正常マウスで70％肝切除後の血管と実質再生の可視化

正常なマウスにおける70%部分肝切除術後の血管および実質再生の視覚化。従来、肝臓の再生は、肝臓の重量と体積の増加を測定し、肝細胞の増殖速度を決定することによって評価されます。現在、マウスの血管肝臓再生に興味を持ち、血管の成長を可視化し、定量化したいと考えています。

これにより、血管再生のイメージングワークフローを確立します。このワークフローは、血管樹の対比、CTスキャンの取得、3D再構成、結果の画像の定量的および定性的な分析の4つのステップで構成されています。ワークフローは、血管ツリーを対比することから始まります。

まず、正常な肝臓または切除された肝臓を露出させ、次に、目的の血管系に応じて、重合シリコーン造影剤を門脈または肝静脈のいずれかに注入します。次に、摘出された肝臓をMicroCTでスキャンします。スキャン後、Imalyticsの前臨床ソフトウェアを使用して3D血管再建を行います。

結果の画像の技術的品質が十分であれば、HepaVisionを使用して3D再構成を実行できます。このプログラムは、肝胆道手術を計画するためにクリニックで使用されます。血管樹の3D視覚化に加えて、このプログラムでは、供給血管と排出血管に基づいて、肝臓の体積、総肝臓と各葉の視覚化と計算が可能になります。

再建後、計算技術の助けを借りて、特定の血管の長さや直径など、血管の成長を示す追加のパラメータを決定できます。これにより、血管の成長を定量的に記述することができます。一方、ホルマリン固定マイクロフィルサンプルは、連続切片に切断することができます。

シリアル切片は、ホールスライドスキャナーを使用して染色およびデジタル化できます。連続切片の硬質および弾性レジストレーションの後、門脈系と肝静脈系の両方の3D血管ツリーを再構築できます。将来的には、分子イベントの空間分布を探りたいと考えています。

肝臓の再生に関心のある分子イベントの一例は、肝細胞核における増殖マーカーKi-67の出現と、3D再構成された血管樹におけるその空間分布です。次に、マイクロフィル注入の方法について詳しく説明します。試薬の準備。

Microfilコンパウンドの混合物には、MV希釈剤、MVコンパウンド(この場合は青色MV-120)、硬化剤が必要です。ピペット、チューブ、ピペッターも必要です。1本の5ミリリットルチューブに2ミリリットルのMV-120を準備します。

次に、3ミリリットルのMV希釈剤を追加して希釈します。軽く振って混ぜます。ヘパリン生理食塩水の場合は、10ミリリットルの生理食塩水に1ミリリットルのヘパリンを加えます。.

手術台の準備。まず、顕微鏡が必要であり、次に、消耗品のセットが必要です。6-0シルクと6-0ポリプロピレン縫合糸、5ミリリットルと1ミリリットルの注射器、30ゲージと21ゲージの針、注射器とカテーテルを接続するための延長チューブ、針挿入付き26ゲージカテーテル、綿チップとガーゼ。

第三に、手術器具が必要です。マイクロ機器、クランプ、電気凝固器。第四に、灌流ポンプが必要です。

動物を準備します。マウスを麻酔導入チャンバーに入れ、2%イソフルランと毎分0.3ミリリットルの酸素でマウスに麻酔をかけます。麻酔をかけたマウスをテープを使用して手術台に固定し、2%イソフルランと毎分0.3ミリリットルの酸素を連続吸入します。

マイクロフィル注射、門脈系。皮膚層にはハサミを使用し、筋肉層には電気凝固装置を使用して腹部を横切開します。綿の先端を使用して腸を左側に移動し、生理食塩水に浸したガーゼで腸を覆います。

顕微鏡下で門脈を解剖します。6-0シルク縫合糸を、その分岐部から約1ミリメートルの距離で、余分な肝門脈の下に配置します。後で使用するためにゆるく結びます。

全身ヘパリン化のために陰茎静脈にヘパリン生理食塩水を注入します 5分間。このアニメーションでは、カテーテル挿入の手順を示します。まず、6-0シルク縫合糸を余分な肝門脈の下に置き、次に26ゲージのカテーテルを門脈に挿入し、クランプを使用して固定します。

カテーテルを固定し、脾臓静脈と腸間膜静脈からの血流を遮断するために、事前に配置された縫合糸を結紮します。ここでは、外科的処置を実演します。26ゲージのカテーテルを針で挿入します。

カテーテルをさらに挿入し、同時に針をゆっくりと引き出します。clを使用してカテーテルを固定しますamp.気泡を避けるために、カテーテルをヘパリン生理食塩水で完全に満たします。

延長チューブをカテーテルに接続し、しっかりと固定します。灌流ポンプをオンにします。ヘパリン生理食塩水灌流を毎分0.4ミリリットルの流量で開始します。

灌流直後の右葉が青白くなるのを観察します。生理食塩水を使用して肝臓をすすぎ、灌流手順全体を通して肝臓を湿らせます。麻酔下での灌流による放血によりマウスを安楽死させます。

肝臓全体が青白くなるまで、ヘパリン灌流を数分間続けます。Microfil灌流の前に、調製したMicrofilコンパウンドに0.1ミリリットルの硬化剤を添加して、重合手順を加速します。Microfilコンパウンドを5ミリリットルのシリンジと延長チューブに入れます。

以前と同じように、ヘパリン生理食塩水をカテーテルに注入して気泡を取り除きます。チューブをカテーテルに接続し、しっかりと固定します。Microfilの注入を毎分0.2ミリリットルの流量で約1〜2分間開始します。.

青い薬剤がゆっくりと門脈の枝に広がっていくのを観察します。赤い円で示されているように、青い血管構造が各肝葉の表面に現れたら、灌流を停止します。Microfil化合物の重合のために肝臓を少なくとも15分間放置します。

マイクロフィル注射、肝静脈系。この手順は、基本的に門脈系への注射と同じ手順に従います。6-0シルク縫合糸を、その分岐部から約1ミリメートルの距離にある余分な肝臓門脈の下に配置します。

次に、カテーテルを門脈に挿入し、クランプで固定します。下大静脈に別のカテーテルを挿入し、クランプで固定します。カテーテルを固定し、脾臓静脈と腸間膜静脈からの血流を遮断するために、事前に配置された縫合糸を結紮します。

肝臓の流出を阻止するために、下大静脈上部にクランプを装着します。腎静脈と下大静脈の遠位端の両方を含む、下大静脈の結紮枝。カテーテル1を介してヘパリン生理食塩水を使用して肝臓を洗い流します。

カテーテル2を介してMicrofil化合物で肝静脈系を灌流します。結果、マイクロCT再構成。マイクロCTスキャン後、Imalytics前臨床ソフトウェアを使用して3D血管再構成を取得しました。

門脈系と肝静脈系の両方における血管再生は、主要な血管構造の伸長と拡大、および小さな血管の分岐として現れました。術後2日目に、残存葉の血管樹が伸びた。術後 7 日目までに、同じ主門脈と肝静脈からの追加の小さな枝が見え始めました。

その結果、肝血管樹と従属する肝領域の3D色分けされた再構築。各肝葉は、HepaVisionによる色分けされた再構成後、3次元すべてで容易に視覚化されました。表に示されているように、ここに示すように、正常な肝臓の肝静脈系について、全肝臓と各葉の肝容積が決定されました。

結果、シリアルセクションと再構築。一方、ホルマリン固定Microfilサンプルは、連続切片化を行いました。染色されたシリアル切片は、ホールスライドスキャナーを使用してデジタル化され、両方のシステムの血管樹の再構築に使用されました。

これらは、硬質レジストレーションと弾性レジストレーションの前後のマウス肝臓シリアルセクションのスタックの断面です。コンピュータ登録後、門脈系と肝静脈系を1つの3Dモデルで再構築することができます。この手動および計算に時間がかかるステップには、さらに最適化が必要です。

次のステップ、すなわち血管樹に対する分子イベントの空間分布の可視化が現在開発中です。このステップは、対比された血管ツリーから得られるマイクロCT情報と組織学的情報の融合、または純粋に組織学的情報の3D視覚化として想定できます。この場合、マイクロCT情報は、要求の厳しい組織学に基づく3D再構成の品質管理として機能します。

達成されると、肝臓の再生をより適切に調査するためのツールが得られます。特に、血管再生に関する分子イベントの空間分布と肝実質