゲル特性評価/精製工程では、ゲル電気泳動中にDNAナノ構造を保持するゲルランニング緩衝液中で、適切なマグネシウムカチオン濃度（ 例えば 、10ミリモル）を維持することが重要です。 28T矩形構造×24Hのために、我々は異なるのMg ++濃度でアニーリングをテストし、構造は典型的には10の範囲内に形成されたことがわかった- （約20 mMのMg ++を持つ最高の形成収率）を30mMのMg ++。 足場折り紙の構造とは異なり、SST構造はモジュラーアーキテクチャを採用しています。異なる形状は、SSTタイルの適切なサブセットを選択することにより、同一のキャンバスから設計することができます。さらに、SST構造があちこち組み立てられます短い合成DNA鎖をMと折り紙のアプローチで使用される長い足場を必要としません。したがって、SST...

5,8,10 - - 13,17,23またはRNA 7,22定期的な3,4,7、前の核酸の自己組立作業1-25は、DNA 2を含む複雑な構造の様々な成功構築につながっています22とアルゴリズム5二次元格子、リボン10,12およびチューブ4,12,13、3次元結晶17、多面体11と有限、2Dは7,8を整形します。 21,25 - 16,18 -特に効果的な方法は、単一の足場鎖が複雑な形状9,14を形成するために、多くの短い補助ステープルストランドによって折り畳まれることにより足場のDNA折り紙、です。 我々は最近、一本鎖のタイル（SST）を使用して、所定の2次元形状を有する個別のナノ構造を構築するための方法を報告し、DNA折り紙26に匹敵する複雑さを有する構造を示しました。このarticleは私達の初期の作品26の適応であり、正確に所定の寸 ​​法（幅と長さ）および形態と洗練された有限の2次元形状に個別にアドレス指定するSSTを配置するための詳細なプロトコルを記述します。 SST方式の一つの重要な利点は、そのモジュール性です。構造体のすべてのコンポーネントのSSTアセンブリでモジュール構造単位として機能し、これらの海面水温の異なるサブセットは、異なる形状を作り出します。したがって、我々は短い、合成DNA鎖から所定の大きさや形状でナノ構造を構築するための一般的なプラットフォームを確立しました。 海面水温は、それぞれ10または11ヌクレオチド長の4つのドメイン（ 図1A）を含みます。海面水温は、その平行ヘリックスは、クロスオーバー結合によって一緒に保持されたDNA格子を作成するように結合します。各クロスオーバーは、リン酸が見やすくするための図で人為的に延伸されるドメイン2と3の間にリン酸塩です。クロスオーバーは、（離れて2ヘリカルターン（21塩基）を離間されています&lt;強い&gt;図1B）。複合長方形はヘリックスとヘリカル巻き数にそれらの寸法によって参照されます。たとえば、6ヘリックス幅で、8ヘリカルが長くなります長方形が8Tの長方形×6Hとして参照されます。海面水温は、取り残さ追加、またはその他の任意の形状と大きさ（ 図1C）の構造を作成するために再配置することができます。例えば、長方形のデザインは、所望の長さと半径（ 図1D）で管にロールバックすることができます。 あるいは、矩形SST格子はそれぞれ3 NMが7nmでによって、SSTの画素からなる分子キャンバスとみなすことができます。本研究では、310全長内部海面水温、左右の境界を構成する24の完全長海面水温、および上部と下部の境界を形成する28の半分の長さの海面水温の分子キャンバスを使用しています。キャンバスは、クロスオーバーによってリンクされた24の二重らせんを有し、各螺旋は28ヘリカルターン（294塩基）を含有し、したがってと呼ばれます28T矩形キャンバス×24H。 28Tキャンバス×24Hは、M13ファージの足場から作成されたDNA折り紙構造と同様の分子量を有します。

<table><tbody><tr><td>DNAストランド&nbsp;</td><td>統合DNA技術</td><td></td><td>セクション3.1</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>セクション 3.4.2</td></tr><tr><td>Freeze'N Squeeze DNA ゲル抽出スピンカラム</td><td>BIO-RAD</td><td>731-6166</td><td>セクション 3.6</td></tr><tr><td>Bruker's Sharp Nitride Lever Probes</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>SNL10</td><td>Section 4.3</td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td>セクション 3.6</td></tr><tr><td>遠心分離機 5430R</td><td>エッペンドルフ</td><td>5428 000.414</td><td>セクション 3.6</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡&nbsp;</td><td>Jeol</td><td>Jem 1400</td><td>セクション 7.4</td></tr><tr><td>マルチモード 8</td><td>Veeco</td><td></td><td>セクション 4</td></tr><tr><td>台風 FLA 9000 レーザー スキャナー</td><td>GE Heathcare Life Sciences</td><td>28-9558-08</td><td>セクション 3.5</td></tr><tr><td>超純蒸留水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td>セクション 3.7.1</td></tr><tr><td>マイカディスク</td><td>SPI サプライ</td><td>12001-26-2</td><td>セクション 4.1</td></tr><tr><td>スチール取り付けディスク</td><td>テッド・ペラ社</td><td>16218</td><td>セクション 4.1</td></tr><tr>TEM <td>電子顕微鏡科学</td><td>用カーボンコーティング銅グリッド</td><td>FCF400-Cu</td><td>セクション 7.2</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>デュモン</td><td>0203-N5AC-PO</td><td>セクション 7.31</td></tr><tr><td>グロー放電システム</td><td>Quorum Technologies</td><td>K100X</td><td>セクション 7.2</td></tr><tr><td>DNA エンジン Tetrad 2 ペルチェ サーマル サイクラー</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC&ndash;0240G</td><td>セクション 3.3</td></tr><tr><td>フクロウ Easycast B2 ミニゲル電気泳動システム</td><td>ThermoScientific</td><td>B2</td><td>セクション 3.4.3</td></tr><tr><td>Seekam LE アガロース 500G</td><td>ロンザ</td><td>50004</td><td>セクション 3.4.1</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Plus DNA ラダー、すぐに使える 75-20000bp</td><td>ThermoScientific</td><td>SM1333</td><td>セクション 3.4.4</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c UV-vis 分光光度計</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td>セクション 3.7</td></tr><tr><td>0.2μmフィルター</td><td>コーニング社製</td><td>431219</td><td>セクション 7.1.2</td></tr></tbody></table>

一本鎖dnaタイルから複雑な2次元形状の自己集合

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

現在のDNAナノアーキテクチャの方法は、自己組織化の原理を用いて様々な2Dおよび3D構造を成功裏に操作しています。この記事では、分子キャンバス上の分子ピクセルとして機能する一意にアドレス指定可能な一本鎖DNAタイルの自己組織化を通じて、洗練された2D形状を作製する方法に関する詳細なプロトコルについて説明します。各一本鎖タイル(SST)は、自己組織化中に4つの隣接ドメインに結合する4つの連結モジュールドメインで構成される42ヌクレオチドDNA鎖です。分子キャンバスは、SSTから自己組織化された長方形の構造です。310ピクセルの分子キャンバスから構成する分子ピクセル(SST)を選択し、対応するストランドをワンポットアニーリングにかけることで、所定の複雑な2D形状を形成します。SSTアプローチのモジュール性により、この方法のスケーラビリティ、汎用性、堅牢性を実証しています。他の方法と比較して、SST法は、de novoで設計および合成された短いDNA鎖を使用することで、情報ポリマーと配列の幅広い選択を可能にします。

海面水温の自己集合（図1）は、図2に示すように、28T矩形×24Hをもたらす。別の海面水温のためのDNA配列は、ストレプトアビジン標識（図3及び4）の形質転換を可能にするように最適化/改変することができます様々なサイズのチューブや長方形を形成するためにチューブに長方形（ 図5）、海面水温のプログラム可能な自己集合（図10）、および分子キャンバス（図8）を使用して、任意の2次元形状の構造。溶液は、任意の形状（図7）の露出した領域に沿って凝集するように2つのデザイン（ドメイン代替設計およびエッジプロテクタ設計）を試験しました。どちらのデザインは、同等のゲルの収量および構造的完全性を有しているが、それは少数の補助種（図6）を必要とするため、エッジプロテクターのデザインは、よりコスト効果的です。図9に示すように、ストランドピッキングとの混合は、...

DNAタイリングは、プログラム可能なナノ構造を作成するための効果的なアプローチです。本稿では、一本鎖DNAタイルの自己組織化により複雑な二次元形状を構築するプロトコールについて述べる。

一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

本実験の全般的な目的は、単鎖タイルを用いて複雑なDNAナノ構造体を形成することです。これは、慎重に設計された合成DNA鎖を目的のバッファー溶液中で混合し、第2ステップとして目的のDNAナノ構造体を形成させることで達成されます。その後、サンプルをアニールさせ、構造の自己組織化を行います。次に、ナノ構造体が正常に形成されたかを確認するため、ネイティブアガロースゲル電気泳動および原子間力顕微鏡イメージングを行います。その結果、ネイティブアガロースゲル電気泳動および原子間力顕微鏡イメージングにより、DNAナノ構造体が自己組織化したことが示されました。一般的に、この手法に不慣れな方は、このような自己組織化のサンプル調製が複雑であるため苦労すると思われます。本手順を開始する前に、オリゴヌクレオチドメーカーから指定の配列のDNA構成ストランドをRNaseフリーの水に溶解した状態でVbo 96ウェルプレートにて入手してください。24本のヘリックスと28本のターンに対応する362個のウェルのそれぞれから1 µLずつピペッティングします。100 µM/strandのRectangleを2 mLの試験管に加えます。次に、138 µLの脱イオン超純水を試験管に加え、200 nM/strandの濃度のストック溶液を作成します。0.2 mL PCRチューブに、200 nMのストック溶液 50 µL、10xアニーリングバッファーA 10 µL、および脱イオン蒸留水 40 µLを加えます。その後、サーマルサイクラーを用い、90°Cから25°Cまで冷却しながら、サンプルを17時間アニーリングさせます。SYBR safeで事前染色したネイティブな2%アガロースゲルを調製し、氷水バスの中で100 Vで2時間電気泳動します。終了後、青色光トランスイルミネーター上で、SYBR safe染色に適したフィルターを備えたゲルスキャナーを用いてゲルをイメージングします。1 kb DNAラダーの1,500 bpのバンドと同様の移動度を持つ主要なバンドを、鋭利で清潔なカミソリを用いて切り出します。切り出したゲル片をスピンカラムに入れ、マイクロチューブペスラーを使用してゲルを細かく砕いた後、4 °Cで438 Gにて3分間遠心分離します。遠心分離後、紫外線分光光度計を用いて260 nmでDNA濃度を測定します。この時点で、スコッチテープを用いて試料金属ディスクに付着したMICAを剥がして表面を平坦にし、試料ディスクを顕微鏡のイメージングステージに設置します。新しく劈開したマイカ表面に、1x ニーリングバッファーAを40 µL加え、続いて24 HELOCs by 28 turns rectangleの精製サンプルを5 µL加えます。混合液を約2分間静置させます。AFM窒化シリコンカンチレバーチップをカンチレバーホルダーに取り付け、スキャンサイズ2 µm、解像度1024ラインのフルイドタッピングモードでサンプルをイメージングします。また、内部ラベルについては、矩形の8枚の内部タイルおよび6枚の境界タイルに結合した3'末端17ヌクレオチドセグメントに対し、0.5から1 Hzの走査速度を用います。ハンドル付きの28本のストランドを、24 HELOCs 28 turns rectangleの残りの構成ストランドと混合し、境界ラベル用の200 nMストック溶液を作成します。ハンドル付きの14本のストランドを、24 heel seas 28 turns rectangleの残りの構成ストランドと混合し、内部ラベル用の200 nMストック溶液を得ます。境界ラベル付けを行うため、200 Nanomolarのストック溶液50 µL、100 micromolarのビオチン修飾アンチハンドル鎖60 µL、10 x アニーリングバッファーA 10 µL、および脱イオン蒸留水34 µLをPCR試験管に加えます。内部標識を行うには、200 nanomolarのストック溶液50 microliters、100 micromolarの内部アンチハンドルビオチン修飾鎖3 microliters、10 x アニーリングバッファーA 10 microliters、および脱イオン蒸留水37 microlitersをPCRチューブに加えます。次に、0.06 gの尿酸ホルム酸塩を3 mLの蒸留水に溶解させます。2%尿酸ホルム酸塩水性染色液を調製するために、シリンジに取り付けた0.2 µLフィルターを用いて染色液をろ過します。ろ過した染色液1 mLに、5 N水酸化ナトリウムを5 µL加えます。溶液を短時間ボルテックスした後、20,000 Gで遠心分離し、カーボンコートグリッドのコート面を上に向けて、以下の設定でグロー放電処理を行います。処理後、サンプル3.5 µLをグロー放電処理したグリッド上にピペットで滴下します。4分後、フィルターペーパーをグリッドの側面に接触させ、サンプルを吸い取ります。直ちに、染色液 3.5 µL をグリッドに滴下します。1分後、染色液を吸い取り、フィルターペーパーをグリッドに1〜2分間当てて保持します。その後、グリッドをTEM試料ホルダーに移します。A-J-E-O-L GM 1400を用い、加速電圧 80 kilovolts、倍率 10 Kから80 Kの範囲で撮影した画像。形状を特定した後、分子キャンバス上でその形状に対応するストランドを選択する。露出したドメインを10から11ヌクレオチド長のpoly Tセグメントで置換するか、あるいは露出したドメインに相補的なエッジプロテクターを追加し、その末端を10から11ヌクレオチド長のpoly Tセグメントで終結させる。凝集を防ぐため、コルセットを含む310 pixelの分子キャンバス用のストランドライブラリを作成する。合計1,344個のエッジプロテクターを得るために、セット1スター、セット2スター、セット3スター、およびセット4スターを準備します。各セットの96ウェルプレートを遠心分離した後、コアセットから206ストランドを1 µL、セット1スターから0ストランド、セット2スターから0ストランド、セット3スターから0ストランド、そしてセット4スターから24ストランドを2 mL遠心チューブにピペッティングします。チューブに20 µLの脱イオン蒸留水を加え、DNAストランドの400 nMストック溶液を作成します。次に、400 nMのストック溶液50 µL、10xアニーリングバッファーB 10 µL、および脱イオン蒸留水40 µLを0.2 mL PCRチューブに加え、前述の手順に従ってサーマルサイクラーで17時間アニーリングさせます。サンプルを精製し、DNA濃度を測定した後、以前と同様にFMを用いてサンプルをイメージングします。最終的に、平行なヘリックスの数とヘリカルターンの数を変更することで、異なるサイズの長方形を構築します。一本鎖タイルの自己集合により、24 HELOCs × 28 turnsの長方形が形成されます。異なる一本鎖タイルのDNA配列を修飾および最適化することで、ストレプトアビジンの導入、標識、および長方形からチューブへの変換が可能になります。サイズが異なるチューブや長方形を形成するための一本鎖タイルのプログラマブルな自己集合、およびモレキュラーキャンバスを用いた二次元の任意形状の構築において、ドメイン置換設計とエッジプロテクター設計が、任意形状の露出ドメインに沿った凝集に対する解決策として検証されました。どちらの設計もゲル収量と構造的完全性は同等でしたが、エッジプロテクター設計の方が補助種が少なくて済むため、よりコスト効率が高くなっています。このビデオを視聴することで、単鎖タイルに基づいた複雑なDNAナノ構造体の作製方法について十分に理解できるはずです。

self-assembly-complex-two-dimensional-shapes-from-single-stranded-dna

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Chemistry

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