神経伝達物質を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光エンジニア記者の建設（CNiFERs）インビボ

このビデオの全体的な目標は、in vivoで特定の神経伝達物質の放出を光学的に監視するために使用できるCell-based Neurotransmitter Fluorescent Reporters(CNiFER)の構築と試験の方法論を説明することです。この方法は、脳内の神経調節物質のタイミングと放出に関する神経科学の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、GPCSを介して信号を発するあらゆるタイプの神経伝達物質または神経調節物質に適合させることです。

この方法の地域的なデモンストレーションが役立ちます。これはin vivo注射であり、その後のCNiFERのイメージングは技術的に困難です。この手順を開始するには、T-25フラスコにフロントベースのカルシウム検出器とキメラgタンパク質を含むHEK293細胞をご覧ください。

次に、加湿インキュベーターで摂氏37度、CO2を5%含み、約50%がコンフルエントになるまで細胞を増殖させます。その後、T-25フラスコからメディアを吸引します。2ミリリットルのレンチウイルス培地混合物を加え、T-25フラスコを摂氏37度で5%CO2とインキュベートします。

翌日、感染したHEK293細胞を1ミリリットルのトリプシンを加えて回収します。次に、細胞ペレットを5ミリリットルのHEK293増殖培地に再懸濁します。T-75フラスコに1ミリリットルの細胞を播種して凍結および保存し、1.5ミリリットルの細胞をT-25フラスコに播種してFACS分析を行います。

10ポイントアゴニスト曲線の場合、感染細胞をテストするために、フィブロネクチンでコーティングされた96ウェルプレートの最初の2列に、ウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液を播種します。次に、T-25フラスコ、T-75フラスコ、および96ウェルプレートで増殖したHEK293細胞を、摂氏37度で約90%コンフルエントになるまで、5%CO2で1〜2日間インキュベートします。FACS解析の前に、予測されたEC 50を囲む10種類のアゴニスト濃度の薬物プレートを調製することにより、GPCRの機能発現を決定します。

段階希釈法を使用して異なる濃度のアゴニストを調製し、薬物濃度を追跡するためのテンプレートを作成します。次に、プレートリーダーの温度を摂氏37度に設定します。次に、96ウェル蛍光プレートリーダーをプログラムして、フレットを測定し、溶液の移送を行います。

遺伝的にコード化されたフレットベースのカルシウムセンサーTNXXXでフレットを測定するには、励起波長を436±4.5ナノメートルに設定します。次に、ECFPとシトリンの発光フィルターとカットオフフィルターを設定します。次に、プレートリーダーをプログラムして、4秒ごとに合計180秒間排出量を測定します。

100マイクロリーダープレートの容量、150マイクロリットルのピペット高さ、および3倍コンパウンドプレートからの50マイクロリットルの薬物の送達のオプションを選択します。薬物送達の時点を 30 秒に設定します。その後、行AとBからメディアを吸引し、100マイクロリットルのACSFを96ウェルスニファープレート(約90%コンフルエント)に追加します。

次に、三重ドラッグプレートと96ウェルスニファープレートをプレートリーダーにロードします。プログラムを開始する前に、プレートを摂氏37度で平衡化するために30分間待ちます。プレートリーダーの実行後、蛍光リーダーの値をテキストファイルにエクスポートします。

次に、このファイルを以前に作成したスプレッドシートテンプレートにインポートして、蛍光強度を刺激前のベースラインに正規化し、各アゴニスト濃度のピークフレット比を計算し、用量反応曲線を生成します。CNiFERインジェクションピペットは、垂直電極プーラーにガラスキャピラリーを載せて準備します。一対の鉗子を使用して、電極の先端を約40マイクロメートルの直径に折します。

麻酔をかけたマウスの2×3mmの薄さの頭蓋骨窓にACSFを浸したスポンジを載せ、細胞を注射する準備をしている間、湿った状態を保ちます。次に、T-75フラスコで増殖させたCNiFERクローンを約80%のコンフルエンシーまで収穫します。培地を吸引し、滅菌PBSで細胞を洗浄します。

PBSを取り外し、10ミリリットルのACFSを使用してフラスコの底から細胞を取り除きます。次に、細胞を三角化して細胞塊を解離させます。細胞培養用遠心分離機で2分間遠心分離します。

上清を取り除き、ペレットを100マイクロリットルのACSFに再懸濁します。続いて、Gの1400倍で30秒間遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを残し、ACSFで覆います。その後、インジェクションピペットに鉱物油を戻します。

ピペットをナノインジェクターにセットします。マウス調製物の近くのプラスチックパラフィンフィルムのストリップに5マイクロリットルのCNiFER細胞懸濁液を入れます。CNiFER細胞をプルピペットに引き込みます。

次に、ピペットをターゲットのx座標とy座標に移動します。ピペットを下げ、事前に準備した薄くなった頭蓋骨に穴を開けます。頭蓋骨の表面から約200〜400マイクロメートル下、皮質の第2層と第3層まで進みます。

ナノインジェクターを使用して、4.6ナノリットルのCNiFER細胞を最も深い部位に注入します。オイルとセルの界面の動きに注意してください。そして、細胞が分注されるまで5分間待ちます。

ピペットを約100マイクロメートル引き出し、さらに4.6ナノリットルのCNiFER細胞を注入し、再び5分間待ちます。その後、CNiFERの逆流を防ぐために、ピペットをゆっくりと静かに引き出します。この手順では、頭部を拘束したマウスを装着したイメージングプラットフォームを、2光子イメージング顕微鏡の10倍水浸対物レンズの下に置きます。

505ナノメートルのダイクロイックミラーと、ECFP測定用の460ナノメートルから500ナノメートル、シトリン測定用の520ナノメートルから560ナノメートルのバンドパスフィルターを備えたフレットイメージング用のフィルターキューブを挿入します。次に、薄くなった頭蓋骨の窓を含むウェルにACSFを追加し、10倍の水浸対物レンズをACSFに下げます。接眼レンズを水銀と組み合わせて使用 lamp およびGFPフィルターキューブを使用して、CNiFERを特定します。

次に、40倍の水浸対物レンズに切り替えます。次に、2光子イメージングに適した光路を選択します。近赤外フェムト秒パルスレーザーをオンにします。

820ナノメートルの波長を選択し、5〜15%の電力設定pmt 1とpmt 2の電圧を最大値以下(通常は500〜1000ボルト)に設定します。次に、ゲインを各チャンネルで 1 に設定し、目標の z 位置をゼロにします。対物レンズを皮質表面から約100〜200マイクロメートル下げ、xyスキャンを開始します。

各チャンネルのレーザー出力、ゲイン、およびpmt電圧を調整して、CNiFERの蛍光の信号対雑音比を最適化します。次に、ソフトウェアを使用して、イメージングをCNiFER細胞を含む領域とバックグラウンド領域に制限します。適切な信号対雑音比を得るために、平均 2 のカウマン ラインを選択し、ピクセルあたり 4 マイクロ秒で 3 から 1 ヘルツのスキャン レートを使用します。

その後、CNiFERセルの周囲にROIを描画します。平面ごとに約3〜4個のセルを囲みます。ROI平均強度のリアルタイム分析を設定します。

次に、CNiFERの蛍光を経時的に監視するための取得を開始し、フレットを監視しながら電気刺激または行動実験を開始します。この例では、D2R CNiFERフレットの応答を溶液送達システムを備えたプレートリーダーで測定しました。このグラフは、D2 CNiFERsにドーパミンを塗布する際のフレット応答を示しています。

ECFPの排出量は減少しますが、シトリンはドーパミンとともに増加することに注意してください。そして、これが対応するフレット比のプロットです。ここに示されているのは、ドーパミンおよびノルエピネフェリンに対するD2 CNiFERの応答の用量反応曲線です。

さらに、D2Rを欠いている応答制御CNiFERを示します。この棒グラフは、50ナノモルと1マイクロモルでの他の神経伝達物質とモジュレーターのフレット比応答を示しています。ここでは、黒質のDAニューロンの電気刺激により、D2 CNiFERのフレット比に大きな変化が引き起こされます。

電気刺激の強度が増すにつれて、応答の振幅がどのように増加するかに注意してください。コカイン注射との結合刺激は、CNiFER応答を増強します。このビデオを見れば、in vivoイメージング用のCNiFERの作成、テスト、使用方法について十分に理解できるはずです。

CNiFERの開発を通じて、これらの細胞は最終的に生きたマウスに移植されるため、無菌技術を維持することが不可欠です。CNiFERの実現は、神経科学の分野の研究にとって、Gタンパク質共役型受容体を介してシグナルを送る神経伝達物質(神経調節物質)の放出を光学的に測定するための重要なツールとなります。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。