Name: 「せん断リング」の組み立てと応用：小説内皮軌道、単方向および定期的な流動のためのモデルとせん断応力 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶ「せん断リング」の組み立てと応用：単方向・定期的な流動による内皮細胞の形態と機能への影響を評価する簡便で経済的なin vitroモデル。この手法は血管生物学研究に有用です。

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著者は、氏クリストファー・グエン、アーロン・ハンターとシュリーブポートジャンプスタート、SMART、およびBiostartのトレーニングプログラムの支援だけでなく、生物物理学、シュリーブポート、LAのセンテナリー大学ルイジアナ州の部門に感謝したいです。

1. 150ミリメートル直径せん断リングの構築（図1） 注：せん断リングは、異なる総表面積を有するデバイスが得られ、外側及び内側のペトリ皿の大きさを変えることにより、多くの異なる寸法を作成するために構成された細胞収量および剪断力の範囲を開発することができます。このレポートでは、98センチメートル2（ 図2）の総表面積のための内部100ミリメートル皿と組み合わせた150ミリメートル皿を説明します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig1.jpg" /> 図1.せん断リングアセンブリ。図の上の部分は、部分的に組み立てられたせん断リングを示しています。気密シールが完全に内側と外側の皿との間に形成されていない場合、転送ピペットで3mmの穴を介して塩化メチレンを0.5mlを注入。せん断リングは、内側EDGの周りにシリコーンゴム接着剤の厚さ1mmのビーズを適用することによって遮断シールされていますせん断リングトップの電子。図の下の部分は、組み立てられたせん断リングを示しています。青色メッキ内皮細胞の領域を表します。外側と内側の赤い矢印は、オービタルシェーカー上に配置されたせん断リングの内側せん断リングとメディアの軌道運動を示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig2.jpg" /> 図150ミリメートルせん断リングのため2.表面の測定（スケールで描かれていない）。トップパネルは軌道回転に応じて、外側のリングに向かって流体の遠心移動を示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol><li>生成することにより、せん断リング建設テンプレートを作成します。150ミリメートルの円の中心に配置された100ミリメートル、内径とプレゼンテーションソフトウェアで150ミリメートル外側のエッジプロファイル。 A4白い紙にテンプレートを印刷します。 </li><li>ピペットの150mmガラスペトリ皿に塩化メチレン（ジクロロメタン）を10ml。塩化メチレンが、ほとんどのプラスチックを可溶化し、プラスチック部品を結合するために、ここで使用される料理は、ガラスではなく、ポリスチレン（または他のビニルプラスチック）であることが重要です。 注意：適切なフードの換気をすべての建設のために手袋を使用してください。メチレンクロライドは、接触刺激性であり、肝毒性です。 </li><li>外側せん断リングテンプレート上に150ミリメートルのプラスチックペトリ皿を合わせます。 </li><li>回転工具を用いて100 mmディッシュの中央に3mmの穴を開けます。掘削から生成される任意のプラスチックの削りくずを取り除きます。 </li><li>手袋をはめた手で押さえながら、反転し、約3秒間塩化メチレンのプールに前のステップから100ミリメートルペトリ皿の上縁を浸します。 </li><li>トランス慎重にマークされたテンプレート上に100ミリメートル皿を合わせて、150ミリメートル皿の中央に100ミリメートルディッシュエッジダウンを「濡れる」をFER。塩化メチレンは、100ミリメートルと150ミリメートル皿に参加し、プラスチックを融合します。ゆっくり100ミリメートル皿を時計回りに回転させ、数回反時計回りに150ミリメートル皿に良好な接着性を確保するために。 注：外皿の中央に内側の皿の適切な位置合わせを確実にするために、十分に注意してください。偏心位置合わせは、剪断環の異なる位置でせん断応力の変動をもたらすことができます。塩化メチレンが誤って100ミリメートル皿の配置中に150ミリメートルペトリ皿の外側のトラック部分の上に滴下することができないように注意してください。これは、流れの乱れを引き起こす可能性がある不均一な表面を作成する、細胞が成長する底面にプラスチックを溶融します。 </li><li>塩化メチレンを乾燥させた後、オーバー新たにバインドされたペトリ皿を反転し、慎重にそれを確実にするための接点を検査気密シールは、二つのペトリ皿との間に形成されています。 </li><li>気密シールが完全に形成されていない場合、転送ピペットで3mmの穴を介して塩化メチレンを0.5mlを注入。料理をピックアップし、静かに塩化メチレンがエッジに到達できるようにするには、それを回転させます。 注：あまりにも速く回転させた場合、塩化メチレンは、細胞が成長する表面を変形とせん断リングを台無しに、150ミリメートル皿の外側部分に波及することができます。漏れたせん断リングは捨ててください。 </li><li>シリコンゴムシーラントの3mmのビーズを適用することにより、100mMの皿穴を密封。 </li><li>フラットカッティングヘッドを取り付けた回転工具を使用して、キャップ下のチューブの少なくとも1cmに残し、15ミリリットルの円錐ポリスチレン組織培養管のトップ3のCM部分をカット。滑らかで平坦な切断ヘッドの平らな面を使用してまで、カットチューブの端を磨きます。粉砕することにより生成される任意のプラスチックの削りくずを取り除きます。 </li><li>上にカットオフ15ミリリットルにコニカルチューブをトレース約0.5センチメートル離れた皿のエッジからマーカー、と150ミリメートル皿の蓋。円の端からのマージン約1〜2ミリメートル残して、描かれた円の内側の穴を開けます。 </li><li>ドリル穴の上にカットオフコニカルチューブトップを置きます。転送ピペットを用いて、150ミリメートルの蓋にコニカルチューブを結合するために円錐管のカットオフエッジに塩化メチレンの約250μLを適用します。 </li><li>トップペトリ皿の内側の縁の周りにシリコンゴムシーラントの厚さ1mmのビーズを適用することにより、150ミリメートル皿に150ミリメートルのふたを封印。 </li></ol>せん断リングの2滅菌<ol><li> 15ミリリットルコニカルチューブポートを介して新たに形成されたせん断リングにリン酸緩衝生理食塩水のピペットで約10ミリリットル。せん断リングの内側に任意の破片を除去するために周りに渦巻きます。パスツールピペット/真空アスピレーターでリン酸緩衝生理食塩水を削除してください。 </li><li>破片が除去されるまで、前の手順を繰り返します。 </li><li> steriへせん断リング平安大町、UV照射を用いて70％エタノール洗浄を組み合わせて使用​​します。 <ol><li>アクセスポートを介して通気キャップ、ピペット70％エタノールの約10ミリリットルを外し、バックのキャップをねじ込みます。せん断リングの内側を十分に洗浄することを確認して、複数回回転させ、せん断リング裏返し。 </li><li>ヒュームフードの下では、過剰70％エタノールを吸引除去します。スプレーボトルを用いて、完全に70％エタノールでキャップし、アクセスポートをスプレー。 </li><li>完全に乾燥するまで組織培養フード内にUV照射下でせん断リングとキャップを置きます。 </li></ol></li><li>細胞培養めっきに使用するまで乾燥すると、室温でのバックキャップと店舗滅菌せん断リングをねじ込みます。 </li></ol> 3.せん断応力の研究<ol><li>形質転換された内皮細胞株のための4分割比：典型的には1を使用して、標準的な細胞培養プロトコルに従って滅菌剪断環中の内皮細胞をプレート。 注：ラットの網膜microvascular内皮細胞は、市販のものを入手しました。人間の脳内皮細胞（hCMEC / D3）細胞は博士ピエール・オリバークーロ（INSERM、フランス）からの寛大な贈り物として提供され、完全な内皮基礎培地（EBM）中で培養しました。 </li><li>文化は前流研究の開始に合流に到達することを可能にします。組織培養培地を30ml（10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシン有するダルベッコ改変イーグル培地）を使用します。 3日おきに細胞培養培地を変更し、7.5％CO 2および92.5％の室内空気で、37℃で細胞を維持します。 </li><li>インキュベーター中でオービタルシェーカーを置きます。 注：オービタルシェーカーは、一般的に重いです（&gt; 10キロ）。棚ストレスや振動を最小限に抑えるために、インキュベーターの底棚にオービタルシェーカーを置きます。 </li><li>オービタルシェーカー上で実験的なせん断リングを配置します。同じインキュベータ内部の静的コントロール群せん断リングを配置します。 </li><li> SH内の最大せん断応力を推定式耳リング<img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq1.jpg" />どこ<img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq2.jpg" /> （単位cm）オービタルシェーカーのために回転半径は、 <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq3.jpg" />媒体の粘度（ポアズで）であります<img alt="式4" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq4.jpg" /> （グラム/ミリリットルで）媒体の密度であり、かつ<img alt="式（5）" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq5.jpg" /> 24（回転/秒）の回転周波数です。 </li><li>せん断応力印加（ 例えば 、72時間）の所望の期間のためにシェーカー上でせん断リングを残して、希望の回転数（ 例えば、90回転）にオービタルシェーカー上で回転設定を開始します。 注：オービタルシェーカーは、熱を生成することができますので、インキュベーターの温度は37°Cを実験期間を通して維持されることを保証するために、最初に監視する必要があります。また、Sリングは、環境室（ 例えば 、モジュラーインキュベーターチャンバー）に移し、その後、回転培養器内に配置することができます聞いています。 </li><li>細胞層は、所望の時間に対するせん断インキュベーターから剪断リングを除去するために露出された後。せん断リングふたをやってのけるし、所望の終点分析（ 例えば、ウエスタンブロット法、蛍光活性化セルソーティングなど ）25を調べるため、細胞および/またはメディアを取り出します。 </li></ol>

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J. Winnyのユンはアネット・ファニセロ財団から研究助成金を持っています。 J.スティーブンアレクサンダーは、神経内科、LSUHSC-Sからの研究をサポートしています。

剪断する内皮細胞を露出させるためのせん断環系の構築には、せん断応力の試験を実行する簡単な方法です。それにもかかわらず、優れたせん断リングとより良い結果を得るために重要であるいくつかのステップがあります。完全なシールは、サンプル間で矛盾したせん断応力を作成することができ漏れからメディアを防止するために、内側と外側のリングとの間になされるべきです。完全なシールがなされていない場合は、塩化メチレンの最小量は、内側リングの穴から転送ピペットで内側と外側の皿間のエッジに追加されるべきです。穏やかに塩化メチレンを完全にシールを形成するために可能にすべきであるリングを回転させます。また、不用意に切断から生成されたプラスチック製の削りくずは、せん断リング軌道上に存在することができるので、悪影響細胞の成長に影響を与えると矛盾せん断応力アプリケーションを与えることができる任意の破片を除去しなければならない建設後のせん断リングを洗い流し。 の資料に記載聞くリングは、サンプル当たりの出力の大量につながる、サイズが比較的大きいです。しかしながら、より小さなバージョンは、より小さなペトリ皿を用いて構成すること...

シス調節エレメント6の活性化、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性7と剪断応力応答エレメント（SSRE）8を介して5 -流体せん断応力は、内皮遺伝子プログラム1を調節することが示されています。組織因子9及び組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）10発現を調節することによって、応力の影響を凝固向かっ内皮寄与せん断。せん断応力もPDGF-Bの合成と応答8を制御することにより、血管新生11と血管リモデリングの制御に影響を与えます。内皮由来の血管作動性メディエーターのアドレノメデュリン、エンドセリン-1、ウロテンシンIIおよびリラキシンはまた、せん断12によって規制されています。内皮型一酸化窒素合成酵素の産生および一酸化窒素産生の転写は、両方のせん断依存10です。せん断はまた、内皮ICAM-1の発現13を制御します。したがってpowerfuでき流れによって誘発されるせん断応力LLY内皮応答の多種多様な影響を与えます。重要なことには、血管の脈動は、現在、正常な血管の老化および血管性認知症14の形態の両方の病態生理に重要な役割を果たしているように見え、さらに、多発性硬化症15のような他の神経変性疾患に寄与し得ます。 静脈および動脈の内皮細胞は、本質的に、生体内で多様な血行力学的流動パターンに曝される、多くの異なる内皮細胞表現型は、16を発揮することができます。流れの大きさと周期性に依存して、内皮細胞への影響は、遺伝子またはタンパク質発現17,18の変化を反映することができる、炎症性細胞の活性化およびアポトーシスを含むことができます。現象を剪断する内皮細胞応答の研究は、したがって、十分にそのような剪断パターンを生成するインビトロモデルにおける生産の難しさによって複雑に残ります。 多くの異なるexperimeNTALプロトコルは、細胞単層の内皮細胞に流体せん断応力を適用するために開発されています。 21 -最も一般的に使用されるシステムの一つは、チャンバ19内に均一な層流を生成する平行プレートフローチャンバーです。蠕動ポンプは、典型的には、典型的には、インビボ 22 内の多くの場所に流れ特性を再現することができる周期的な流れを作成するために接続されています。他の一般的なセットアップは、流体せん断応力は、コーン23の回転速度によって決定されます。「コーン・プレート」モデルを使用しています。どちらのシステムも、それらに類似する他の構成は、セットアップし、多くの研究室には比較的高価で、アクセスできなくすることができるコンポーネントを必要とする退屈することができます。 これらの現在のモデルのもう一つの主要な制限は、同時に、比較的低い表面積を有する、それぞれ行うことができる反復試験の比較的少数です。これは、時間と共増加します<html>このようなアプローチのmplexity。したがって、単方向および定期的なせん断を誘導する理想的なモデルは、比較的大きな表面積を持つ研究の複製の数が多いが簡単に設定することができます1、それぞれのかもしれません。また、上記のモデルは、多くのユーザーのためにコスト高であってもよい、かなり洗練されたセットアップが必要です。基本的な実験用材料を用いた流体せん断障害を生成することができますモデルは、いくつかの利点があるかもしれません。 単方向、定期的なせん断応力を印加したシンプルかつ非常に経済的な方法は、オービタルシェーカー24上に円形の皿を配置することを含みます。必要に応じて、このプロトコルは、非常に単純であり、研究の反復の高い数字を達成するためにスケールアップすることができ、比較的大きな表面積を持つ各。しかし、皿の中央に位置するセルは、同じ皿の中の混合の細胞表現型の応答を得、周囲に沿って細胞とは異なる流れのパターンにさらされています。 _content &quot;&gt;この現在のレポートでは、「せん断リング」、単方向および定期的なせん断応力を作成するための我々のモデルの構築および使用について説明します。デザインをせん断リングのために効果的に制限「混合」携帯せん断誘発性表現型をフローを制限することにより、内輪の配置を介して周囲に円形の培養皿内経路せん断リングの構成及び動作は簡単で経済的であり、容易に広く利用可能な組織培養用品を使用してオービタルシェーカーの広い範囲に対応するようにスケーリングすることができる。このモデルは、生理学的および病態生理学的なレベル内に一方向と周期的流れパターンを提供するために、内皮細胞実験に適用することができます。

<table><tbody><tr><td>100 x 20 mm プラスチック組織培養皿</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td>皿はポリスチレンでなければなりません</td></tr><tr><td>150 x 25 mm プラスチック組織培養皿</td><td>コーニング</td><td>430599</td><td>皿はポリスチレン</td></tr><tr><td>でなければなりません 150 mm ガラス ペトリ皿</td><td>フィッシャー</td><td>3160150BO</td><td></td></tr><tr><td>15 ml ポリスチレン組織培養プラスチックチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>塩化メチレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D65100</td><td></td></tr><tr><td>シリコーン ゴム シーラント</td><td>DAP</td><td>7079808641</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>3 ml トランスファー ピペット</td><td>Becton-Dickinson</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>プリンター ペーパー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手袋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>回転工具とセット</td><td>ドレメル</td><td>4000-6/50</td><td></td></tr><tr><td>回転工具 カッティングヘッド</td><td>ドレメル</td><td>EZ476</td><td></td></tr><tr><td>回転工具 ドリルヘッド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>VWR</td><td>57018-754</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラット 網膜微小血管内皮細胞</td><td>細胞生物学</td><td>RA-6065</td><td></td></tr></tbody></table>

「せん断リング」の組み立てと応用：小説内皮軌道、単方向および定期的な流動のためのモデルとせん断応力

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

適応だけでなく、内皮表現型と遺伝子発現の病理学的変化を誘導することにより、血管生理学および病態生理学における血管の流体せん断重要な役割を果たしての正常レベルとパターンからの逸脱。具体的には、定期的に、一方向の流動誘起剪断応力の不適応な効果は、いくつかの血管の細胞型、特に内皮細胞上のさまざまな効果を引き起こすことができます。今では、多様な解剖学的起源から内皮細胞が培養されているが、中・深さは、流体のせん断に対する反応の解析せん断モデル（ 例えば、平行平板フローチャンバー、コーン・プレート・フロー・モデル）の相対的な複雑さによって妨げられてきました。これらのすべては優れたアプローチを示しているが、このようなモデルは、ボットへの挑戦を作成し、技術的に複雑であり、比較的長く、複雑なセットアップ時間、低表面積、多くの場合、シーラントおよびガスケットを必要とするポンプと加圧用の要件などの欠点があります時間無菌性の維持及び複数の実験を実行することができません。しかし、流れ及びせん断のより高いスループットモデルが利用可能であった場合は、血管内皮せん断応答、分子レベルで、特に定期的なせん断研究に大きな進展、より急速に進んだことがあります。簡単に単方向、周期的なせん断応力試験で実験的な反復の数が多いを可能にする比較的大きな表面積を持つ、簡単に組み立て小説、かつ安価な組織培養モデル：ここでは、せん断リングの構造や使用方法を説明します内皮細胞。

ここでは、せん断リングで培養hCMEC / D3脳内皮細胞およびラット網膜微小血管内皮細胞単層、両方からの代表的な結果を提示します。 hCMEC / D3脳内皮細胞単層を完全EBMでコンフルエンスまで成長させた後、剪断リング72時間オービタルシェーカー上に置きました。ステップ3.5から式を用いて、計算された最大せん断応力<img alt="式6" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq6.jpg" />たパラメータを持つ約2.8ダイン/ cm 2の（ <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq2.jpg" /> = 0.95センチメートル、 <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq3.jpg" /> = 0.0101ポイズ、 <img alt="式4" src="/files...

さまざまなレベルとパターンの流体せん断が、内皮遺伝子の発現、表現型、および病気に対する感受性を調節することが知られています。「せん断リング」の組み立てと使用、つまり一方向の周期的なせん断応力パターンを生成するモデルについて説明します。シャーリングは組み立てが簡単で、経済的で、高いセル収率を生み出すことができます。

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

このモデルの全体的な目的は、内皮細胞を用いたin vitroでの周期的な流体フローおよびせん断応力研究のための、簡便かつ経済的な手法を構築することです。この手法は、周期的なせん断が内皮細胞の形状、構造、および機能にどのような影響を与えるかといった、内皮細胞生理学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、簡便に組み立て可能な組織培養装置を使用することで、細胞応答の評価に適した比較的広い表面積を確保できることです。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の医学生であるLuke White氏が行います。まず、プレゼンテーションソフトを使用して、外径150 mmのプロファイルと同心円状に配置された内径100 mmの円を持つ、シアリング構築用テンプレートを作成することから始めてください。テンプレートをA4サイズの白い用紙に印刷します。十分な換気設備を備えたドラフトチャンバー内で、手袋を着用し、10 mLの塩化メチレンを150 mmのガラス製ペトリ皿にピペッティングして加えます。塩化メチレンはほとんどのプラスチックを溶解させるため、必ずガラス製の皿を使用してください。150 mmのプラスチック製ペトリ皿を外側せん断テンプレートに合わせて配置します。ロータリーツールを使用して、100 mmの皿の中央に直径3 mmの穴を3か所開けます。ドリリングで発生したプラスチックの切屑を取り除きます。手袋を着用した手で100 mmペトリ皿を持ち、皿の上端をメチレンクロリドのプールに約3秒間浸します。100 mm皿から余分なメチレンクロリドを滴り落とした後、濡れた皿の端を150 mm皿の中央へ迅速に移動させます。印をつけたテンプレートに合わせて、100 mm皿を慎重に配置してください。100 mmディッシュを時計回りおよび反時計回りに数回ゆっくりと回転させ、150 mmディッシュにしっかりと接着させます。塩化メチレンが乾燥したら、接合したペトリ皿を裏返し、接触点を慎重に検査します。完全に密閉されていない場合は、トランスファーピペットを用いて、3 mmの穴から0.5 mLの塩化メチレンを注入してください。ディッシュを持ち上げ、ゆっくりと回転させて塩化メチレンを端まで行き渡らせます。2枚のペトリ皿の間が密に密閉されていることを確認した後、100 mmディッシュの穴にシリコンゴムシーラントを3 mmのビーズ状に塗布して封止します。平切削ヘッドを装着したロータリーツールを用いて、15 mmコニコールポリスチレン組織培養チューブの上部3 cmを切り取り、キャップの下に少なくとも1 cmのチューブが残るようにします。カッティングヘッドの平らな面を使用して、切断したチューブのエッジを滑らかで平坦になるまで研磨します。研磨によって生じたプラスチックの削り屑を取り除きます。マーカーを用いて、切断した15 milliliterのコニカルチューブの輪郭を、150 millimeterディッシュの蓋の端から約0.5 centimeters離れた位置に書き写します。描いた円の内側に穴を開けます。この際、円の端から約1〜2 mmの余裕を持たせてください。切り取ったコニコールチューブの上部を、開けた穴の上に配置します。トランスファーピペットを使用して、コニコールチューブの切り口に塩化メチレンを約0.25 mL（250 µL）塗布し、コニコールチューブを150 mmの蓋に接着させます。最後に、上のペトリ皿の内周に1 mm厚のシリコンゴムシーラントを塗布し、150 mmの蓋を150 mmの皿に密閉します。組み立てられたシールリングの概略図が示されています。青色の部分は、内皮細胞が播種された領域を表しています。外側と内側の赤い矢印は、オービタルシェーカーに設置した際のシアリングリングおよびシアリングリング内部の培地の軌道運動を示しています。滅菌の準備として、15 mLコニコールチューブポートを介して、新しく作製したシアリングリングにPBSを約10 mLピペッティングします。回転させてシアリングリング内部のゴミを取り除きます。パスツールピペットと吸引装置を用いてPBSを除去します。すべてのデブリが取り除かれるまで、PBSでの洗浄を繰り返します。シアリングリングを滅菌するため、70%エタノールによるすすぎとUV照射を組み合わせて行います。ベントキャップを回して外し、アクセスポートから70% ethanolを約10 millilitersピペットで注入し、キャップを締め直します。シアリングを数回回転させ、裏返して、シアリングの内側が十分に洗浄されるようにします。組織培養フード内で、余分な70% ethanolを吸引除去します。スプレーボトルを用いて、アクセスポートとキャップに70%ethanolを十分に吹き付けます。次に、シアリングリングとキャップを組織培養フード内のUV照射下に置き、完全に乾燥させます。シアリングリングが乾燥したら、キャップを締め直します。滅菌済みのシアーリングは、細胞培養の播種に使用するまで室温で保存してください。せん断ストレス試験の準備として、まず標準的な細胞培養プロトコルに従い、滅菌済みのシアーリングに血管内皮細胞を播種します。フロー試験を開始する前に、培養細胞をコンフルエントまで増殖させてください。細胞がコンフルエントに達したら、棚のストレスと振動を最小限に抑えるため、インキュベーターの最下段棚に設置したオービタルシェーカーの上に、実験用せん断リングを配置します。静止対照群のせん断リングも同じインキュベーター内に配置します。せん断ストレスを適用したい所定の時間、せん断リングをシェーカーの上に保持します。細胞層を所定の時間せん断にさらした後、インキュベーターからせん断リングを取り出します。せん断リングの蓋を外し、目的のエンドポイント解析用の細胞および培地を回収します。せん断リングを開封した後、研究者はいくつかの方法を用いて解析用の細胞と培地を回収できることに留意してください。図に示すのは、48時間の周期的な流体剪断ストレスまたは静的な曝露後における、剪断リング内でのヒトCMEC D3脳内皮細胞単層の外観の代表的な結果である。細胞培養の配向は、矢印で示された流れの方向と常に平行であるとは限らないことが観察された。周期的な剪断ストレスに対する一部の応答を、ラット網膜微小血管内皮細胞単層において示している。剪断リング内での72時間の周期的な流体剪断ストレスにより、Beta-actinローディングコントロールと比較して、血小板内皮細胞接着分子（Platelet-endothelial cell adhesion molecule）が有意に減少した。一度習得すれば、適切に行うことで、約3時間で複数のシアリングを製作することが可能です。この手順を実施する際は、内皿と外皿を慎重に合わせ、両者の間に密閉されたシールが形成されていることを確認することが重要です。このビデオを視聴することで、血管内皮細胞を用いたin vitroでの周期的な流体フローおよびせん断応力研究を行うための簡便な方法として、シアリングの製作および使用方法を十分に理解できるはずです。塩化メチレンの取り扱いは危険を伴う可能性があるため、それが必要な工程を行う際は、常にドラフトチャンバー内で作業するなど、十分な予防措置を講じてください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、無菌連続流回路における層流のせん断応力を受ける接着細胞への方法を記述しています。細胞の接着、形態は、透明なチャンバーを通過代謝物の分析と将来の実験や培養のためのせん断曝露後に細胞を回収するための回路から得られた試​​料を研究することができる。...

層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

この記事では、細胞の自己組織化による細胞由来の組織のリングを作成するには、汎用的な方法を概説します。平滑筋細胞は、リング状のアガロース井戸の集合体と7日以内に強固な3次元（3D）の組織を形成するために契約に播種。ミリスケールの組織のリングは機械的なテストに資するものであり、組織の組み立てのためのビルディングブロックとして機能する。...

生体力学的解析と組織工学のための細胞由来の組織のリングを製作する監督セルラーセルフアセンブリ

マイクロチャネル·オン·チップ·プラットフォームは、フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせによって開発されました。内皮マイクロチャネルプラットフォームは、 インビボにおける微小血管の3次元（3D）ジオメトリを模倣する制御された連続かん流の流れの下で実行され、高品質かつリアルタイムイメージングを可能にし、微小血管の研究に適用することができる。...

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

この原稿は、内皮の生理学的特性を再現微小血管を設計するための射出成形方法を提供します。マイクロ流体ベースのプロセスは、このような流れ、細胞組成、幾何学、および生化学的勾配などの調整可能な条件、との特許の3D血管ネットワークを作成します。製造プロセスと潜在的な用途の例について説明します。...

微細と3D微小血管の組立

ここでは、流体せん断応力下における血管内皮細胞の培養と遺伝子発現解析のワークフローが表示されます。同時に監視制御環境および外因性参照 RNA の定量的 PCR...

剪断応力の複数の平行平板流チャンバーを使用して内皮細胞の遺伝子発現解析

このプロトコルの目的は、せん断応力によるメカノ感受性イオンチャネルのリアルタイム活性化を調査する上で使用する改変並列プレートフローチャンバを記述することです。...

明確に定義されたせん断応力下の単一細胞イオン電流の電気生理学的記録

このプロトコルは、軌道シェーカーモデルを用いた剪断応力適用用に、内皮細胞の成長を6ウェルプレートの特定の領域に制限するコーティング方法を説明する。...

メカノ生物学的研究のための軌道シェーカー上の6ウェルプレートにおける内皮細胞の成長のセグメント化

ここでは、マイクロ流体チップと、新生血管形成の初期微小環境を再現する、自動制御された高効率循環マイクロ流体システムを提供し、高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布によって内皮細胞(ECs)を同時に刺激することを可能にする。...

新血管新生初期事象を模倣する微発性モデル

心筋梗塞が起こる前に介入を導くために冠状血管系でどのアテローム硬化性病変が進行するかを決定する必要がある。この記事では、この進行を予測するのに役立つ市販の有限要素ソルバーで流体構造相互作用技術を使用した光コヘレンス断層撮影による動脈の生体力学的モデリングについて概説します。...

冠動脈動脈硬化の光コヘレンス断層撮影法による生体力学的流体構造相互作用解析

ここでは、内皮細胞に同期振動性高血糖およびパルサタイルせん断応力を曝露するマイクロ流体システムを製作・運用するプロトコルを提示します。このアプローチは、糖尿病の内皮機能障害を研究するための生理学的に関連性の高い in...

生理的パルサタイルせん断応力と振動性高血糖を組み合わせた内皮機能障害をモデル化するためのマイクロ流体システム

学ぶ「せん断リング」の組み立てと応用：単方向・定期的な流動による内皮細胞の形態と機能への影響を評価する簡便で経済的なin vitroモデル。この手法は血管生物学研究に有用です。

「せん断リング」の組み立てと応用：小説内皮軌道、単方向および定期的な流動のためのモデルとせん断応力

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