Name: コマーシャルからの副産物としてアルケノンの単離とバイオディーゼル生産のための実験プロトコールイソクリシス藻類バイオマス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶ、Isochrysis藻類バイオマスからのバイオディーゼル生産とアルケノン単離の実験プロトコール。ソックスレー抽出とトランスエステル化反応を用い、90%以上の高収率でバイオディーゼルを得る持続可能な手法です。

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この作品は、国立科学財団（CHE-1151492）によってサポートされていました、北西高度な再生可能エネルギー同盟（J.ウィルソン-ペルチェへフェローシップ）、およびWHOIの友人から民間の寄付を通じ。私たちは、優れた技術支援のためのケビンR. SteidleyとキムAscherl（USDA / ARS / NCAUR）をお願いいたします。

1.微細藻類とバイオマスの準備注：海洋微細藻類のイソクリシスSPを。本研究で使用される「T-イソ」は購入することができます（材料のリストを参照してください）​​。 イソクリシスのマルチキログラム量は約80％の水と20％のバイオマスを含む凍結した湿潤ペースト（ 磯 -paste）として購入し、海の刺激臭の臭いと色のダークグリーン/近い黒であることができます。 イソクリシスもできます同じような匂いで乾燥（95％乾燥）、黄褐色粉末（ 磯 -powder）として購入すること。 <ol><li>はさみを使用して、プラスチック包装の隅に2インチの穴- イソクリシスペーストを乾燥させるために、1を切断して1キロのパッケージを開きます。 </li><li>このイソクリシスの約300グラムをつまんで薄い層（〜20ミリメートル）を作成するために、結晶皿のx 75ミリメートル150ミリメートルに穴を通って貼り付けます。 </li><li>それは（一般的に、48乾燥してフレーク状になるまで室温で空気乾燥にペーストを残します -96時間）。 注：実際の乾燥時間が異なり、温度に依存している場合があります。しかし、違いは（最大2週間）であっても、より長い乾燥時間と歩留まりや製品品質に認められませんでした。乾燥工程は、より均一に、および/またはウォームプレートに結晶皿を配置することによって加速することができる（30 - 40°C〜）。 </li><li>スパチュラを用いて結晶皿から乾燥バイオマスをスクレイプし、セルロース抽出シンブル（長さ：123ミリメートル、43ミリメートルのID）に収集します。ドライイソクリシスバイオマスの重量を記録します。 </li></ol>ドライイソクリシスバイオマスの2ソックスレー抽出<ol><li>ソックスレー抽出装置に- （60グラムの乾燥バイオマス典型的には50） イソクリシス -含有セルロース抽出シンブルをロードします。 </li><li>溶剤の色が暗緑色から消えてしまうまで（48時間 - 、ヘキサン（400ml）でソックスレーフラスコを埋める凝縮水や熱源をオンにし、24サイクルにソックスレーを許可）かすかな黄色。 </li><li>熱をオフにして、装置は、ソックスレー抽出器からフラスコを外した後、室温まで冷却します。 </li><li>ロータリーエバポレーターを用いてヘキサンを削除し、ヘキサン抽出可能物質（「ヘキサン藻類油」（H-AO））の重量を記録します。 </li></ol> 3.藻類油の鹸化および脂肪酸および中性脂質の分離<ol><li>メタノールを用いて上記のステップ2.4​​から同じ丸底フラスコにH-AOを再溶解：ジクロロメタン（2：藻類油の1、体積= 10×質量）。 </li><li>攪拌棒を加え、還流冷却器を取り付け（コイル500ミリメートルの長さ）。 </li><li>追加のH 2 O（体積=藻類油の2.67質量X）およびKOH（50％藻類油w / w）の、3時間60℃で撹拌しながら内容物を加熱します。 </li><li>室温に冷却した後、ロータリーエバポレーターで有機溶媒（メタノール、ジクロロメタン）を除去します。 </li><li> 1に注ぐことにより、残りの水性混合物を移し-L分液漏斗。 、（水溶液中に体積が相当）ヘキサンを追加し、分液漏斗を振るし、層を分離することができます。 </li><li>三角フラスコに下部の水層を排出し、そして別々の三角に上部有機相を捨てます。 </li><li>有機層は、（一般的に1-2回以上）無色になるまで繰り返し、3.5と3.6を繰り返します。 </li><li>緑がかった固体として中性脂質を分離するために、ロータリーエバポレーター上で合わせた有機抽出物を濃縮する（融点≈60 - 70°C）。 </li><li> （pH紙によって示されるようにpH約2になるまで6 M、）HClで水相を酸性化。 </li><li>ステップ3.5および3.6に記載されているように1 Lの分液漏斗を使用してヘキサンで酸性化した水相からの遊離脂肪酸（FFA）（水相に等量）を抽出します。 </li><li>近い黒暗緑色油状残渣（&gt; 30℃の温度で液体）としてのFFAを得るために、ロータリーエバポレーター上でヘキサンを除去します。 </li></ol> 4。遊離脂肪酸のエステル化酸触媒とグリーンバイオディーゼルの生産<ol><li>メタノールを用いてのFFAを転送：クロロホルム（1：1、藻類油の6×容積）最初のFFAを溶解した後、撹拌棒を備えた肉厚高圧反応フラスコに注ぐことによって。 </li><li>濃H 2 SO 4（藻類油w / wの20％）を加え、フラスコを密封し、1時間攪拌しながら90℃まで混合物を加熱します。 </li><li>室温に冷却した後、分液漏斗に注ぐことによって混合物を移します。 </li><li> 、H 2 O（藻類油の2×量）を追加し、分液漏斗を振る、そして相を分離することができます。 </li><li>予め秤量した丸底フラスコに下層を排出し、ロータリーエバポレーターで濃縮します。得られたバイオディーゼルの質量を記録します。 </li><li> DB-88 [（88％cyanopropy装 ​​備炎イオン化検出器（GC-FID）28（ガスクロマトグラフを用いてガスクロマトグラフィーにより脂肪酸プロフィールを分析しますリットル）methylarylpolysiloxane]カラム（0.25ミリメートルのIDのx 0.20μmの膜厚30 MX）。 注意：一般的な脂肪酸メチルエステルは、商業的に得られた真正サンプルと保持時間を比較することによって検証されます。また、ガスクロマトグラフィー - 質量分析（GC-MS、質量選択検出器に接続されたガスクロマトグラフ）は、C18などのコンポーネントを分析するために、温度プログラム及びカラムの同じ条件下で行われる：4いるない真正標準が利用できない結果を適用してGC定量します。 </li></ol> 5.バイオディーゼル脱色<ol><li>攪拌棒を備えた丸底フラスコ中で60℃で暗緑色のバイオディーゼル燃料を加熱します。 </li><li>モンモリロナイトK 10（MK10）粉末（バイオディーゼルのw / wの百分の10から20まで）を追加し、1時間撹拌します。 </li><li>熱から丸底を外し、溶液を室温まで冷却します。 </li><li>丸底フラスコからなるろ過装置を準備し、楽しみをフィルタリングネルは、セルロース濾紙（アッシュ0.007％）を含み​​ます。 </li><li>丸底フラスコをすすぐためにヘキサンの最小量を使用してフィルタ漏斗を通して冷却脱色バイオディーゼルを注ぎます。 </li><li>丸底フラスコからフィルター漏斗を外します（これは今脱色バイオディーゼルのヘキサン溶液を含有する）とオレンジ/赤のバイオディーゼルを得ロータリーエバポレーターでヘキサンを除去します。 </li><li>不溶性物質のいくつかの沈降（〜10％w / wの）が発生します、その間に4°Cで保存するサンプル。 </li><li>分析のための明確な均質なバイオディーゼル燃料を生産するためにステップ5.4および5.5に記載されているようにデカンテーションまたは濾過により不溶物を除去します。 </li></ol>中性脂質から6の単離とアルケノンの精製<ol><li>ジクロロメタンの最小量（10 gで中性脂質に対して約50ml）中（ステップ3.8）、中性脂質を溶解し、クロマトグラフィーカラム（O.の上部にピペットで溶液を加えますシリカゲル（230-400メッシュ100 g）を含むD 60ミリメートル、ID 55ミリメートル、長さ18 &quot;）。 </li><li>溶媒としてジクロロメタン（約150 ml）を用いて、圧力（約5 PSI）でシリカを通して溶液を溶出し、250mL丸底フラスコ中で溶離液を集めます。 </li><li>オレンジ色の固体を得、ロータリーエバポレーターでジクロロメタンを除去します。 </li><li>溶液が均一になるまで（総体積〜150mL）で沸騰ヘキサン増分追加量続く沸騰ヘキサン約100mlを添加することによって固体使用ヘキサン再結晶化。そして、ゆっくりと結晶化を促進するために、溶液を室温まで冷却します。 </li><li>フラスコをすすぎ、冷（0℃）のヘキサン少量を用いて、ステップ5.4に記載のように濾過装置を用いて結晶化アルケノンを集めます。 </li></ol>

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<li>Kulkarni, M. G., Dalai, A. K., Bakshi, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+green+seed+canola+oil+for+biodiesel+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Technol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Utilization of green seed canola oil for biodiesel production.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 81, 1886-1893 (2006).</li>
</ol>

この出版物での商品名または市販製品の言及は、特定の情報を提供することのみを目的としており、米国農務省による推奨または承認を意味するものではありません。USDAは機会均等の提供者であり雇用主です。

イソクリシスは、プライマリ貝類飼料の成分、及びバイオ燃料生産のために必要な規模の、したがって代表として収穫工業的に養殖藻類種の唯一の選択された数の一つです。本研究で用いた藻類を利用し、標準的な方法の可用性は、プロトコルはさらなる調査のための他のグループにも広くアクセス可能に提示してください。重要なステップは、空気乾燥藻（33を凍結乾燥するとは対照的に）、溶剤抽出、鹸化、およびエステル化が含まれます。これらの事業活動を通じ1が利用可能な様々なイソクリシス 30から脂質および他の副産物の収率を調べることができます。なお、これらは、株や栽培方法、31の異なる結果と異なる場合があり、また、製品の性質および任意の追加の処理業者が利用する（ 例えば 、乾燥または凍結）によって影響を受ける可能性があることが予想されます。我々はここで実証したように、プロトコルを開発しますEDは正常湿潤ペーストの乾燥粉砕した粉末の範囲、 イソクリシス製品の異なるタイプに適用することができます。バイオディーゼルの収率は、藻類油の低い量（H-AO）に対応した粉末状のバイオマス（12％w / wの乾燥ペーストから7％w / wの乾燥バイオマスの対）、からしかし低い抽出しました。これはソックスレー装置以外の代替抽出プロトコル32は、乾燥粉末イソクリシス製品のためのより適していることを示唆している場合があります。本研究で用いたイソクリシス粉末は、我々が実験的に乾燥したイソクリシスペーストから得られたものと類似の23から25パーセントの脂質を含むとして宣伝されている。33,34,26 出発乾燥バイオマスの異なる色にもかかわらず、 イソペースト-HAOおよびISO -powder-HAOは、約50℃の融点を持つ黒い固形物に近い/ダークグリーンの両方、本質的に区別できませんでした。興味深いことに、中立唇へのFFAの比率2ヘキサン抽出物内のIDが異なっていました。ケンと中性脂質を分離した後、我々は、ISO -paste-HAOから60％（w / w）のFFAを40％（w / w）の中性脂質を得ました。 イソ粉末HAOは平均46％（重量/重量）のFFA及び54％（w / w）の中性脂質の生成しました。結果は、出発粉末バイオマスがイソクリシスペーストよりもFA誘導体に比べて中性脂質の高い量を含んでいる、または粉末イソクリシスのソックスレー抽出は、中性脂質のために幾分選択的であることをいずれでもよいことを示唆しています。 異なる2つの市販イソクリシスのバイオマスから得られた生成物の収率が、また、得られたバイオディーゼルの脂肪酸プロフィールであっただけではなく。バイオディーゼルの燃料特性は、個々のFAMEの性質や内容に直接依存しているように、これは、重要である。35実用化するには、すべてのバイオディーゼルは、文書のASTMに記載の基準に準拠している必要がありD6751または米国やヨーロッパではEN 14214それぞれ。仕様は、セタン価と酸化安定性のための潤滑性および動粘度のための範囲、および最小値を含みます。その他の重要な勧告は、曇り点（CP）またはコールドフィルター目詰まり点（CFPP）の形で低温流動性に関連しています。我々は以前イソペーストから調製されたバイオディーゼルの総合的な燃料試験の結果を報告している。36本研究で磯の -powderから製造したバイオディーゼルのFAMEプロファイルは、以前に試験されたものと同様であるので、我々は似ているように、特定の燃料特性を予測することができます両方のバイオディーゼル燃料について。例えば、両方のFAME混合物の約40％（35.2％および39.9％ を表2）のための多価不飽和脂肪酸（PuFAMEs、二つ以上の二重結合）アカウント。これは、貧しい酸化安定性と良好な低温流動になります。2 biodieのFAMEプロファイルのわずかな違いは、しかし、35がありますSEL燃料。 0（19.4ミリグラム/グラム対16.4ミリグラム/グラム）、18：3（13.5ミリグラム/グラム対8.5ミリグラム/グラム）、および22：6（11.0ミリグラム/粉末イソクリシスから製造されたバイオディーゼルは14のより多くの量を含んでいましたグラム対6.9ミリグラム/グラム）のFAME、まだ18の低い量：4（10.4ミリグラム/グラム対19.8ミリグラム/グラム）。 ASTM規格に含まれる様々な燃料特性上、これらの違いの影響範囲については、今後検討を要します。 両方の商業イソクリシス藻類から得られた初期のバイオディーゼルは、クロロフィルの存在によって説明することができる色が同様に暗緑色であった。36クロロフィルおよびその誘導体は、植物油およびそれらの対応するバイオディーゼル燃料の安定性に負の効果を有することが報告されています。 36,29バイオディーゼル生産に関連してgreenseedキャノーラ油を脱色するためのIssariyakulとダライの方法に基づいて、1時間60℃で10％（w / w）のMK10を超える当社のグリーンバイオディーゼル燃料を攪拌29が劇的になりました目視で顔料含有量の減少（文献 図2）。脱色プロセスからの質量回収率は平均90％でした。 イソペーストハオとイソ粉末-HAO中性脂質から精製されたアルケノンの収率は（ 表1）40％で同等であったと46％w / wのそれぞれ。中性脂質は、 イソ粉末-HAO（w / wの54％w / wの対40％）に含まれる材料の割合が高く、 イソ粉末-HAOはイソペーストHAOアルケノンの収率を超えてからのアルケノンの収率を表すので、 （w / wで/ワット対16％wの25％）は約10％。しかし、 イソ粉末-HAO自体の収率はイソペースト-HAO（15％対20％w / w）でより低かったことを考慮すると、両方のドライイソクリシスバイオマスからのアルケノンの全収率は、x 0.2×0.4（もっと似ています0.4 = 3.2％w / wの乾燥イソクリシスペーストからであり、x 0.54のx 0.46 0.15 = 3.7％ イソクリシス粉末から）。

最近、特に、バイオディーゼル1および他のバイオマス由来の油のような液体燃料の生産のために、藻類からバイオ燃料への関心の偉大な復活がありました。2案の利点は、燃料論争3と伝えられる高い生産性対特定の食品の回避を含みます従来の農作物よりもおよびCO 2緩和機能を提供します。これは、次の4ほぼ20年米国部のエネルギーの水生生物種プログラム（ASP）は、藻類からの輸送燃料を調査する目的で1978年に開始しました。シーハンさんのレポートで概説したように、5プログラムは、投影されたコストは、その時点（バレルあたり$ 18.46（159 L））で原油と競合しなかった主な理由は、1996年に終了しました。石油のコストは、藻類バイオ燃料研究にルネサンスに接続されている（2014年にバレル当たり$ 87.39）6、いくつかの時間それ以来、劇的に増加したがaveが、それにもかかわらず、藻類バイオ燃料はコストがかかりすぎることを証明します。バイオ燃料生産コストを相殺するための7つとしての戦略を、付加価値の副産物の概念はのための重要な理由の一つとして、両方の批評家7,8と支持者9,10と機能の間で浮上していると主張しました米国エネルギー省（DOE）「国家藻類バイオ燃料技術ロードマップ」の藻類バイオ燃料を追求。11 ここでは、商業イソクリシスの微細藻類からの二つの別々の燃料流の共同制作のための方法を説明します。我々は、それがすでに工業的に生産されるので、部分的にはイソクリシスに焦点を当てた養殖のために採取し、そしてまたイソクリシスは、従来の脂質（ すなわち、脂肪酸）に加えて、独特のクラスを生合成藻類のわずか数種の一つであるためいます多価不飽和長鎖アルケノンとして知られている化合物は、12アルケノンの構造は非常にLによって特徴付けられます<html>オング炭化水素鎖（36-40炭素原子）、二つの非メチレン〜4は、 トランス -二重結合を遮断し、メチルまたはエチルケトン（ 図1）。アルケノン不飽和は、二不飽和C37メチルアルケノン（いわゆる&quot;不飽和指数」）の割合は、過去の海面温度の代用として使用することができること13,14、例えば、藻類成長温度に敏感である15 - 20アルケノンされます細胞質脂質体中に存在するとトリグリセリド（タグ）をより豊富であることができると思った。窒素やリンの制限の下で21,22、最大定常期における細胞炭素の10から20パーセントにアルケノンとして蓄積されている。23,24から進化の観点から、そのトランス -二重結合の幾何学的形状は、エネルギー貯蔵のより安定した形を提供するため、アルケノン、タグよりも好まれている場合があります。21 189fig1.jpg &quot;/&gt; 図ポリ不飽和長鎖アルケノンの1構造共通アルケノンメチル37：長い炭化水素鎖長例示イソクリシスから単離した3（35 - 40個の炭素）を、 トランス非メチレン中断二重結合を、メチルまたはエチルケトンで終端します。 ＃炭素数を指す：命名法は、＃は脂肪酸に似ている。二重結合の数を<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 私たちは、アルケノンは、工業栽培の歴史を持つ一般的な藻類から有望な再生可能な炭素原料を表していると主張している。25バイオディーゼルはイソクリシスの総脂質抽出物から直接製造は、アルケノンと汚染のかなりの量（w / wの10から15パーセント）によるが含まれていますこれらの高融点化合物は、乏しい低温流動燃料特性をもたらします。しかし、トンを使用して、彼はここで説明けん化/抽出技術、アルケノンを除去し、二次生成物の流れを生成しながら、バイオディーゼルの品質を向上させることにより回収することができます。最近では2ブテン（butenolysis）との交差メタセシスによる液体燃料へのアルケノンの変換を実証した。26 butenolysis反応は、商業ルテニウムメタセシス重合開始剤を用いた低温で急速に発生し、きれいにジェット燃料の予測可能な混合物を提供します範囲の炭化水素です。この反応は、商業的に実行可能なイソクリシスのバイオ燃料生産のための「バイオリファイナリー」アプローチ27に向かって最初のステップを示す、脂肪酸からバイオディーゼル合成と並行して行われます。

<table><tbody><tr><td>Isochrysis</td><td>リード海洋養殖</td><td>イソ、生、未加工、20%dw</td><td>ライブ培養ペースト、20% w/w バイオマス</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Necton, S.A</td><td>AADISS004</td><td>PhytoBloom Prof Isochrysis (凍結乾燥)</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher Chemical</td><td>H291-4</td><td>ACS Certified</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A452-4</td><td>HPLC Grade</td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>D37-4</td><td>認証/安定化</td></tr><tr><td>ソックスレー装置</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>64826</td><td></td></tr><tr><td>抽出シンブル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>64842</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml;chner 漏斗</td><td>Chemglass</td><td>CG-1406-25</td><td></td></tr><tr><td>高圧反応容器</td><td>Chemglass</td><td>CG-1880-12</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filter Paper</td><td>GE Life Sciences</td><td>1442-042</td><td>グレード 42、灰 0.007%、円、42.5 mm</td></tr><tr><td>バイオディーゼル (B100)</td><td>ベリンガムシェル</td><td></td><td>Figure 3 のバイオディーゼル (B100) は、地元のガソリンスタンドで購入されました。Bellingham, WA 98226</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Aquacave</td><td></td><td>リードとネクトンに加えて、Isochrysisは、www.aquacave.com(2015年9月30日アクセス)のAquacave(イリノイ州ガーニー)からも購入できます。</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>Isochrysisは、www.brineshrimpdirect.com(2015年9月30日アクセス)のBrine Shrimp Direct(ユタ州オグデン)からも購入できます。</td></tr></tbody></table>

コマーシャルからの副産物としてアルケノンの単離とバイオディーゼル生産のための実験プロトコール<em&gt;イソクリシス</em&gt;藻類バイオマス

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

再生可能な、より環境的に持続可能な供給源からの選択肢で石油燃料を交換する必要性がますます重要です。バイオマス由来のバイオ燃料は、この点でかなりの注目を集めている、トウモロコシのエタノールやダイズバイオディーゼルなどの食用作物からしかし、第一世代バイオ燃料は、一般的に好意から下落しています。国内の優れた非食用源から液体燃料を製造するための方法の開発に大きな関心が存在します。ここでは、海洋微細藻類のイソクリシスから精製したバイオディーゼルの生産のための詳細な手順を説明します。また、多価不飽和長鎖アルケノンとして知られている脂質のユニークなスイートは、バイオディーゼル生産のコストを相殺するために潜在的に価値のある副産物として並列に単離されます。 イソクリシスのマルチキログラム量は2市販の供給源、最初の処理に先立って乾燥させる湿潤ペースト（80％水）として1、およびOTから購入されています彼女の乾燥粉砕した粉末（乾燥95％）。脂質は、伝統的な脂肪（ すなわち、トリグリセリド、w / wで46-60％）およびアルケノン（16-25重量/重量％）の両方を含む藻類油（「ヘキサン藻類油」）を生成するソックスレー装置においてヘキサンで抽出します。藻類油中のトリグリセリドの鹸化は、アルケノン含有中性脂質から得られた遊離脂肪酸（FFA）の分離を可能にします。 FFAは、その後アルケノンを単離し、結晶化による中性脂質から精製され、一方、酸触媒エステル化によって（ すなわち 、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸メチルエステル）をバイオディーゼルに変換されます。我々は、高い多価不飽和脂肪酸含量（w / wの約40％）によって特徴付けられる、両方の商業イソクリシスのバイオマスからバイオディーゼルは、類似するが同一でないFAMEプロフィールを有することを示しています。ヘキサン藻類大井の低い量にさかのぼることができイソクリシス湿潤ペースト（w / wの対12％7％w / w）の、から起動する場合には、バイオディーゼルの収率は一貫して高かったです粉末イソクリシス製品から得られるリットル。

<html>処理に先立って、 イソクリシスペースト （ イソペースト）を最初に乾燥させました。これは便利に大きな結晶皿にISO -pasteを追加し、室温で空気乾燥に材料を可能にすることによって、より大きな規模で達成しました。乾燥中に、いくつかのプールされた水の形態は、乾燥プロセスを加速するためにデカンテーションまたはピペットにより除去することができる（一般的に着色された赤みがかりました）。後約48から96時間、今乾燥イソクリシスは結晶皿の外に掻き取り、海藻のような臭い（ 図2）と緑/黒の薄片状物質として得ることができました。乾燥バイオマスの収量は、w / wのアドバタイズとしてペーストより一般的に20％でした。対照的に、粉末イソクリシス物 （ イソ粉末）を黄褐色、微粉砕、さ ​​らに処 ​​理することなく直接使用した乾燥粉末（95％乾燥）（ 図2）でした 。 グレ2 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54189 / 54189fig2.jpg &quot;/&gt; 商業イソクリシス 。 イソクリシスペースト （80％ウェット） の図2.比較は結晶皿の底部に沿って広がり、処理する前に、48から96時間、室温で空気乾燥に委ねられています。得られた乾燥イソクリシスは、市販の乾燥粉末イソクリシス （左）よりも外観が異なっている暗い色の薄片状物質（右）として得られる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ヘキサンでソックスレーにより乾燥磯 -pasteまたはイソ粉末のいずれかの抽出は、ヘキサンを除去した後に、与えた、としてダークグリーン/ニア黒の固体（融点外観が似ていた藻類油（H-AO）。〜50 -60°C）。ペースト（「 イソペースト-HAOから出発したh-AOの収率イソ粉末-HAO」）wの15％であった/「商用粉末イソクリシス （のソックスレー抽出によりH-AOの収率は一方）26、我々の以前の結果と一致し、一般的にw / wの乾燥イソクリシスバイオマスの20％でした&quot; W（ 表1）。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 生成物（G） </td><td> 磯 -paste </td><td> -powder-1 イソ </td><td> -powder-2 イソ </td></tr><tr><td>乾燥バイオマス</td><td> 30 </td><td> 20 </td><td> 20 </td></tr><tr><td>ヘキサン藻類油</td><td> 5.86 </td><td> 2.87 </td><td> 3.11 </td></tr><tr><td> FFAを</td><td> 3.52 </td><td> 1.34 </td><td> 1.38 </td></tr><tr><td>中性脂質</td><td> 2.34 </td><td> 1.38 </td><td> 1.61 </td></tr><tr><td>アルケノン</td><td> 0.94 </td><td> 0.63 </td><td> 0.74 </td></tr><tr><td colspan="4">注：イソ粉末-1及びイソ粉末2は、並列に処理された粉末イソクリシスの二つの試料からの結果を表します。アイソペーストから、これらの製品の収率で他の報告については参考文献26、32、および33を参照してください。 </td></tr></tbody></table> 表1。 商業イソクリシスバイオマスから生成物の収率。 H-AOでアシルグリセロールは、メタノール/ CH 2 Cl 2中のKOH水溶液を添加して、対応する水溶性のカルボン酸塩（ 例えば、石鹸）に変換しました。アルケノンを含む中性脂質は、その後ヘキサンで選択的に分配することにより、この水性混合物から抽出しました。中性脂質を除去した後、石鹸の再酸性化は、その後、同様に水溶液から抽出することができ、対応する遊離脂肪酸（FFA）製造しましたヘキサンでueous相。 イソペーストHAOまたはアイソ -powder-HAOのいずれかからの結合のFFAおよび中性脂質の全体的な質量回収率は定量的に近く、一貫していました。しかしながら、生成物の比率（ すなわち、中性脂質+のFFA）が異なっていました。 イソペーストHAOから、我々は、60％（w / w）のFFAを40％（w / w）の中性脂質（ 表1）を得ました。逆に、 イソ粉末-HAOは、 表1に詳述されるように、中性脂質（平均= 54％中性脂質+ 46％のFFAを）で濃縮されたことが判明しました。 H 2 SO 4およびメタノールでのFFAのエステル化は、その後、90％以上の収率（ 図3）における黒色油状液体周辺暗緑色のように脂肪酸メチルエステル（FAME、 すなわち 、バイオディーゼル）を生成しました。モンモリロナイトK10 29（MK10）粘土の上に加熱することにより脱色は、他の商業双方向に外観が似た黄色/オレンジ色の製品を与えましたodiesel燃料（材料のリストを参照してください）（ 図3）。脱色イソクリシスのバイオディーゼル燃料のFAME分析の結果を表2に示します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54189/54189fig3.jpg" /> イソクリシス大豆バイオディーゼル燃料の図3比較グリーンイソクリシスバイオディーゼル（中央）が抽出され、精製された遊離脂肪酸のエステル化により製造されます。脱色は、市販のバイオディーゼル燃料に似た特性を持つ製品を（右）（左）を生成します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> FAME A </td><td> 磯 -paste </td><td> 磯 -powder </td></tr><tr><td> 14時00分</td><td> 16.4 </td&gt; <td> 19.4 </td></tr><tr><td> 14：01 </td><td> - </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td>午前15時</td><td>トレース</td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> 16時00分</td><td> 10.1 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> 16：1Δ9 </td><td> 7.6 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td>夜04時02分</td><td> ND </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td>午後04時03分</td><td> ND </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td>午後06時</td><td>トレース</td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> 18：1 B </td><td> 12.1 </td><td> 14.3 </td></tr><tr><td>夜六時02 </td><td> 8.1 </td><td> 7.1 </td></tr><tr><td> 18：3 C </td><td> 8.5 </td><td> 13.5 </td></tr><tr><td>夜06時04分</td><td> 19.8 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> 18：05 </td><td> ND </td><td> 3 </td></tr><tr><td>午前20時05分</td><td> ND </td><td> - </td></tr><tr><td> 22時05分</td><td> ND </td><td> 2 </td></tr><tr><td>午前22時06分</td><td> 6.9 </TD&gt; <td> 11 </td></tr><tr><td> ΣD </td><td> 89.8 </td><td> 96.2 </td></tr><tr><td colspan="3">注：＃ シス -二重結合のBコンバインド18：：1Δ9+ 18：脂肪酸の命名法は#carbonsです。1Δ11C複合Δ6,9,12とΔ9,12,15異性体Dの残りの材料は約50です。 ：50他のFAMEと非FAMEコンポーネント（合計〜95％FAME）。 ND =検出されていません。 </td></tr></tbody></table> イソクリシスバイオマス-powder商業磯の -pastと磯から製造されたバイオディーゼルの 表2 FAME組成物。 中性脂質は、w / wのイソ -paste-HAOおよび54％（平均）からイソ粉末-HAO（ 表1）から40％で緑がかった固体混合物として得ました。使用してシリカを通して溶解中性脂質のフィルタリングDCM溶媒、白色固形物として、分析的に純粋なアルケノンを得、ヘキサンで再結晶することができる赤みがかっ/オレンジ色の固体を除去した後に得られました。この手順では、 イソからアルケノンの16％（w / w）の単離収率が得られたペーストHAOおよびイソ -powder-HAO（ 表1）から25％収率。

詳細な方法は、市販のイソクリシス微細藻類からの貴重な副産物としてアルケノンの同時分離と一緒にバイオディーゼルの生産のために提示されています。

The need to replace petroleum fuels with alternatives from renewable and more environmentally sustainable sources is of growing importance. ...

この手順の全体的な目的は、市販のIsochyrsis藻類からバイオディーゼルを製造し、同時に価値ある副産物として長鎖アルケノンを共単離することです。この手法は、再生可能エネルギー分野における重要な疑問への回答に役立ちます。例えば、藻類バイオ燃料が石油ベースの燃料に代わる実行可能な選択肢となり得るか、といった点です。この手法の主な利点は、使用する藻類がすでに工業的に栽培されており、複数の商業的サプライヤーから数キログラム単位で購入できることです。さらに、これらの特定の藻類は、副産物として単離可能な長鎖アルケノンとして知られる特有の脂質群をバイオ合成します。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるJohn Williamsが行います。市販の湿潤Isochrysisペーストを準備するには、1 kg入りのパッケージに小さな穴を開け、約300 gを150 × 75 mmの結晶化皿に絞り出します。このペーストは約80%が水分で、色は濃緑色からほぼ黒色で、刺激臭があります。ペーストを風乾させ、厚さ約20 mmの層を作ります。乾燥させたバイオマスを、質量をあらかじめ測定したセルロース抽出シンブルに掻き集めます。次に、Isochrysisバイオマスの重量を記録します。約50～60 gの乾燥Isochrysisをソックスレー抽出装置に移します。次に、ソックスレExtractorフラスコにヘキサンを400 milliliters充填します。冷却水の供給と加熱を開始し、ソックスレ抽出を1〜2日間サイクルさせます。溶媒の色が濃い緑色から淡い黄色に変わったら、抽出は完了です。室温まで冷却し、エバポレーターを用いてヘキサンを除去します。最後に、ヘキサン藻類オイルの重量を量ります。次に、フラスコ内のヘキサン藻類オイルに、メタノールとジクロロメタンを2:1で混合した溶液を10倍量加えて溶解させます。次に、スターラーバーを加え、オイル量に対して2と2/3倍量の水を加えた後、オイル重量の半分に相当する質量の水酸化カリウムを加えます。次に、フラスコを500 mmの還流冷却器に取り付けます。ドラフト内で混合物を撹拌しながら60 °Cで3時間加熱します。反応液を冷却した後、エバポレーターを用いて有機溶媒を除去します。次に、残った水層の混合液を1リットルの分液漏斗に移し、等量のヘキサンを加えます。フラスコをヘキサンで洗浄し、すべての物質が漏斗に移るようにしてください。漏斗を振り、層を分離させます。次に、下層の水層をフラスコに排出し、上層の有機相を別のフラスコに注ぎます。両方の層を保存しておきます。有機層が淡い黄緑色になるまでヘキサン抽出を繰り返します。次に、回収した有機抽出液を合わせてロータリーエバポレーターで濃縮し、中性脂質を単離します。これらの脂質は緑色の固体として現れ、融点は60から70 °Cの間です。次に、6 M 塩酸を用いて水相を pH 2 まで酸性にします。その後、前述と同様に、分液漏斗を用いて酸性化した水相からヘキサンで遊離脂肪酸を抽出します。最後に、エバポレーターで混合有機抽出液からヘキサンを除去し、精製された遊離脂肪酸を得ます。30 °Cをわずかに上回る温度で融解する、黒に近い濃緑色の油状残渣です。脂肪酸を6倍量のメタノール・クロロホルムを用いて溶解させ、その後、撹拌子を入れた深底の高圧反応フラスコに溶液を注ぎます。この際、すべての脂肪酸が反応フラスコに移動するように十分に洗浄してください。次に、ドラフト内で濃硫酸を加えます。フラスコを密閉し、混合物を攪拌しながら90 °Cで1時間加熱します。反応液を室温まで冷却した後、分液漏斗に移し、2倍量の水を加えます。次に、分液漏斗を振り、界面が分かれるまで待ち、下層をあらかじめ重量を量っておいた丸底フラスコに回収します。次に、エバポレーターで溶液を濃縮し、得られたバイオディーゼルの質量を記録します。この物質は、ガスクロマトグラフを用いて分析することが可能です。中性脂質は丸底フラスコから掻き出し、重量を量った後、精製のためにフラスコに移します。まず、中性脂質を最小限量のジクロロメタンに溶解させることから始めてください。次に、100 gのシリカゲルを含むクロマトグラフィーカラムに溶液を注入します。続いて、低圧でジクロロメタン約150 mLを用いて、シリカゲル中で溶液を溶出させます。溶媒を充填する際にシリカゲルの表面が乱れるのを防ぐため、カラムの最上層に薄い砂の層を加えます。250 milliliterの丸底フラスコに黄色い液体を回収します。次に、エバポレーターを用いてジクロロメタンを除去します。その結果、オレンジ色の固体が得られます。沸騰したヘキサンを用いて固体を再結晶させます。まず、最初に100 millilitersを加え、その後、溶液が均一になるまで沸騰ヘキサンを加え続けます。次に、結晶化を促進するために溶液を室温までゆっくりと冷却し、ろ過装置を用いて結晶化したアルケノンを回収します。少量の氷冷ヘキサンを用いてフラスコをすすぎます。処理に先立ち、isochrysisペーストを乾燥させ、海藻のような臭いを持つ黒緑色の剥片状物質を得ました。対照的に、粉末状のisochrysisは黄褐色の微粉末であり、追加の処理をせずに使用しました。ヘキサンを用いたソックスレー抽出により、ペーストからは粉末よりも大幅に高い収率で藻類油が得られた。藻類油中のアシルグリセロールを水溶性カルボキシレートに変換し、そこから中性脂質と遊離脂肪酸を抽出したところ、どちらの出発物質からもほぼ定量的な量で回収された。しかし、生成物の比率には差異が見られた。エステル化により脂肪酸メチルエステルが生成されました。これはバイオディーゼルとしても知られており、黒に近い濃緑色の油状液体です。収率は90%を超えました。生成物はテキストプロトコルに記載されている方法で脱色されました。精製されたバイオディーゼル燃料のFAME分析では、2つの原料から同様ではあるが同一ではないプロファイルが示されました。溶解した中性脂質をDCMを用いてシリカでろ過すると、赤橙色の固体が得られ、これをヘキサンで再結晶させることで分析純度のアルケノンが得られました。このビデオを視聴することで、市販のIsochrysisをバイオディーゼルに加工し、副産物として純粋なアルケノンを単離する方法について十分に理解できるはずです。この手法を習得すれば、さらなる研究に向けた相当量の藻類バイオディーゼルおよびアルケノンを安定的に生成することが可能です。この手法の開発により、予測やシミュレーションに頼るのではなく、各種燃料試験を実施するために十分な量を確保できるようになったため、藻類バイオディーゼルの燃料特性を厳密に検討することが可能となりました。強酸や強塩基を扱うこと、および密閉容器内で内容物を加熱することは極めて危険であることに十分注意してください。これらの手順を行う際は、適切な個人用保護具を着用し、ドラフトチャンバー内で作業してください。

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出典:Ginies、C.、et al. Bacillus cereusにおける脂肪酸の同定J. Vis.

細菌バイオマスからの脂肪酸メチルエステル(FAME)の調製

機械的な細胞破壊、溶媒ベースの脂質抽出、エステル交換、および定量化およびガスクロマトグラフィーを用いて脂肪酸の同定に基づく微細藻類中の脂肪酸含量および組成の決定のための方法が記載されている。 tripentadecanoin内部標準抽出及び不完全なエステル交換時の損失の可能性を補償するために使用される。...

微細藻類中の脂肪酸含量および組成の分析

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&gt;jove_content&lt;微細藻類の培養と工業用煙道ガスの統合は、最終的に重金属と他の無機化合物を成長培地に導入します。この研究は、フォトバイオリアクターで成長したNannochloropsis...

重金属や微細藻類の生産性に関するその他の無機汚染物質の定量

藻類の熱水液化から生成されるバイオ原油の水性画分の特性評価のために、2次元ガスクロマトグラフィー飛行時間型質量分析法が説明されています。このプロトコルは、高速熱分解、触媒高速熱分解、触媒脱酸素、および水素化処理からの液体製品の水性画分を分析するためにも使用できます。...

飛行時間型質量分析法と2Dガスクロマトグラフィーを用いて藻類の水熱液化からの水性画分の質的特性評価

本稿では、他の方法と組み合わせて、適切な動態パラメータを推定するために使用できるベンチスケールの光合成バイオリアクターの組み立てプロセスと操作について説明します。このシステムは、センサー、データ収集および制御ユニット、およびオープンソースのデータ収集ソフトウェアを使用してpH、光および温度を連続的に監視します。...

動力学的成長試験のための温度、光およびpHモニタリングを有するベンチスケール藻類光合成バイオリアクターの構築およびセットアップ

中性脂質のバブル列フォトバイオリアクターとアッセイで緑の微細藻類の栽培

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発電所からの炭素回収と微細藻類栽培用の半自動オープンレースウェイ池の結合

大気汚染は、すべての生物の生活の質に影響を与えます。ここでは、微細藻類バイオテクノロジーを用いたバイオガス処理(二酸化炭素と硫化水素の同時除去)と、半工業的な開放型高速藻類池によるバイオメタン生産、およびその後の処理効率、pH、溶存酸素、微細藻類の成長の分析について説明します。...

準工業用高速藻類池における微細藻類-バクテリアシステムを用いたバイオガス精製

アルカリ性触媒を使用した植物油の安全な超音波支援エステル交換法がここで紹介されています。この方法は、純粋なバイオディーゼル製品を調製するために迅速かつ効率的です。...

植物油からのバイオディーゼル製品の超音波支援調製

学ぶ、Isochrysis藻類バイオマスからのバイオディーゼル生産とアルケノン単離の実験プロトコール。ソックスレー抽出とトランスエステル化反応を用い、90%以上の高収率でバイオディーゼルを得る持続可能な手法です。

コマーシャルからの副産物としてアルケノンの単離とバイオディーゼル生産のための実験プロトコール

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