「せん断リング」の組み立てと応用：小説内皮軌道、単方向および定期的な流動のためのモデルとせん断応力

このモデルの全体的な目標は、内皮細胞のIn Vitro周期的な流体流とせん断応力の研究のためのシンプルで経済的な方法を作成することです。この方法は、内皮細胞生理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、周期的なせん断は内皮細胞の形状、構造、機能にどのように影響しますか。

この技術の主な利点は、細胞応答の評価に比較的大きな表面積を提供できる、単純に組み立てられた組織培養デバイスを使用することです。この手順を実演するのは、私の研究室の医学生であるルーク・ホワイトさんです。この手順は、プレゼンテーションソフトウェアを使用して、150ミリメートルの外縁プロファイルと150ミリメートルの円の中心に配置された内径100ミリメートルのせん断リング構造テンプレートを作成することから始めます。

テンプレートをA4サイズの白い用紙に印刷します。十分な換気と手袋を着用して、10ミリメートルの塩化メチレンを150ミリメートルのガラスシャーレにピペットでピペットで固定し、十分な換気を備えたドラフトの下で作業します。塩化メチレンはほとんどのプラスチックを可溶化するため、皿がガラスであることが重要です。

150ミリメートルのプラスチック製ペトリ皿を外側のせん断テンプレートに合わせます。回転工具を使用して、100ミリメートルの皿の中央に3つの3ミリメートルの穴を開けます。穴あけから生じたプラスチックの削りくずをすべて取り除きます。

100mmのシャーレを手袋をはめた手で持ちながら、シャーレの上端を反転させ、塩化メチレンのプールに約3秒間浸します。余分な塩化メチレンが100ミリメートル皿から滴り落ちるのを待ってから、濡れた皿の端を150ミリメートル皿の中央にすばやく移します。100ミリメートルの皿をマークされたテンプレートに慎重に位置合わせします。

100mmディッシュを時計回りと反時計回りに数回ゆっくりと回転させて、150mmディッシュにしっかりと接着します。塩化メチレンが乾いたら、新しくバインドされたペトリ皿を裏返し、接触点を注意深く検査します。タイトシールが完全に形成されていない場合は、トランスファーピペットで3mmの穴から0.5ミリリットルの塩化メチレンを注入します。

皿を手に取り、ゆっくりと回転させて、塩化メチレンが端に到達するようにします。2つのペトリ皿の間にしっかりとシールが形成されていることを確認した後、3mmのシリコーンゴムシーラントを塗布して、100mmディッシュの穴を塞ぎます。平らなカッティングヘッドを取り付けた回転工具を使用して、15ミリメートルのコノコールポリスチレン組織培養チューブの上部3センチメートルの部分を切り取り、チューブの少なくとも1センチメートルをキャップの下に残します。

カッティングヘッドの平らな面を使用して、カットチューブの端を滑らかで平らになるまで磨きます。研削によって生じたプラスチックの削りくずをすべて取り除きます。マーカーで、切り取った15ミリリットルのコンコールチューブを、ディッシュの端から約0.5センチメートル離れた150ミリメートルの皿の蓋になぞります。

描いた円の内側に穴を開け、円の端から約1〜2ミリメートルのマージンを残します。切り取ったコノコールチューブの上部をドリルで開けた穴の上に置きます。トランスファーピテットを使用して、コノコールチューブの切断された端に約4分の1ミリリットル、または250マイクロリットルの塩化メチレンを塗布して、コノコールチューブを150ミリメートルの蓋に結合します。

最後に、上部のペトリ皿の内側の端に厚さ1mmのシリコーンゴムシーラントのビーズを塗布することにより、150ミリメートルの蓋を150ミリメートルの皿に密封します。組み立てたシアーリングの概略図を示します。青色はめっきされた内皮細胞の領域を表しています。

外側と内側の赤い矢印は、オービタルシェーカーに置いたときのシアーリングとシアーリング内の媒体の軌道運動を示しています。滅菌の準備として、15 mmのコノコールチューブポートを介して、新たに形成されたシャーリングに約10 mmのPBSをピペッティングします。渦を巻いて、せん断リング内の破片を取り除きます。

パスツールピペットと真空吸引器でPBSを取り外します。すべての破片が取り除かれるまで、PBS洗浄を繰り返します。せん断リングを滅菌するために、70%エタノールリンスとUV照射の組み合わせが使用されます。

通気口のあるキャップを緩め、アクセスポートから約10ミリリットルの70%エタノールをピペットで動かし、キャップをねじ込みます。シアーリングを複数回回転させて裏返し、シアーリングの内側が完全に洗われるようにします。組織培養フードの下で、余分な70%エタノールを吸引します。

スプレーボトルで、アクセスポートとキャップに70%エタノールを十分にスプレーします。次に、せん断リングとキャップをUV放射の下に組織培養フードに置き、完全に乾くまで置きます。せん断リングが乾いたら、キャップをねじ込みます。

滅菌したシャーリングは、細胞培養プレーティングに使用するまで室温で保管してください。せん断応力試験の準備として、まず、標準的な細胞培養プロトコルに従って、滅菌したせん断リングに内皮細胞をプレート化します。フロースタディを開始する前に、培養物がコンフルエントに達するまで待ちます。

細胞がコンフルエントに達したら、実験用せん断リングをインキュベーターの一番下の棚に置かれたオービタルシェーカーに置き、棚のストレスと振動を最小限に抑えます。静的制御群のせん断リングを同じインキュベーター内に配置します。せん断応力がかかる所望の期間、シェイカーにせん断リングを放置します。

細胞層を所望の時間せん断にさらした後、インキュベーターからせん断リングを取り外します。せん断リングの蓋を引き抜き、目的のエンドポイント分析のために細胞や培地を取り出します。せん断リングを開けた後、研究者はいくつかの方法を使用して分析用の細胞と培地を回収できることに注意してください。

示されているのは、48時間の周期的な流体せん断または静電気曝露後のせん断リングにおけるヒトCMEC D3脳内皮細胞単層の出現の代表的な結果であり、培養物の整列が矢印で示された流れ方向と常に平行ではないことが観察された。周期的なせん断に対する一部の応答は、ラット網膜微小血管内皮細胞単層に示されています。せん断リングでの72時間の周期的な流体せん断により、ベータアクチン負荷制御と比較して、血小板内皮細胞接着分子が大幅に減少しました。

一度習得すると、いくつかのせん断リングは、適切に実行されれば、約3時間で構築することができますこの手順を試みる際には、慎重に内側の皿と外側の皿を位置合わせし、それらの間にタイトなシールが形成されることを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、内皮細胞の周期的な流体流動およびせん断応力研究をIn Vitroで実施する簡単な方法として、せん断リングの構築方法と使用方法について十分に理解できるはずです。塩化メチレンでの作業は危険である可能性があり、必要な手順を実行する際には、ドラフトの下での作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。