一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

次の実験の全体的な目標は、一本鎖タイルで複雑なDNAナノ構造を形成することです。これは、慎重に設計された合成DNA鎖を目的の緩衝液に混合して、第2のステップとして目的のDNAナノ構造を形成することによって達成されます。サンプルはひざまずいた状態で、構造の自己組織化が行われます。

次に、ナノ構造の形成が成功したことを確認するために、ネイティブアグロスゲル電気泳動と原子間力顕微鏡イメージングが行われます。その結果、ネイティブアグロ、ゲル電気泳動、原子間力顕微鏡イメージングに基づいて自己組織化されたDNAナノ構造が示されました。一般に、この方法に不慣れな個人は、このような自己組織化のサンプル調製が複雑であるように思われたため、苦労するでしょう:この手順を開始する前に、Vboのオリゴヌクレオチド製造業者からRNAに溶解した特定の配列のDNA成分鎖を取得し、Vbo 96ウェルプレートは、24ヘリックスの362ウェルのそれぞれから1マイクロリットルを28ターンピペットでピペットします。

長方形は、2ミリリットルの試験管にストランドあたり100マイクロモルを追加します。次に、138マイクロリットルの蒸留脱イオン水を試験管に加えて、ストック溶液を作ります。ストランドあたり200ナノモルの濃度で。

200 μL の 200 μl 液液を 50 μL 加えます。10 x アニーリングバッファー A 10 μL と 40 μL の蒸留脱イオン水を 0.2 mL PCR チューブに添加します。このaneに続いて、摂氏90度から25度に冷却するサーマルサイクラーで17時間サンプルを採取します。

SYBRセーフで染色した天然の2%アグロスゲルを調製した後、氷水浴で100ボルトで2時間運転します。完成したら、青色光トランスルミネーター上のSYBR安全染色に適したフィルターを備えたゲルスキャナーを使用してゲルを画像化し、シャープできれいなカミソリの刃を使用して、1つのキロベースDNAラダーの1、500塩基対のバンドと同様の移動性で支配的なバンドを切除します。目的のゲル片をスピンカラムに置き、マイクロチューブPeleを使用してゲルを細かく粉砕し、摂氏4度で438Gで3分間遠心分離します。

遠心分離後。紫外線分光光度計を使用して、260ナノメートルでDNAの濃度を測定します。このとき、試料金属ディスクに付着したMICAをスコッチテープで剥がして表面を平らにし、顕微鏡のイメージングステージに試料ディスクを載せます。

40マイクロリットルの1 xとひざまずく緩衝液Aを追加し、続いて24のHELOCの精製サンプルの5マイクロリットルを新たに切断されたマイカ表面に28回転長方形で加えます。混合物を約2分間沈殿させます。A FMシリコン亜硝酸塩カンチレバーチップをカンチレバーホルダーに取り付け、2マイクロメートルのスキャンサイズ、解像度1024ラインを使用して、流体タッピングモードでサンプルを画像

そして、矩形の8つの内部タイルと6つの境界タイルに3つの主要な17ヌクレオチドセグメントに取り付けられた内部標識について、0.5〜1ヘルツのスキャンレート。ハンドル付きの28本のストランドを、24個のHELOCの残りのコンポーネントストランドと28回転の長方形で混合して、境界ラベリング用の200ナノモルストック溶液を作成します。ハンドル付きの14本のストランドを、24ヒールシーの残りのコンポーネントストランドと28回転の長方形で混合して、内部ラベリング用の200ナノモルストック溶液を得ます。

境界ラベリングには、200ナノモルストック溶液を50マイクロリットル追加します。100マイクロモルビオチン修飾抗ハンドルストランド60マイクロリットル、10マイクロリットルの10 xアニーリングバッファーA、および34マイクロリットルの蒸留脱イオン水をA PCR試験管に追加します。

内部ラベリングのために、200ナノモルのストック溶液を50マイクロリットル加えます。内部アンチハンドルビオチンの3マイクロリットルは、100マイクロモルでストランドを修飾しました。10マイクロリットルの10 x アニーリングバッファーAと37マイクロリットルの蒸留脱イオン水をPCR試験管に入れます。

次に、3ミリリットルの蒸留水に0.06グラムの小便器ギ酸を秤量します。2%ギ酸水小便器染色液を調製するには、シリンジに取り付けられた0.2マイクロリットルのフィルターを使用して染色液をろ過します。ろ過した染色液1ミリリットルに5マイクロリットルの5つの正常水酸化ナトリウムを加えます。.

溶液を短時間ボルテックスした後、20, 000 Gのグローで遠心分離します。コーティングされた面を上にして、次の設定を使用してカーボンコーティングされたグリッドを排出します 終了したら、3.5マイクロリットルのサンプルをグロー放電処理されたグリッドにピペットで移します。4分後、濾紙を使用してサンプルを芯から吸い取り、濾紙をグリッドに接触させます。

これに続いて、すぐに3.5マイクロリットルの染色液をグリッドに加えます。1分後、汚れを吸い取り、濾紙をグリッドに1〜2分間保持します。グリッドをTEM試料ホルダーに移します。

A-J-E-O-L GM 1400 を使用した画像で、80 キロボルト、倍率 10 K から 80 K の範囲で動作します。形状が特定されたら、分子キャンバス上の形状に対応するストランドを選択します。露出したドメインを長さ 10 から 11 ヌクレオチドのポリ T セグメントに置き換えるか、露出したドメインに相補的なエッジ プロテクタを追加し、10 から 11 ヌクレオチドの長いポリ T セグメントで終端します。凝集を防ぐには、コルセットを含む 310 ピクセルの分子キャンバスのストランドライブラリを作成します。

1つの星セット2つ星セット、3つ星と4つ星の合計を与えるために1、344エッジプロテクターを設定します。異なるセットの96ウェルプレートを遠心分離した後、コアセットから206ストランドの1マイクロリットル、セットからゼロ、セットから1つのスターゼロ、セットから2つのスターゼロ、セット4スターから3つのスターと24ストランドを2ミリリットルの遠心分離チューブにピペットで移します。20マイクロリットルの蒸留脱イオン水をチューブに加え、DNA鎖の400ナノモルストック溶液を作ります。

次に、400ナノモルのストック溶液を50マイクロリットル加えます。10 μリットルの10 x アニーリングバッファーBと40マイクロリットルの蒸留脱イオン水を0.2ミリリットルのPCRチューブに、前述のようにサーマルサイクラーで混合物を17時間加えます。試料を精製し、DNA濃度画像を測定した後、前回と同様にFMを用いて、平行ヘオックの数とヘリカルターンの数を変更するだけで、最終的に異なるサイズの長方形を構築します。

一本鎖タイルの自己組織化は、異なる一本鎖タイルの矩形DNA配列を修正し、最適化するために、異なる一本鎖タイルの矩形DNA配列を28ターンで24HELOCs生成し、矩形をチューブに変換するために、連鎖球菌の分割とラベリングを可能にすることができます。さまざまなサイズのチューブや長方形を形成するための一本鎖タイルのプログラム可能な自己組織化と、分子キャンバスドメイン置換設計とエッジプロテクター設計を使用した2次元任意の形状の構築は、任意の形状の露出ドメインに沿った凝集の解決策としてテストされました。どちらの設計も同等のゲル収率と構造的完全性を持っていますが、エッジプロテクターの設計は、必要な補助種が少ないため、より費用対効果が高くなります。

このビデオを見れば、一本鎖タイルに基づく複雑なDNAナノ構造の作り方を十分に理解できるはずです。