Name: 神経伝達物質を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光エンジニア記者の建設（CNiFERs）インビボ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 学ぶCNiFERsの構築法。HEK293細胞を用いて神経伝達物質の蛍光レポーターを作製し、GPCRを介する神経伝達物質のインビボ動態を光学的にモニタリングする技術です。

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私たちは、校正のためのイアンGlaaserとロバート・リフキン、クローンのスクリーニングの支援のために、電子機器の支援のためのG qi5とG QS5のcDNA、A.シュヴァイツァーを提供するためのN.テイラーB.コンクリン（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）を感謝します、およびTN-XXLのためのオリビエ​​Griesbeck。 （; DA037170 DA029706）、医学および生物工学研究所（NIBIB）（EB003832）、ホフマン・ラ・ロシュ（88610A）と「神経科学この作品は、薬物乱用に関する米国国立研究所（NIDA）を通じて研究助成金によってサポートされていましたNIDA（DA007315）を通じて虐待」訓練助成金の薬に関連します。

<ol><li>Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+vivo.+microdialysis+to+the+study+of+cholinergic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems.</a> Methods. 23, 21-39 (2001).</li>
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<li>Yamauchi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+ligand-gated+ion+channel+receptors+with+genetically+encoded+Ca2%2B+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors.</a> PLoS One. 6, e16519(2011).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+during+action+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation.</a> Nature. 494, 238-242 (2013).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

CNiFERsの作成 ​​は、光学的にin vivoでの脳内の神経伝達物質の放出を測定するための革新的でユニークな戦略を提供します。 CNiFERsは、理想的には、神経伝達物質、すなわちシナプスリリース、体積伝導を測定するのに適しています。重要なことには、各CNiFERは、脳内の神経伝達物質のレベルの変化の生理学的な光学的測定を提供する、天然のGPCRの特性を有します。現在までに、CNiFERsはアセチルコリンを検出するために作成されている（M1-CNiFER）6、ドーパミン（D2-CNiFER）7およびノルエピネフリン（α1A-CNiFER）7。 原則として、CNiFERは、GPCRを介して信号の任意の神経伝達物質のために作成することができます。 G qをGタンパク質を介して、GPCR信号は、さらなる変更がHEK293細胞に必要とされない場合には。 I / O、但し、Gのqi5キメラGタンパク質の共発現を必要とす...

完全ニューロンが脳内でどのように通信するかを理解するためには、 生体内での神経伝達物質の放出を測定するための方法が必要です。 生体内で神経伝達物質を測定するためのいくつかのよく確立された技術があります。 1つの一般的に用いられる技術は、カニューレが脳に挿入され、脳脊髄液の少量を採取し、高速液体クロマトグラフィーおよび電気化学的検出1を使用して分析された微小透析です。微小透析は、直径200μmのマイクロプローブのための〜0.5ミリメートル、 例えば 、プローブのいくつかの直径のオーダーの空間分解能を持っています。この技術の時間分解能は、しかし、一般的に約5分または1より長く続くサンプリング間隔に遅いです。さらに、分析はリアルタイムで行われていません。別の技術は、脳に挿入されたカーボンファイバープローブを使用して、高速走査サイクリックボルタンメトリー（FSCV）、です。 FSCVは、優れた温度を持っています経口解像度（サブ秒）、高感度（ナノモル）、および5〜30μmのプローブ径の空間分解能。しかし、FSCVカーボン電位差プローブ2の電圧との特性を酸化還元プロファイルを生成する送信機に限定されます。 神経伝達物質を測定するための第3の技術は、遺伝的にコードされた神経伝達物質（NT）バイオセンサ3を介して直接です。この方法で、融合タンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）フルオロフォア4のベースペアまたは順列GFP 5に接続された送信機のリガンド結合ドメインを含むように作成されます。前の2つの方法とは異なり、これらのバイオセンサーは、遺伝的にコードされ、トランスジェニック動物の産生を介して、または急性の細胞に感染するウイルス剤の使用と、そのようなニューロンとして、宿主細胞の表面に発現しました。現在までに、遺伝的にコードされたバイオセンサーは検知情報のために開発されていますグラムグルタミン酸やGABA 3-5。これらの技術に関する制限事項は、nM範囲の低感度、およびGタンパク質共役受容体（GPCR）を介してシグナル例えば送信機、古典的な神経伝達物質、神経ペプチドおよび神経修飾物質、多数のに検出を拡張することができないことでした。実際には、ヒトゲノム中に約800のGPCRがあります。 これらの不足に対処するために、我々は、GPCRを介して信号の任意の神経伝達物質の光学的に測定するリリースに革新的なツールを開発しました。 CNiFERs（セル・ベースの神経伝達物質の蛍光が記者を設計し）が刺激され、特定のGPCRを発現するように操作クローンHEK293細胞であり、遺伝的にコードされたFRETベースのCa 2+センサで検出された細胞内の増加の[Ca 2+]をトリガーTN-XXL。したがって、CNiFERsは、直接、リアルタイムの光Rを提供する、蛍光の変化に結合神経伝達物質受容体を変換します地元の神経伝達物質活性のEADアウト。指定された神経伝達物質のための天然受容体を利用することにより、CNiFERsは化学的特異性、親和性および内因的に発現される受容体の時間的なダイナミクスを保持している。これまでに、我々はドーパミンを検出するためのCNiFERs、M1受容体を使用してアセチルコリンを検出するための1つの、1の3種類を作成しましたD2受容体を使用して、α1A受容体6,7を使用して、ノルエピネフリンを検出するための1。 CNiFER技術は、GPCRのいずれかのタイプにそれが影響を受けやすい作り、容易に拡張可能かつスケーラブルです。このJoveの記事では、我々は説明し、任意のアプリケーションのためのin vivoでの CNiFERs で 、設計を実現するための方法論、およびテストを説明します。

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-ぷろ&nbsp;</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td>クロー<td>ニング:レンチウイルスを生成するため</td></tr><tr><td>12 x 75 *BD Falcon High Clarity ポリプロピレン丸底試験管</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 um Falcon cell strainers</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0.05% トリプシン EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96ウェルプレート、平底、透明&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>3596</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96ウェル細胞培養プレート&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux ブラッククリアボトム&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>3603</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Flexstation ピペットチップ</td><td>Molecular Devices</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>アセチルコリン塩化物&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A2661</td><td>フレックスステーション</td></tr><tr><td>ノルエピネフリン&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>ドーパミン塩酸塩&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>PHR1090</td><td>フレクステーション</td></tr><tr><td>GABA&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td>フレクステーション</td></tr><tr><td>ヒスタミン&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td>フレックスステーション</td></tr><tr><td>グルタミン酸&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td>フレックスステーション</td></tr><tr><td>エピネフリン&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4642</td><td>フレクスステーション</td></tr><tr><td>ソマトスタチン&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S1763</td><td>フレックスステーション</td></tr><tr><td>5HT&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>H9523</td><td>フレックスステーション</td></tr><tr><td>VIP&nbsp;</td><td>アルファ・ダイアグノスティックス社&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>フレキ</td></tr><tr><td>シン オレキシン</td><td>A アルファ ダイアグノスティックス(株)&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>12-p-01</td><td>フレクステーション</td></tr><tr><td>サブスタンス P&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>アデノシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Melatonin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>蛍光プレートリーダー & ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp;DMEM(高グルコース)とグルタマックス&nbsp;&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>10569-010</td><td>組織培養</td></tr><tr><td>&nbsp;ウシ胎児血清</td><td>Life Technologies</td><td>10082-139</td><td>組織培養</td></tr><tr><td>&nbsp;ペン/溶連菌感染症&nbsp;抗生物質</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>組織培養</td></tr><tr><td>&nbsp;ピューロマイシン&nbsp;&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td>組織培養</td></tr><tr><td>&nbsp;フィブロネクチン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>組織培養</td></tr><tr><td>CoolCell LX アルコールフリー速度制御細胞凍結ボックス</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td><td>組織培養</td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤&nbsp;</td><td>ロックタイト</td><td>ロックタイト No. 495</td><td>手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>プラスチック パラフィン フィルム&nbsp;</td><td>VWR</td><td>パラフィルム&reg;</td><td>手術と脳定位固定装置注射</td></tr><tr><td>ナノインジェクター</td><td>ドラモンド</td><td>3-000-204</td><td>手術と脳定位固定装置注射</td></tr><tr><td>ガラス電極</td><td>ドラモンド</td><td>3-000-203G</td><td>手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>ハンドヘルドドリル</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>ドリル用バリ</td><td>ファインサイエンティフィック</td><td>19007-05; 19007-07)</td><td>手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>滅菌浴</td><td>FST</td><td>18000-45、ホットビーズ滅菌器</td><td>手術および固定装置注射</td></tr>イ<tr><td>ソフルランチャンバー/マスク</td>ハイ<td>ランド医療機器</td><td>564-0427、HME 109イソフルラン気化器、O2流量計、ギャングバルブ付きテーブルトップ麻酔器; 564-0852、誘導チャンバー16X7X7.5cm</td><td>手術および脳定位注射</td></tr><tr><td>3Dスコープ、アーム</td><td>ツァイス</td><td></td><td>手術および脳定位注射</td></tr><tr><td>光ファイバー光</td><td></td><td></td><td>手術と脳定位固定装置注射</td></tr><tr><td>ベタジン&nbsp;</td><td></td><td></td><td>手術と定位固定装置注射</td></tr><tr><td>70%(v / v)イソプロピルアルコール</td><td></td><td></td><td>手術と定位注射</td></tr><tr><td>ポビドン-ヨウ素準備パッド</td><td>ダイナレックス</td><td>1108</td><td>手術と固定装置注射</td></tr><tr><td>NaCl 0.9%(注射、USP、918610)</td><td></td><td></td><td>手術と定位注射</td></tr><tr><td>シクロスポリン(注射、USP)</td><td></td><td></td><td>手術と脳定位固定剤注射</td></tr><tr><td>ブプレネックス(注射)ブプレノルフィン(0.03 &mu;g per g げっ歯類)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>手術と定位固定剤注射</td></tr>眼<tr><td>科用軟膏&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>Surgifoam</td><td>エチコン</td><td></td><td>手術と定位注射</td></tr><tr><td>グリップ歯科用セメント</td><td>Dentsply</td><td>#675571、675572</td><td>手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>Instant SuperGlue&nbsp;</td><td>NDindustries</td><td></td><td>の手術と脳定位固定剤注射</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>の手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C&B</td><td></td><td>手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>0号カバーガラス</td><td>フィッシャー</td><td></td><td>手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>脳定位固定器フレーム&nbsp;</td><td>Kopf</td><td></td><td>手術と定位固定装置注射</td></tr><tr><td>直腸プローブと加熱パッド</td><td>FHC</td><td>40-90-8D、DC温度コントローラー、40-90-2-06、6.5X9.5cm加熱パッド40-90-5D-02、直腸サーミスタプローブ</td><td>手術とイメージング用固定装置注射</td></tr><tr><td>光学ブレッドボード</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>手術と定位注射</td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>フィ</td><td>ッシャーS55667</td><td>手術と脳定位固定剤用注射</td></tr><tr><td>Kwik-Cast(シリコーンエラストマー)</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>の手術と脳定位固定剤注射</td></tr><tr><td>用縫合糸&nbsp;&nbsp;</td><td>エチコン</td><td>18''、1667、4-0</td><td>手術と脳定位固定装置注射</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>ファインサイエンティフィックツール</td><td>91500-09、15018-10</td><td>手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-30;#55、11295-51;グラフ、11050-10</td><td>手術と脳定位固定装置注射</td></tr><tr><td>学生 ハルステッド-蚊止血剤</td><td>ファイン サイエンティフィック ツール</td><td>91308-12</td><td>手術と定位注射</td></tr><tr><td>小血管焼灼器キット</td><td>ファイン サイエンティフィック ツール</td><td>18000-00</td><td>手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>ホットビーズ滅菌器 ファイン</td><td>サイエンティフィック ツール</td><td>18000-45</td><td>手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>シリコンマット付きインスツルメントケース</td><td>ファインサイエンティフィックツール</td><td>20311-21</td><td>手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>シリコンマット付きプラスチック滅菌容器</td><td>ファインサイエンティフィックツール</td><td>20810-01</td><td>手術と脳定位注射</td></tr><tr><td>in vivoイメージング用2P固定ステージ蛍光スコープ</td><td>オリンパス</td><td>FV1200 MPE</td><td>in vivoイメージング</td></tr><tr><td>多光子レーザー</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td>in vivo イメージング</td></tr><tr><td>グリーンレーザー</td><td>オリンパス</td><td>473 nm レーザー</td><td>in vivo イメージング</td></tr><tr><td>xy トランスレーショナルベース</td><td>Scientifica</td><td>MMBP</td><td>in vivo イメージング</td></tr><tr><td>FRETフィルターキューブ YFPおよびCFP用</td><td>オリンパス</td><td></td><td>in vivoイメージング</td></tr><tr><td>10倍および40倍水浸対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td></td><td>in vivo イメージング</td></tr><tr><td>エアテーブル</td><td>ニューポート</td><td></td><td>の生体内イメージング</td></tr><tr><td>カスタムビルドの軽量ケージ</td><td>Thorlab</td><td></td><td>生体内イメージング</td></tr></tbody></table>

神経伝達物質を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光エンジニア記者の建設（cnifers）<em&gt;インビボ</em

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

細胞ベースの神経伝達物質の蛍光は記者（CNiFERs）は、光学的に生体内で脳内の神経伝達物質の放出を検出するための神経科学者のための新しいツールを提供する設計さ。特定CNiFERは、ヒト胚性腎臓安定特定のGタンパク質共役型受容体を発現する細胞、G qを/ 11のGタンパク質に結合し、FRETベースのCa 2+ -detector、TN-XXLから作成されます。受容体の活性化は、FRETシグナルの増加をもたらします。 CNiFERクローンは、 例えば 、ドーパミンD2Rを特定の神経伝達物質のための天然受容体を使用しているためCNiFERsはnMの感度および秒の時間応答を持っています。 CNiFERs直接in vivoでの体積透過を測定するように最適未満、せいぜい100人ミクロンの空間分解能で神経伝達物質の放出を検出するためにそれらを可能にする、脳内に注入されます。 CNiFERsもViに潜在的な交差反応性のために他の薬剤をスクリーニングするために使用することができますVO。我々は最近、G、I / O Gタンパク質へのGPCRにそのカップルを含めるようにCNiFERsの家族を拡大しました。 CNiFERsは、アセチルコリン（AChの）、ドーパミン（DA）およびノルエピネフリン（NE）を検出するために利用可能です。任意のGPCRはCNiFER小説を作成するために使用することができることを考えると、ほぼヒトゲノム中の800のGPCRがあることを、我々は、設計実現、およびCNiFERのいずれかのタイプをテストするために、ここで一般的な手順について説明します。

特定のGタンパク質共役受容体（GPCR）と遺伝的にコードされた[Ca 2+]センサ、TN-XXL：CNiFERを安定少なくとも二つのタンパク質を発現するように操作されたヒト胚腎臓（HEK293）細胞から誘導されます。 TN-XXLは、Ca 2+イオン6,15に対応して、それぞれ、シアンおよび黄色蛍光タンパク質間の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を受けるのeCFPおよびシトリン。内因性G qをGタンパク質に、その夫婦のGPCRの活性化は、の[Ca 2+] PLC / IP 3経路を介し、TNXXLのCa 2+検出器からのFRETの増加につながる（ 図1）細胞質ゾルの増加を誘発します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53290...

私たちは、体積、神経伝達物質の放出を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光工学レポーター（CNiFERs）を作成するためのプロトコルを提示します。

神経伝達物質を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光エンジニア記者の建設（CNiFERs）<em&gt;インビボ</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

このビデオの目的は、生体内で特定の神経伝達物質の放出を光学的にモニタリングするために使用できる、細胞ベースの神経伝達物質蛍光レポーター（CNiFERs）の構築および検証の手法について説明することです。この手法は、脳内におけるニューロモジュレーターの放出タイミングと放出量に関する神経科学の重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、GPCSを介してシグナル伝達を行うあらゆる種類の神経伝達物質またはニューロモジュレーターに適応させることができる点にあります。この手法を局所的に実証することは有用です。in vivoへの注入およびその後のCNiFERsのイメージングは技術的に困難です。この手順を開始する前に、T-25フラスコ内で前端ベースのカルシウム検出器とキメラGタンパク質を含むHEK293細胞を確認してください。次に、細胞を37°C、5% CO2の加湿インキュベーター内で、コンフルエンシーが約50%になるまで培養します。その後、T-25フラスコから培地を吸引除去します。2 mLのレンチウイルス培地混合液を加え、T-25フラスコを37°C、5% CO2でインキュベートします。翌日、1 mLのトリプシンを添加して、感染させたHEK293細胞を回収します。次に、細胞ペレットを5 mLのHEK293増殖培地で再懸濁します。凍結保存用に細胞懸濁液1 mLをT-75フラスコに、FACS解析用に1.5 mLをT-25フラスコに播種します。10点のアゴニスト曲線を用いて感染細胞を試験する場合、フィブロネクチンでコーティングした96ウェルプレートの上位2列に、細胞懸濁液を1ウェルあたり100 microlitersずつ播種します。次に、T-25フラスコ、T-75フラスコ、および96ウェルプレートで培養しているHEK293細胞を、37 degrees Celsius、5%CO2の条件下で1〜2日間、約90%コンフルエントになるまでインキュベートします。FACS解析の前に、予測されるEC 50を挟む10種類の異なるアゴニスト濃度で薬剤プレートを作成し、GPCRの機能的発現を判定します。連続希釈法を用いて異なる濃度のアゴニストを調製し、薬剤濃度を管理するためのテンプレートを作成します。次に、プレートリーダーの温度を37°Cに設定します。その後、FRETの測定および溶液の転送を行うために、96ウェル蛍光プレートリーダーをプログラムします。遺伝子符号化FRETベースのカルシウムセンサーであるTNXXLを用いてFRETを測定する場合、励起波長を436 ± 4.5 nmに設定します。次に、ECFPおよびcitrine用のエミッションフィルターとカットオフフィルターを設定します。続いて、プレートリーダーをプログラムし、4秒ごとにエミッションを測定し、合計180秒間測定を行います。100 µLのプレート容量、150 µLピペットの高さ、および3連化合物プレートからの50 µLの薬剤分注を選択します。薬剤分注のタイムポイントを30秒に設定します。その後、行AおよびBから培地を吸引し、約90%コンフルエントな96ウェルスニッファープレートに100 µLのACSFを加えます。次に、3倍希釈した薬剤プレートと96ウェル・スニッファープレートをプレートリーダーにロードします。プログラムを開始する前に、プレートを37 °Cで30分間平衡化させます。プレートリーダーでの測定後、蛍光リーダーの値をテキストファイルにエクスポートします。次に、このファイルを、蛍光強度を刺激前のベースラインで正規化し、各アゴニスト濃度におけるピークFRET比を算出し、用量反応曲線を生成する、事前に作成したスプレッドシートテンプレートにインポートします。垂直電極引き出し機にガラスキャピラリーをセットして、CNiFER注入用ピペットを準備します。ピンセットを使用して、電極の先端を直径約40 µmになるまで折ります。麻酔をかけたマウスの、あらかじめ作成した2×3 mmの薄い頭蓋窓の上に、ACSFを浸したスポンジを置き、細胞の注入準備を行う間、湿った状態を維持します。次に、T-75フラスコでコンフルエンシー約80%まで培養したCNiFERクローンを回収します。培地を吸引し、細胞を滅菌PBSで洗浄します。PBSを除去し、10 mLのACFSを用いてフラスコの底から細胞を剥離させます。次に、トリチュレーションを行い、細胞の凝集を解消します。細胞培養用遠心機で2分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを100 µLのACSFで再懸濁します。続いて、1400 ×gで30秒間遠心分離し、上清を除去して、ACSFに覆われたペレットを残します。その後、注入用ピペットにミネラルオイルを充填します。ピペットをナノインジェクターに装着します。マウス標本の近くのプラスチック製パラフィンフィルムの上に、CNiFER細胞懸濁液を5 µL滴下します。引き出したピペットにCNiFER細胞を吸い上げます。次に、ピペットを目的のxおよびy座標に移動させます。ピペットを下げ、あらかじめ準備しておいた薄層化した頭蓋骨を貫通させます。そのまま頭蓋骨表面から約200～400 µm下の皮質第2層および第3層まで進めます。ナノインジェクターを用いて、最も深い部位にCNiFER細胞を4.6 nanoliters注入します。オイルと細胞の界面における動きを確認してください。その後、細胞が分散するまで5分間待ちます。ピペットを約100 µm引き上げ、さらに4.6 nLのCNiFER細胞を注入し、再び5分間待機します。その後、CNiFERの逆流を防ぐため、ピペットをゆっくりと慎重に引き抜きます。この手順では、頭部を固定したマウスを搭載したイメージングプラットフォームを、二光子イメージング顕微鏡の10倍水浸対物レンズの下に配置します。505 nanometersのダイクロイックミラーを備え、ECFP測定用に460 nanometersから500 nanometers、citrine測定用に520 nanometersから560 nanometersのバンドパスフィルターを持つFRETイメージング用フィルターキューブを挿入します。次に、薄い頭蓋骨ウィンドウがあるウェルにACSFを加え、10x水浸対物レンズをACSF内まで下げます。接眼レンズを水銀ランプおよびGFPフィルターキューブと併用し、CNiFERsの位置を確認します。次に、40倍の水浸 objectives に切り替えます。続いて、2光子イメージングに適した光路を選択してください。近赤外フェムト秒パルスレーザーをオンにします。波長を820 nmに、出力設定を5～15%に選択します。PMT 1およびPMT 2の電圧を、PMTに応じて通常500～1000 Vの最大値未満に設定します。次に、各チャネルのゲインを1に設定し、対物レンズのZ位置をゼロにします。対物レンズを皮質表面から約100～200 µmまで下げ、XYスキャンを開始します。CNiFERの蛍光のSN比を最適化するために、各チャネルのレーザー出力、ゲイン、およびPMT電圧を調整します。次に、ソフトウェアを使用して、CNiFER細胞を含む領域とバックグラウンド領域にイメージング範囲を限定します。適切なSN比を得るために、cowman lineを選択し、2回で平均化し、走査速度を3〜1 Hz、1ピクセルあたり4 µsに設定して使用します。その後、CNiFER細胞の周囲にROI（関心領域）を設定します。1平面につき約3〜4個の細胞を囲むように設定してください。ROIの平均強度のリアルタイム解析をセットアップします。次に、CNiFERの蛍光の時間経過をモニタリングするためにデータ収集を開始し、fretをモニタリングしながら電気刺激または行動実験を開始します。この例では、溶液供給システムを備えたプレートリーダーを用いてD2R CNiFERのfret応答を測定しました。このグラフは、D2 CNiFERにドーパミンを投与した際のfret応答を示しています。ドパミンによってECFPの放出が減少し、一方でcitrineの放出が増加することに注意してください。そして、こちらが対応するFRET比のプロットです。ここに示されているのは、ドパミンおよびノルエピネフリンに対するD2 CNiFERsの応答の線量反応曲線です。さらに、D2Rを欠くレスポンシブコントロールCNiFERsについても提示します。この棒グラフは、他の神経伝達物質およびモジュレーターを50 nano molarおよび1 micro molarで投与した際のFRET比の応答を示しています。ここでは、黒質にあるDAニューロンへの電気刺激により、D2 CNiFERsのFRET比に大きな変化が生じることが分かります。電気刺激の強さが増すにつれて、応答の振幅が増大することに注目してください。刺激をコカイン注入と組み合わせることで、CNiFERの応答が増強されます。このビデオを視聴することで、in vivoイメージングのためのCNiFERの作製、試験、および使用方法について十分に理解できるはずです。CNiFERsの作製過程を通じて、最終的にこれらの細胞を生体マウスに移植するため、無菌操作を維持することが不可欠です。CNiFERsの実現は、Gタンパク質共役受容体を介してシグナルを伝達するあらゆる神経伝達物質または神経修飾物質の放出を光学的に測定するための、神経科学分野の研究における重要なツールとなります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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神経伝達物質を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光エンジニア記者の建設（CNiFERs）

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