Name: マウスにおける肝部分切除後の再生肝細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学ぶマウス肝部分切除後の再生肝細胞単離法。密度勾配遠心を不要とし、脂質含有肝細胞を保持する最適化プロトコルで、肝再生研究における細胞回収率と生存率を向上させます。

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この研究は、スイス国立財団(プロジェクト助成金310030_189262)の支援を受けました。

<ol><li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li>
<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+from+myth+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li>
<li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 1 Suppl 81-88 (2015).</li>
<li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li>
<li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li>
<li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLizardo+Thiebaud%2C+MJ+%22Liver+Pathology%22">Liver Pathology</a>. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).</li>
<li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR Protocols. 1 (2), 100086(2020).</li>
<li>Smedsrød, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li>
<li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+a+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2%2B+on+enzymatic+dispersion+of+isolated%2C+perfused+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li>
<li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+down-regulation+promotes+%CE%B2-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li>
<li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).</li>
<li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+%28HABR%29+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877(2015).</li>
<li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li>
<li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2%2F3+partial+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li>
<li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li>
<li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li>
<li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li>
<li>Roche, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoche%2C++%22Liberase+TM+Research+Grade%22">Liberase TM Research Grade</a>. , (2020).</li>
<li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes%2C+which+inhibits+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li>
<li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li>
<li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li>
<li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+failure+following+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22HPB%22%5BJournal%5D)">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li>
<li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li>
<li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-sweetened+beverage%2C+diet+soda%2C+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years%3A+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenteroly+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li>
<li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma%3A+a+problem+of+growing+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li>
<li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+body+weight+and+metabolic+%28dysfunction%29-associated+fatty+liver+disease+%28MAFLD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Visceral+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li>
</ol>

著者は、競合する利益がないことを宣言します。

公開されたプロトコルは、FACSソーティング後の単一細胞下流分析または細胞のバルク分析のために、正常および脂肪性マウス肝細胞の高収率を単離するための信頼性が高く簡単な方法を提供します。密度勾配精製に対する明確な利点は、細胞脂質含有量が肝細胞の有効収量に本質的に影響を与えないことです。したがって、脂肪性肝細胞の割合は保持され、下流の分析に含まれます。これは、脂肪原性肝疾患の研究にとって重要であるだけでなく、肝細胞が再生の最初の2〜3日以内に時間的および空間的に動的な脂肪症を示す主要な肝切除後のプロセスの分析にとっても最も重要です。単離された肝細胞の(単一細胞)分析は、肝切除術19,20,21後にすでに実施されているが、分析された細胞集団は、少なくとも部分的に、脂質を含んだ肝細胞を奪われており、したがって、結果は完全に代表的ではなく、痩せた肝細胞に偏っていたと仮定しなければならない。
現在、TRASの...

肝臓は、大きな組織喪失の後でもそれ自体を再生することができます。このユニークな再生能力は、1931年にヒギンズとアンダーソンによってラットで最初に記述された部分的(70%)肝切除術の実験モデルによって明示的に示されています1。このモデルでは、肝臓の70%が、より大きな肝葉を切り取ることによって動物から外科的に除去されます。その後、残りの葉は代償性肥大によって成長し、元の肝臓構造の回復はありませんが、手術後約1週間以内に元の肝塊を回復します2,3。肝臓の残骸が小さすぎて回復できない86%拡張肝切除術など、さまざまな量の組織除去を伴う追加の肝切除術が開発されており、最終的には肝切除後肝不全(PHLF)とその後の動物の30%〜50%で死亡します4,5,6。これらのモデルは、切除された組織の量に応じて、正常な肝再生と失敗した肝再生の研究を可能にします(図1)。
肝切除術のマウスモデルは長年にわたって成功裏に使用されてきましたが、最近になってようやく、より高度な分析方法が可能になり、単一細胞レベルでより深い洞察が可能になりました。しかしながら、これらの方法のほとんどにおいて、個々の肝細胞の存在は基本的な前提条件である。初代肝細胞の単離のためのほとんどのプロトコルは、2段階のコラゲナーゼ灌流技術とそれに続く密度勾配精製に基づいており、生存肝細胞を破片や非実質細胞、および死細胞から分離します7、8、9。この方法は、1969年にBerry and Friendによって最初に記述され10、1972年にSeglenらによって適応されました11,12。ただし、グラジエント遠心分離は細胞の密度とサイズに依存するため、脂質を含んだ肝細胞は標準的な精製中に失われることがよくあります。このような喪失は多くの研究課題にとって無視できるかもしれませんが、それは初期の肝再生にとって重要な側面です。最初の2日間で、再生マウス肝臓内の肝細胞は脂質を蓄積し、それによってサイズが大きくなり、密度が低下します。この一過性再生関連脂肪症(TRAS)は、再生燃料を提供するのに役立ち、一時的ですが、主要な増殖期と部分的に重なり、肝臓の機能単位である肝小葉内に不均一に分布しています13,14。しかし、延長された86%肝切除術の後、再生が停滞し、脂質が酸化されていないため、TRASも発生しますが、持続します14。したがって、70%または86%の肝切除後の肝細胞の勾配精製は、ほとんどの脂質を含む肝細胞が低密度のために失われるため、非代表的な画分を生成します15。
この修正された分離プロトコルでは、C57BL / 6マウスからの肝細胞は、肝切除術の24〜48時間後に、古典的な2段階のコラゲナーゼ灌流アプローチによって分離されます。通常、細胞単離のための残骸のカニュレーションおよび灌流は門脈 を介して 行われる。しかし、大切除後に残った小さな残骸では門脈血管抵抗が高く16、灌流は繊細です。大静脈は肝切除の影響を受けないため、大静脈のカニューレ挿入 を介して 逆行方向に灌流を容易に行うことができます。標準的な蠕動ポンプは、門脈からの流出を伴う逆行性灌流を使用して、カテーテル挿入された下大静脈 を介して 加温された溶液を肝臓の残骸に駆動します(補足図S1)。肝細胞はコラゲナーゼによって解離され、グリソンカプセルから放出されます。低速遠心分離アプローチを使用した段階的単離による生存肝細胞の洗浄と慎重な処理の後、肝細胞はあらゆる下流の分析に使用できます。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Zombie green</td><td>BioLegend</td><td>423111</td><td>Amine-reactive viability dye</td></tr><tr><td>Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%</td><td>Provet AG</td><td>QN01AB06</td><td>注意:換気が必要</td></tr><tr><td>EDTA溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008-100ML-Ethanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V001229</td><td>水で 70% に希釈します</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清 (FCS)</td><td>Gibco</td> <td>A5256701-Hanks</td><td></td></tr> <tr><td>平衡塩溶液 (HBSS)、Ca2+、Mg2+、フェノールレッド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9269-6x600ML</td><td>消化/保存用</td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液 (HBSS)、Ca2+、 w/o Mg2+、フェノールレッドなし</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6x500ML</td><td>灌流緩衝液用</td></tr><tr><td>HEPES溶液、1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-100ML-F-Histoacryl</td><td></td></tr> <tr><td>組織接着剤 (ブチル-2-シアノアクリレート)</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td>カニューレ挿入部位の安定化用</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 染色染料溶液</td><td>Abcam</td><td>ab228550</td><td>-</td></tr><tr><td>リベラーゼ研究用グレード</td><td>ロシュ</td><td>5401119001</td><td>凍結乾燥コラゲナーゼ I/II</td></tr><tr><td>NaCl 0.9% 500 mL エコテイナー</td><td>B. Braun</td><td>123-Paralube</td><td></td></tr> <tr><td>Vet 軟膏</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td>-</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>A1286301-Sudan IV &ndash;脂質染色</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>V001423-Temgesic (ブプレノルフィン塩酸塩)、注射液 0.3 mg/mL</td><td>Indivior Europe Ltd.</td><td>345928</td><td>麻薬。安全に保管してください。</td></tr><tr><td>トリパンブルー、0.4%、滅菌ろ過された</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Williamsの細胞計数用</td></tr><tr><td>ミディアム E</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>W4128-500ML-</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>材料</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清ピペット、Greiner Cellstar</td><td>Merck</td><td>P7865-50</td><td></td></tr> <tr><td>mL ファルコン チューブ</td><td>TPP-BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ネオフロン、Pro IV カテーテル 26 G</td><td>BD ファルコン</td><td>391349</td><td></td></tr><tr><td>-セル スクレーパー、回転ブレード幅 25 mm</td><td>TPP</td><td>99004-Falcon</td><td></td></tr> <tr><td>Cell Strainer 100 & マイクロ;m ナイロン</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>-</td></tr><tr><td>穴あき滅菌外科用ドレープ</td><td>-</td><td>-</td><td>再利用可能な布素材</td></tr><tr><td>サイズ 16# チューブ用充填ノズル (内径 3.1 mm)</td><td>Drifton</td><td>FILLINGNOZZLE#16</td> チューブ<td>内に入るには</td></tr><tr><td>フローサイトメトリーチューブ、5 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352008</td><td>-</td></tr><tr><td>オス ルアー to バーブ、チューブ内径 3.2 mm</td><td>Drifton</td><td>LM41</td><td>接続チューブシリンジへ</td></tr><tr><td>ペトリ皿、96 x 21 mm</td><td>TPP</td><td>93100-Prolene</td><td></td></tr> <tr><td>5-0</td><td>Ethicon</td><td>8614H</td><td>胸骨を引っ込める</td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Ethicon</td><td>8695H</td><td>皮膚縫合用</td></tr><tr><td>Prolene 8-0</td><td>Ethicon</td><td>EH7470E</td><td>結紮胆嚢</td></tr>チューブ <tr><td>16#、WT 1.6 mm、ID 3.2 mm、OD 6.4 mm</td><td>ドリフトン</td><td>SC0374T</td><td>灌流チューブ</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer</td><td>BD</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Isisげっ歯類のシェー</td>バーAesculap <td></td><td>GT421-Isofluran</td><td></td></tr> <tr><td>station</td><td>Provet</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-低速遠心分離機&ndash;Scanspeed 416</td><td>Labogene</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>ノイバウアー改良計数室</td><td>マリエンフェルト</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>酸素濃縮器 &ndash;EverFlo</td>フィ<td>リップス&nbsp;</td><td>1020007</td><td>0 &ndash; 5 L/min</td></tr><tr><td>Pipetboy &ndash;ピペッターターボ固定</td><td>TPP</td><td>94700</td><td>-</td></tr><tr><td>深セン灌流ポンプ&ndash;YZ1515x</td><td>シェンチェン</td><td>YZ1515x</td><td>-</td></tr><tr><td>手術用顕微鏡&ndash;SZX9</td><td>Olympus</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>ThermoLux温暖マット</td><td>Thermo Lux</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Vortex Genie 2、2700 UpM</td><td>NeoLab</td><td>7-0092</td> <td>-</td></tr> <tr><td>ウォーターバス&ndash;Precision GP 02</td><td>Thermo</td> <td>scientific-42</td><td>°に調整します。ハ</td></tr></tbody></table>

マウスにおける肝部分切除後の再生肝細胞の単離

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

部分肝切除術は、マウスの肝再生を調べるために広く使用されていますが、下流の単一細胞アプリケーションのために生存可能な肝細胞の高収率の単離は困難です。再生肝細胞内の脂質の顕著な蓄積は、マウスの正常な肝臓再生の最初の2日間に観察されます。.このいわゆる一過性再生関連脂肪症(TRAS)は一時的なものですが、主要な増殖期と部分的に重複しています。密度勾配精製は、初代肝細胞を単離するための既存のほとんどのプロトコルのバックボーンです。グラジエント精製は細胞の密度とサイズに依存するため、非脂肪性肝細胞集団と脂肪性肝細胞集団を分離します。したがって、脂肪性肝細胞はしばしば失われ、非代表的な肝細胞画分を生じる。 
提示されたプロトコルは、脂質含量に関係なく、再生肝細胞の in vivo 単離のための簡単で信頼性の高い方法を記載しています。雄のC57BL / 6マウスからの肝細胞は、肝切除術の24〜48時間後に、古典的な2段階のコラゲナーゼ灌流アプローチによって単離されます。標準的な蠕動ポンプは、門脈からの流出を伴う逆行性灌流技術を使用して、カテーテル挿入された下大静脈 を介して 温められた溶液を残骸に駆動します。肝細胞は、グリッソンカプセルからの放出のためにコラゲナーゼによって解離されます。洗浄と慎重な遠心分離の後、肝細胞はあらゆる下流の分析に使用できます。結論として、この論文は、マウスの部分肝切除後の再生肝細胞の代表的な集団を単離するための簡単で再現性のある技術について説明しています。この方法は、脂肪肝疾患の研究にも役立つ可能性があります。

TRASは肝切除後16時間でピークに達し、標準的な肝切除術後32〜48時間で徐々に消失しますが、拡張肝切除術後48時間を超えて持続します。肉眼的には、TRASは肝臓の残骸の淡い顔色として容易に見え(図1F)、手術後16時間から48時間の間に肝切除マウスで観察できます。
推定最終収量は、マウスの70%肝切除後の10〜15×106 肝細胞および拡張86%肝切除後の4〜9 × 106 であり、平均最終生存率はそれぞれ78%および65%である。これは、マウス肝臓全体からの50〜70×106 の総収量と比較して予想されるパーセンテージに対応します(図6A、C)。部分肝切除後、肝細胞は正常な肝臓と比較して細胞サイズの増加を示し、脂質含有量の増加に対応します(図6B)。ゲーティング戦略を 補足図S4</s...

脂質を含んだ肝細胞は肝臓の再生に固有のものですが、通常は密度勾配遠心分離で失われます。ここでは、脂肪肝細胞を保持する最適化された細胞分離プロトコルを提示し、マウスの部分肝切除後に再生肝細胞の代表的な集団を生み出します。

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

このプロトコルの全体的な目標は、密度勾配遠心分離を必要とせずに、部分肝切除後のマウスにおける肝細胞単離のための最適化された方法を提示することです。通常、初期の再生中に脂質を含んだ肝細胞の大部分が見られます。低密度のために密度勾配遠心分離で通常失われるこれらの脂肪肝細胞は、このプロトコルで保持されます。灌流装置を準備するには、ルアーロックコネクタを使用して、26ゲージのIUIカニューレをチューブの出口端に接続します。次に、チューブを洗い流し、チューブの入口端を水浴中の予熱した灌流バッファーチューブに挿入します。毎分3ミリリットルのポンプ速度で温かい灌流バッファーでプライミングします。手術を進める前に、マウスが適切に麻酔されていることを確認してください。次に、外科用スクラブ溶液と70%エタノールで腹部を洗浄します。次に、縫合糸を切断して、以前に部分肝切除のために行った正中線切開を再度開き、傷の端をそっと引き離します。肝切除術が24〜48時間以上経過している場合は、縫合糸を取り除き、ハサミまたはメスで皮膚を切ります。リトラクターまたは単純なクリップを使用して、腹部を開いたままにします。腹腔は、アクセスと視覚化を最適化するために、できるだけ露出させる必要があります。5-0ポリプロピレン縫合糸を胸骨に固定します。頭蓋骨に引っ張って、この位置に固定します。滅菌綿棒を使用して腸を右に動かし、門脈と大静脈を明らかにします。腸を保持するために濡れた布を使用してください。マウスの後ろ足に隣接する金属製のウェイトリングなど、高さ約2センチの重いものを置きます。次に、接続された26ゲージIUIカニューレを備えたチューブをオブジェクトに置き、針を大静脈の上に慎重に配置します。必要に応じてチューブの長さを調整します。コラゲナーゼストック溶液を、予め温めた消化バッファーチューブに移します。動物あたり10〜20ミリリットルの消化バッファーを準備します。ポンプ速度を毎分3ミリリットルに調整した後、ポンプをオンにします。バッファーが針に到達したら、事前に温めた灌流バッファーの最初の2〜3ミリリットルを廃棄します。下大静脈のカニューレ挿入を行うには、滅菌綿棒を使用して大静脈を穿刺の尾側にそっと引っ張り、提供された張力が静脈へのカニューレの挿入を容易にします。バッファーが針を通している間、26ゲージのIUIカニューレを腎臓の下の下大静脈に浅い角度で挿入します。針の斜角が上を向いていることを確認します。針が内腔に入ったときにカテーテルのフラッシュチャンバーで血液を探します。針をさらに2〜3ミリメートル進めて、カテーテルの先端が静脈に入るようにします。プラスチックカテーテルを針の上から大静脈にさらに5ミリメートルスライドさせます。針をゆっくりと慎重に取り外します。2〜3秒後、灌流バッファーが肝臓を流れ、中心静脈から肝小葉に入っていることを示す、肝臓に形成される白い斑点または門脈の腫れを探します。肝臓表面に白い斑点が形成されてから1〜2秒以内に門脈が目に見えて腫れるのを待ちます。肝門炎からできるだけ遠位にハサミで門脈を切ります。動物の体重、肝臓の大きさ、および最初の肝切除の程度に応じて、流量を毎分4〜7ミリリットルに増やします。ピンセットまたは血管クランプで門脈を7〜10秒間クランプします。液体が通過していないことを確認してください。約30秒後に2回目のクランプを実行し、肝臓が腫れて弛緩することを確認します。動物を3〜4分間洗い流し続け、門脈から流れ出る透明な緩衝液を観察します。消化バッファーが肝臓に到達する前に、門脈を3〜4秒間クランプします。clの解放時に肝臓が弛緩することを確認してくださいamp そして灌流液は透明なままです。消化バッファーが肝臓に到達したら、門脈をもう一度クランプします。クランプを解除した後、肝臓はリラックスしてはいけません。毎分5ミリリットルの流量で約4分間消化します。消化が進むにつれて、肝臓が腫れ始め、肝臓の表面に小さな透明な部分の兆候を探します。肝臓が濡れた布の質感を帯び、ほとんどねっとりしているように見えることを確認します。湿らせた滅菌綿棒で慎重に触れて、粘稠度を調べます。肝臓の表面の質感に顕著な違いが観察されるまで灌流を続けます。肝臓が非常に明るい色と、実質から分離しているグリソンカプセルを示す泡立つ外観を想定していることに注意してください。肝臓がこれらの特性を獲得したらすぐに消化を止めてください。空気が肝臓に入る前に針を外します。鉗子を使用して葉の間の中央結合組織をつかみ、アンカーポイントとして使用してわずかに上に持ち上げます。肝臓と他の臓器の接続をすべて切断し、胆嚢を取り除きます。肝臓を腹腔からそっと取り除きます。この段階では薄っぺらで壊れやすいので注意してください。肝臓を氷冷保存バッファーに入れます。肝臓を10センチのペトリ皿に移し、10ミリリットルの氷冷を加えたウィリアムズミディアムE.肝臓表面に沿っていくつかの場所で細い先端ピンセットでグリソンのカプセルを破裂させます。2対のピンセットで中央部分をつかみます。それらをゆっくりと引き離し、肝細胞を損傷することなくカプセルを引き裂き、カプセルを静かに振って細胞を放出する。5ミリリットルの肝臓パルプを100マイクロメートルのセルストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにろ過します。フィルターを10ミリリットルの新鮮な氷冷培地ですすぎ、残りの5ミリリットルのパルプをセルストレーナーでろ過します。抽出物を摂氏4度で5分間50 gで回転させます。上清の大部分を吸引し、チューブを穏やかに旋回させて細胞を再懸濁するために1ミリリットルを残す。40ミリリットルの冷たいウィリアムズEミディアムを追加し、手順を3回繰り返します。本文に記載されているように肝細胞の単離を進めます。マウスの70%肝切除術後、最終的な肝細胞収量は約10〜15 x 10〜6番目で、最終生存率は78%でした。.延長86%肝切除後、肝細胞収量は4〜9 x 10〜6番目で、平均生存率は65%でした。部分肝切除後、肝細胞は、脂質含有量の増加に対応する正常な肝臓と比較して細胞サイズの増加を示す。部分肝切除術の24時間後にマウス肝細胞で脂質含量の増加が観察され、粒状性の増加として見られるか、肥大した肝細胞内の脂質小胞の存在によって直接観察されました。従来の密度勾配精製法を使用している間、大きな脂肪肝細胞は上清で失われ、小さな希薄肝細胞のみが細胞ペレットに集められました。改善されたプロトコルにより、脂質で満たされた肝細胞は失われず、すべての肝細胞がペレット化されました。繰り返しクランプすることで、フラッシングプロセスが容易になります。これにより、消化酵素を阻害する可能性のある残りの血液成分から肝臓が最適に除去されます。

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