コマーシャルからの副産物としてアルケノンの単離とバイオディーゼル生産のための実験プロトコール

この手順の全体的な目的は、市販のIsochyrsis藻類からバイオディーゼルを製造し、同時に価値ある副産物として長鎖アルケノンを共単離することです。この手法は、再生可能エネルギー分野における重要な疑問への回答に役立ちます。例えば、藻類バイオ燃料が石油ベースの燃料に代わる実行可能な選択肢となり得るか、といった点です。

この手法の主な利点は、使用する藻類がすでに工業的に栽培されており、複数の商業的サプライヤーから数キログラム単位で購入できることです。さらに、これらの特定の藻類は、副産物として単離可能な長鎖アルケノンとして知られる特有の脂質群をバイオ合成します。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるJohn Williamsが行います。

市販の湿潤Isochrysisペーストを準備するには、1 kg入りのパッケージに小さな穴を開け、約300 gを150 × 75 mmの結晶化皿に絞り出します。このペーストは約80%が水分で、色は濃緑色からほぼ黒色で、刺激臭があります。ペーストを風乾させ、厚さ約20 mmの層を作ります。

乾燥させたバイオマスを、質量をあらかじめ測定したセルロース抽出シンブルに掻き集めます。次に、Isochrysisバイオマスの重量を記録します。約50～60 gの乾燥Isochrysisをソックスレー抽出装置に移します。

次に、ソックスレExtractorフラスコにヘキサンを400 milliliters充填します。冷却水の供給と加熱を開始し、ソックスレ抽出を1〜2日間サイクルさせます。溶媒の色が濃い緑色から淡い黄色に変わったら、抽出は完了です。

室温まで冷却し、エバポレーターを用いてヘキサンを除去します。最後に、ヘキサン藻類オイルの重量を量ります。次に、フラスコ内のヘキサン藻類オイルに、メタノールとジクロロメタンを2:1で混合した溶液を10倍量加えて溶解させます。

次に、スターラーバーを加え、オイル量に対して2と2/3倍量の水を加えた後、オイル重量の半分に相当する質量の水酸化カリウムを加えます。次に、フラスコを500 mmの還流冷却器に取り付けます。ドラフト内で混合物を撹拌しながら60 °Cで3時間加熱します。

反応液を冷却した後、エバポレーターを用いて有機溶媒を除去します。次に、残った水層の混合液を1リットルの分液漏斗に移し、等量のヘキサンを加えます。フラスコをヘキサンで洗浄し、すべての物質が漏斗に移るようにしてください。

漏斗を振り、層を分離させます。次に、下層の水層をフラスコに排出し、上層の有機相を別のフラスコに注ぎます。両方の層を保存しておきます。

有機層が淡い黄緑色になるまでヘキサン抽出を繰り返します。次に、回収した有機抽出液を合わせてロータリーエバポレーターで濃縮し、中性脂質を単離します。これらの脂質は緑色の固体として現れ、融点は60から70 °Cの間です。

次に、6 M 塩酸を用いて水相を pH 2 まで酸性にします。その後、前述と同様に、分液漏斗を用いて酸性化した水相からヘキサンで遊離脂肪酸を抽出します。最後に、エバポレーターで混合有機抽出液からヘキサンを除去し、精製された遊離脂肪酸を得ます。

30 °Cをわずかに上回る温度で融解する、黒に近い濃緑色の油状残渣です。脂肪酸を6倍量のメタノール・クロロホルムを用いて溶解させ、その後、撹拌子を入れた深底の高圧反応フラスコに溶液を注ぎます。この際、すべての脂肪酸が反応フラスコに移動するように十分に洗浄してください。次に、ドラフト内で濃硫酸を加えます。

フラスコを密閉し、混合物を攪拌しながら90 °Cで1時間加熱します。反応液を室温まで冷却した後、分液漏斗に移し、2倍量の水を加えます。次に、分液漏斗を振り、界面が分かれるまで待ち、下層をあらかじめ重量を量っておいた丸底フラスコに回収します。

次に、エバポレーターで溶液を濃縮し、得られたバイオディーゼルの質量を記録します。この物質は、ガスクロマトグラフを用いて分析することが可能です。中性脂質は丸底フラスコから掻き出し、重量を量った後、精製のためにフラスコに移します。まず、中性脂質を最小限量のジクロロメタンに溶解させることから始めてください。

次に、100 gのシリカゲルを含むクロマトグラフィーカラムに溶液を注入します。続いて、低圧でジクロロメタン約150 mLを用いて、シリカゲル中で溶液を溶出させます。溶媒を充填する際にシリカゲルの表面が乱れるのを防ぐため、カラムの最上層に薄い砂の層を加えます。

250 milliliterの丸底フラスコに黄色い液体を回収します。次に、エバポレーターを用いてジクロロメタンを除去します。その結果、オレンジ色の固体が得られます。

沸騰したヘキサンを用いて固体を再結晶させます。まず、最初に100 millilitersを加え、その後、溶液が均一になるまで沸騰ヘキサンを加え続けます。次に、結晶化を促進するために溶液を室温までゆっくりと冷却し、ろ過装置を用いて結晶化したアルケノンを回収します。

少量の氷冷ヘキサンを用いてフラスコをすすぎます。処理に先立ち、isochrysisペーストを乾燥させ、海藻のような臭いを持つ黒緑色の剥片状物質を得ました。対照的に、粉末状のisochrysisは黄褐色の微粉末であり、追加の処理をせずに使用しました。

ヘキサンを用いたソックスレー抽出により、ペーストからは粉末よりも大幅に高い収率で藻類油が得られた。藻類油中のアシルグリセロールを水溶性カルボキシレートに変換し、そこから中性脂質と遊離脂肪酸を抽出したところ、どちらの出発物質からもほぼ定量的な量で回収された。しかし、生成物の比率には差異が見られた。

エステル化により脂肪酸メチルエステルが生成されました。これはバイオディーゼルとしても知られており、黒に近い濃緑色の油状液体です。収率は90%を超えました。生成物はテキストプロトコルに記載されている方法で脱色されました。

精製されたバイオディーゼル燃料のFAME分析では、2つの原料から同様ではあるが同一ではないプロファイルが示されました。溶解した中性脂質をDCMを用いてシリカでろ過すると、赤橙色の固体が得られ、これをヘキサンで再結晶させることで分析純度のアルケノンが得られました。このビデオを視聴することで、市販のIsochrysisをバイオディーゼルに加工し、副産物として純粋なアルケノンを単離する方法について十分に理解できるはずです。

この手法を習得すれば、さらなる研究に向けた相当量の藻類バイオディーゼルおよびアルケノンを安定的に生成することが可能です。この手法の開発により、予測やシミュレーションに頼るのではなく、各種燃料試験を実施するために十分な量を確保できるようになったため、藻類バイオディーゼルの燃料特性を厳密に検討することが可能となりました。強酸や強塩基を扱うこと、および密閉容器内で内容物を加熱することは極めて危険であることに十分注意してください。

これらの手順を行う際は、適切な個人用保護具を着用し、ドラフトチャンバー内で作業してください。