飼育第1の給電ゼブラフィッシュの完全および更新された「ワムシPolyculture方法」
2016年1月17日
幼虫のゼブラフィッシュは動物プランクトンを食べるのに適応しています。実験室でこの自然の特徴を利用するには、最初に餌となる魚を生きた海水ワムシと同じシステムで一緒に育てることが可能です。 この「ポリカルチャー」戦略は、幼虫への労働と妨害を最小限に抑えながら、高い成長と生存を促進します。
ワムシ多養殖法の全体的な目標は、塩水ワムシの自然な生産性と生物学的特性を利用して、急速な成長を促進し、最初に餌を食べる幼生のゼブラフィッシュの生存率を最大限に高める環境を作り出すことです。この技術の主な利点は、研究実験で使用するために多数のゼブラフィッシュの幼生をうまく飼育するために必要な時間とスペースを大幅に減らすことができることです。ワムシの培養メンテナンスを開始するには、飼料培養容器(FCV)を容量の90%まで満たし、水槽用塩1リットルあたり10グラムの清潔な脱塩素淡水
を供給します。水が完全に混合され、すべての塩が完全に溶解していることを確認してください。次に、容器への空気の流れをセットして、ローリングボイルを維持します。屈折計で液体の塩分濃度を測定します。
次に、培養容器またはCVでワムシをサンプリングします。次に、培養物の異なる部分からトランスファーピペットを使用して3つの2〜3ミリリットルのサンプルを採取し、サンプルをチューブに結合します。結合したサンプルの1〜2ミリリットルをペトリ皿に移します。
解剖顕微鏡でサンプルを可視化し、培養物の品質を確認します。100マイクロリットルの50%ルゴールヨウ素溶液をサンプルに加えて、ワムシを固定し、カウントします。すぐにプラスチックピペットで2ミリリットルのサブサンプルを採取し、1ミリリットルをセッジウィックラフターカウントスライドに分注します。
解剖顕微鏡を使用して、無傷のワムシ100匹まで、ワムシに付着した卵の総数をカウントするために必要なだけスライド領域をカウントします。次に、後で使用するためにミリリットルあたりのワムシの数を計算します。エア供給とフロスフィルターを取り外して収穫を開始します。
CVの下部にあるバルブをゆっくりと開き、水が53ミクロンのメッシュスクリーンを備えたプランクトンコレクターに穏やかに流れるのを待ちます。コレクターの底から流れ出る水は、バケツにろ過するか排水した後に集めます。次に、きれいな塩水1リットルあたり10〜15グラムをボトルに入れます。
FCVの上でスクリーンを反転させ、ワムシを穏やかな塩水の流れでFCVに洗います。プログラム可能な計量タイマーまたはPMTを開始して、FCVにフィードを配信します。次に、CVの内側全体を清潔なスクラブパッドでこすります。
5ガロンのバケツに1リットルあたり15グラムの混合物を新たに作成して、収穫時に失われた水の量を置き換えます。混合物が完全に溶解するまで、溶液を激しく攪拌します。次に、フロスフィルターを高圧スプレーですすいでください。
フロスフィルターに破片がなくなったら、CVに戻します.CVに供給される藻類の供給速度を調整するには、各投与イベントの期間を変更します。24時間後、このプロセスを繰り返し、FCVに残っているワムシの収穫を開始します。ワムシを2リットルの新鮮できれいな脱塩素水に濃縮し、塩1リットルあたり5グラムを入れます。
これらは、バックアップ供給として摂氏4度で保存することも、このプロトコルに記載されているものを超えて後の段階の魚を養うために使用することもできます。産卵イベントからゼブラフィッシュの胚を集めるには、産卵した胚を茶漉し器に注ぎます。次に、ウォッシュボトルから滅菌魚水でペトリ皿にやさしくすすぎます。
すべての胚が収集されたら、それらを孵化させます。孵化した幼虫の90%以上が水柱で活発に泳いでいるときに、多養殖段階を開始します。500ミリリットルのワムシ培養物をFCVから直接3.5リットルの保育園タンクに加えます。
次に、1つのシャーレから幼虫を保育園のタンクにそっと注ぎます。幼虫が皿に残っていないことを確認してください。専用の水源からタンクに500ミリリットルの清潔で調整された魚の水を加えて、最終容量を1リットル、最終塩分濃度を1リットルあたり5グラムにします。
少なくとも1日1回はポリカルチャータンクを観察して、ワムシと魚が存在し、成長していることを確認します。ワムシが水柱全体に見えることを確認します。魚が水柱の中にも見えていること、そしてワムシの間を泳いでいることを確認してください。
各水槽の状態を毎日評価して、すべての魚の幼虫が利用できるワムシと一緒に生きていて泳いでいることを確認することが重要です。ワムシや魚が成長しているという保険がかかったら、タンクを通る通常の水の流れを開始します。最後に、ドレンポートにスクリーンを取り付けて、幼虫がタンクから洗い流されないようにします。
ワムシ培養の典型的な性能を30日間にわたってモニタリングしたところ、平均培養密度は1ミリリットルあたり932匹でした。そしてミリリットルあたり最大1, 330個のワムシ。ゼブラフィッシュがいる多品種培養水槽のワムシの個体数の平均密度は、1ミリリットルあたり589.4匹です。
ミリリットルあたり481本のワムシの最小値は、以前に発表された研究よりも10倍優れています。ゼブラフィッシュは、平均全長3.9ミリメートルから5.4ミリメートルまで、5日間にわたって毎日着実な成長を示しました。このビデオを見れば、最初に餌をやるゼブラフィッシュの栄養要求を満たすために考案された多種培養システムで使用するワムシの培養方法についてよく理解できるはずです。
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概要
ロティファー共培養法は、海水ロティファーを用いて、初給餌期のゼブラフィッシュ稚魚の成長と生存率を向上させる手法です。この技術により、研究目的で大量のゼブラフィッシュ稚魚を飼育するために必要なリソースを大幅に削減することができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 養殖技術
背景
- ゼブラフィッシュの幼魚は、自然界では動物プランクトンを餌としています。
- 生きた海水性ロティファーを利用することで、幼魚の成長を促進させることができます。
- この方法は、飼育中の労力とストレスを最小限に抑えることができます。
- 効率的な飼育は、研究への応用において極めて重要です。
研究目的
- ゼブラフィッシュ稚魚の急速な成長を促進すること。
- 初 feeding 期の稚魚の生存率を最大化すること。
- 研究目的の飼育プロセスを効率化すること。
使用された手法
- フィードアウト方式の培養容器を用いた輪形動物の培養維持。
- 水槽用塩を加えた、浄化済み脱塩素水の調製。
- 培養容器内でローリングボイル（激しい対流）を維持するための空気流量の設定。
- 屈折計を用いた、最適条件のための塩分濃度の測定。
主な結果
- この手法により、仔魚の飼育に必要な時間と空間を大幅に削減できます。
- ゼブラフィッシュ仔魚の高い成長率と生存率が観察されました。
- 多種混養により、効率的な資源利用が達成されました。
結論
- ロティファー混合培養法は、ゼブラフィッシュ幼魚の飼育に有効である。
- この手法は、さまざまな研究用途に有益であると考えられる。
- 今後の研究では、本手法のさらなる最適化が検討される可能性がある。
よくある質問
産業界における重要性
初Feeding期のゼブラフィッシュを効率的に飼育することは、バイオファーマのR&Dにおけるハイスループットなin vivoスクリーニングや初期段階のターゲット検証において極めて重要です。ロティファー混合培養法（Rotifer Polyculture Method）を用いることで、健康なゼブラフィッシュ幼魚をスケールアップ可能かつ再現性高く生産でき、創薬および前臨床ワークフローに向けた堅牢なモデルシステムの展開を支援します。この手法はリソースの制約を軽減し、疾患関連システムとしてゼブラフィッシュを利用するポートフォリオプログラム全体の実験的信頼性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 仮説駆動型研究のために、ゼブラフィッシュ稚魚の大きなコホートを一貫して生成することを可能にする。
- モデル生物における高い生存率と成長率を確保することで、機能的ターゲットの検証をサポートする。
- 生物学的ばらつきを低減し、早期スクリーニングにおける予測の信頼性を高める。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 表現型スクリーニングアッセイ用に、標準化された健康な幼虫の調製を容易にします。
- 栄養および環境的な混交要因を最小限に抑えることで、アッセイの再現性を向上させます。
- 化合物評価パイプラインにおけるスケールアップとプラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- ゼブラフィッシュにおける疾患モデリングおよびトランスレーショナルなバイオマーカー研究のための強固な基盤を提供します。
- モデルの整合性を維持することで、初期の発見から前臨床検証までの継続性を確保します。
- 信頼性の高いin vivoデータに基づいた、リスク調整後の進展決定を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期探索とリード化合物同定の接点として機能し、下流のスクリーニングやメカニズム研究に必要なゼブラフィッシュ稚魚を安定的に供給することを可能にします。
- 探索生物学：モデルの一貫性を確保することで、仮説検証および生物学的リスクの低減をサポートします。
- スクリーニング：試験条件の比較分析に適した、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 分析：統計的評価の従属変数として、増殖および生存の堅牢な測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：バイオマーカーおよび有効性研究において、疾患に関連するシステムの忠実度を維持します。
- エンタープライズ再利用：プログラム全体で繰り返し利用可能な、拡張性と標準化されたワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ゼブラフィッシュを用いた研究における予測の信頼性を高め、メカニズムに関する曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値： 飼育プロセスを効率化し、労力とリソースの必要量を削減します。
- 戦略的価値： 信頼性の高いin vivoデータの生成を支援し、go/no-go決定の質と資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整後の優先順位付けを可能にし、創薬および前臨床アセットの推進を促進します。
実施上の考慮事項
- 水圏モデルシステムの維持および生餌管理に関する専門的な技術知識が必要です。
- 制御された水質管理、塩分濃度のモニタリング、およびロットファー定量のための基本的な顕微鏡観察へのアクセスが必要です。
- 実験バッチ間の再現性を確保するため、チーム間での標準化が求められます。
- 他のモデルシステムに適応させる場合、種固有のニーズに合わせてプロトコルの最適化が必要になることがあります。
- 生きたロットファーの安定的な供給と、培養状態のモニタリングに依存します。
