一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

本実験の全般的な目的は、単鎖タイルを用いて複雑なDNAナノ構造体を形成することです。これは、慎重に設計された合成DNA鎖を目的のバッファー溶液中で混合し、第2ステップとして目的のDNAナノ構造体を形成させることで達成されます。その後、サンプルをアニールさせ、構造の自己組織化を行います。

次に、ナノ構造体が正常に形成されたかを確認するため、ネイティブアガロースゲル電気泳動および原子間力顕微鏡イメージングを行います。その結果、ネイティブアガロースゲル電気泳動および原子間力顕微鏡イメージングにより、DNAナノ構造体が自己組織化したことが示されました。一般的に、この手法に不慣れな方は、このような自己組織化のサンプル調製が複雑であるため苦労すると思われます。本手順を開始する前に、オリゴヌクレオチドメーカーから指定の配列のDNA構成ストランドをRNaseフリーの水に溶解した状態でVbo 96ウェルプレートにて入手してください。24本のヘリックスと28本のターンに対応する362個のウェルのそれぞれから1 µLずつピペッティングします。

100 µM/strandのRectangleを2 mLの試験管に加えます。次に、138 µLの脱イオン超純水を試験管に加え、200 nM/strandの濃度のストック溶液を作成します。

0.2 mL PCRチューブに、200 nMのストック溶液 50 µL、10xアニーリングバッファーA 10 µL、および脱イオン蒸留水 40 µLを加えます。その後、サーマルサイクラーを用い、90°Cから25°Cまで冷却しながら、サンプルを17時間アニーリングさせます。

SYBR safeで事前染色したネイティブな2%アガロースゲルを調製し、氷水バスの中で100 Vで2時間電気泳動します。終了後、青色光トランスイルミネーター上で、SYBR safe染色に適したフィルターを備えたゲルスキャナーを用いてゲルをイメージングします。1 kb DNAラダーの1,500 bpのバンドと同様の移動度を持つ主要なバンドを、鋭利で清潔なカミソリを用いて切り出します。切り出したゲル片をスピンカラムに入れ、マイクロチューブペスラーを使用してゲルを細かく砕いた後、4 °Cで438 Gにて3分間遠心分離します。

遠心分離後、紫外線分光光度計を用いて260 nmでDNA濃度を測定します。この時点で、スコッチテープを用いて試料金属ディスクに付着したMICAを剥がして表面を平坦にし、試料ディスクを顕微鏡のイメージングステージに設置します。

新しく劈開したマイカ表面に、1x ニーリングバッファーAを40 µL加え、続いて24 HELOCs by 28 turns rectangleの精製サンプルを5 µL加えます。混合液を約2分間静置させます。AFM窒化シリコンカンチレバーチップをカンチレバーホルダーに取り付け、スキャンサイズ2 µm、解像度1024ラインのフルイドタッピングモードでサンプルをイメージングします。

また、内部ラベルについては、矩形の8枚の内部タイルおよび6枚の境界タイルに結合した3'末端17ヌクレオチドセグメントに対し、0.5から1 Hzの走査速度を用います。ハンドル付きの28本のストランドを、24 HELOCs 28 turns rectangleの残りの構成ストランドと混合し、境界ラベル用の200 nMストック溶液を作成します。ハンドル付きの14本のストランドを、24 heel seas 28 turns rectangleの残りの構成ストランドと混合し、内部ラベル用の200 nMストック溶液を得ます。

境界ラベル付けを行うため、200 Nanomolarのストック溶液50 µL、100 micromolarのビオチン修飾アンチハンドル鎖60 µL、10 x アニーリングバッファーA 10 µL、および脱イオン蒸留水34 µLをPCR試験管に加えます。

内部標識を行うには、200 nanomolarのストック溶液50 microliters、100 micromolarの内部アンチハンドルビオチン修飾鎖3 microliters、10 x アニーリングバッファーA 10 microliters、および脱イオン蒸留水37 microlitersをPCRチューブに加えます。

次に、0.06 gの尿酸ホルム酸塩を3 mLの蒸留水に溶解させます。2%尿酸ホルム酸塩水性染色液を調製するために、シリンジに取り付けた0.2 µLフィルターを用いて染色液をろ過します。ろ過した染色液1 mLに、5 N水酸化ナトリウムを5 µL加えます。

溶液を短時間ボルテックスした後、20,000 Gで遠心分離し、カーボンコートグリッドのコート面を上に向けて、以下の設定でグロー放電処理を行います。処理後、サンプル3.5 µLをグロー放電処理したグリッド上にピペットで滴下します。4分後、フィルターペーパーをグリッドの側面に接触させ、サンプルを吸い取ります。

直ちに、染色液 3.5 µL をグリッドに滴下します。1分後、染色液を吸い取り、フィルターペーパーをグリッドに1〜2分間当てて保持します。その後、グリッドをTEM試料ホルダーに移します。

A-J-E-O-L GM 1400を用い、加速電圧 80 kilovolts、倍率 10 Kから80 Kの範囲で撮影した画像。形状を特定した後、分子キャンバス上でその形状に対応するストランドを選択する。露出したドメインを10から11ヌクレオチド長のpoly Tセグメントで置換するか、あるいは露出したドメインに相補的なエッジプロテクターを追加し、その末端を10から11ヌクレオチド長のpoly Tセグメントで終結させる。凝集を防ぐため、コルセットを含む310 pixelの分子キャンバス用のストランドライブラリを作成する。

合計1,344個のエッジプロテクターを得るために、セット1スター、セット2スター、セット3スター、およびセット4スターを準備します。各セットの96ウェルプレートを遠心分離した後、コアセットから206ストランドを1 µL、セット1スターから0ストランド、セット2スターから0ストランド、セット3スターから0ストランド、そしてセット4スターから24ストランドを2 mL遠心チューブにピペッティングします。チューブに20 µLの脱イオン蒸留水を加え、DNAストランドの400 nMストック溶液を作成します。

次に、400 nMのストック溶液50 µL、10xアニーリングバッファーB 10 µL、および脱イオン蒸留水40 µLを0.2 mL PCRチューブに加え、前述の手順に従ってサーマルサイクラーで17時間アニーリングさせます。サンプルを精製し、DNA濃度を測定した後、以前と同様にFMを用いてサンプルをイメージングします。最終的に、平行なヘリックスの数とヘリカルターンの数を変更することで、異なるサイズの長方形を構築します。

一本鎖タイルの自己集合により、24 HELOCs × 28 turnsの長方形が形成されます。異なる一本鎖タイルのDNA配列を修飾および最適化することで、ストレプトアビジンの導入、標識、および長方形からチューブへの変換が可能になります。サイズが異なるチューブや長方形を形成するための一本鎖タイルのプログラマブルな自己集合、およびモレキュラーキャンバスを用いた二次元の任意形状の構築において、ドメイン置換設計とエッジプロテクター設計が、任意形状の露出ドメインに沿った凝集に対する解決策として検証されました。どちらの設計もゲル収量と構造的完全性は同等でしたが、エッジプロテクター設計の方が補助種が少なくて済むため、よりコスト効率が高くなっています。

このビデオを視聴することで、単鎖タイルに基づいた複雑なDNAナノ構造体の作製方法について十分に理解できるはずです。