「せん断リング」の組み立てと応用：小説内皮軌道、単方向および定期的な流動のためのモデルとせん断応力

このモデルの全体的な目的は、内皮細胞を用いたin vitroでの周期的な流体フローおよびせん断応力研究のための、簡便かつ経済的な手法を構築することです。この手法は、周期的なせん断が内皮細胞の形状、構造、および機能にどのような影響を与えるかといった、内皮細胞生理学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

この手法の主な利点は、簡便に組み立て可能な組織培養装置を使用することで、細胞応答の評価に適した比較的広い表面積を確保できることです。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の医学生であるLuke White氏が行います。まず、プレゼンテーションソフトを使用して、外径150 mmのプロファイルと同心円状に配置された内径100 mmの円を持つ、シアリング構築用テンプレートを作成することから始めてください。

テンプレートをA4サイズの白い用紙に印刷します。十分な換気設備を備えたドラフトチャンバー内で、手袋を着用し、10 mLの塩化メチレンを150 mmのガラス製ペトリ皿にピペッティングして加えます。塩化メチレンはほとんどのプラスチックを溶解させるため、必ずガラス製の皿を使用してください。

150 mmのプラスチック製ペトリ皿を外側せん断テンプレートに合わせて配置します。ロータリーツールを使用して、100 mmの皿の中央に直径3 mmの穴を3か所開けます。ドリリングで発生したプラスチックの切屑を取り除きます。

手袋を着用した手で100 mmペトリ皿を持ち、皿の上端をメチレンクロリドのプールに約3秒間浸します。100 mm皿から余分なメチレンクロリドを滴り落とした後、濡れた皿の端を150 mm皿の中央へ迅速に移動させます。印をつけたテンプレートに合わせて、100 mm皿を慎重に配置してください。

100 mmディッシュを時計回りおよび反時計回りに数回ゆっくりと回転させ、150 mmディッシュにしっかりと接着させます。塩化メチレンが乾燥したら、接合したペトリ皿を裏返し、接触点を慎重に検査します。完全に密閉されていない場合は、トランスファーピペットを用いて、3 mmの穴から0.5 mLの塩化メチレンを注入してください。

ディッシュを持ち上げ、ゆっくりと回転させて塩化メチレンを端まで行き渡らせます。2枚のペトリ皿の間が密に密閉されていることを確認した後、100 mmディッシュの穴にシリコンゴムシーラントを3 mmのビーズ状に塗布して封止します。平切削ヘッドを装着したロータリーツールを用いて、15 mmコニコールポリスチレン組織培養チューブの上部3 cmを切り取り、キャップの下に少なくとも1 cmのチューブが残るようにします。

カッティングヘッドの平らな面を使用して、切断したチューブのエッジを滑らかで平坦になるまで研磨します。研磨によって生じたプラスチックの削り屑を取り除きます。マーカーを用いて、切断した15 milliliterのコニカルチューブの輪郭を、150 millimeterディッシュの蓋の端から約0.5 centimeters離れた位置に書き写します。

描いた円の内側に穴を開けます。この際、円の端から約1〜2 mmの余裕を持たせてください。切り取ったコニコールチューブの上部を、開けた穴の上に配置します。トランスファーピペットを使用して、コニコールチューブの切り口に塩化メチレンを約0.25 mL（250 µL）塗布し、コニコールチューブを150 mmの蓋に接着させます。

最後に、上のペトリ皿の内周に1 mm厚のシリコンゴムシーラントを塗布し、150 mmの蓋を150 mmの皿に密閉します。組み立てられたシールリングの概略図が示されています。青色の部分は、内皮細胞が播種された領域を表しています。

外側と内側の赤い矢印は、オービタルシェーカーに設置した際のシアリングリングおよびシアリングリング内部の培地の軌道運動を示しています。滅菌の準備として、15 mLコニコールチューブポートを介して、新しく作製したシアリングリングにPBSを約10 mLピペッティングします。回転させてシアリングリング内部のゴミを取り除きます。

パスツールピペットと吸引装置を用いてPBSを除去します。すべてのデブリが取り除かれるまで、PBSでの洗浄を繰り返します。シアリングリングを滅菌するため、70%エタノールによるすすぎとUV照射を組み合わせて行います。

ベントキャップを回して外し、アクセスポートから70% ethanolを約10 millilitersピペットで注入し、キャップを締め直します。シアリングを数回回転させ、裏返して、シアリングの内側が十分に洗浄されるようにします。組織培養フード内で、余分な70% ethanolを吸引除去します。

スプレーボトルを用いて、アクセスポートとキャップに70%ethanolを十分に吹き付けます。次に、シアリングリングとキャップを組織培養フード内のUV照射下に置き、完全に乾燥させます。シアリングリングが乾燥したら、キャップを締め直します。

滅菌済みのシアーリングは、細胞培養の播種に使用するまで室温で保存してください。せん断ストレス試験の準備として、まず標準的な細胞培養プロトコルに従い、滅菌済みのシアーリングに血管内皮細胞を播種します。フロー試験を開始する前に、培養細胞をコンフルエントまで増殖させてください。

細胞がコンフルエントに達したら、棚のストレスと振動を最小限に抑えるため、インキュベーターの最下段棚に設置したオービタルシェーカーの上に、実験用せん断リングを配置します。静止対照群のせん断リングも同じインキュベーター内に配置します。せん断ストレスを適用したい所定の時間、せん断リングをシェーカーの上に保持します。

細胞層を所定の時間せん断にさらした後、インキュベーターからせん断リングを取り出します。せん断リングの蓋を外し、目的のエンドポイント解析用の細胞および培地を回収します。せん断リングを開封した後、研究者はいくつかの方法を用いて解析用の細胞と培地を回収できることに留意してください。

図に示すのは、48時間の周期的な流体剪断ストレスまたは静的な曝露後における、剪断リング内でのヒトCMEC D3脳内皮細胞単層の外観の代表的な結果である。細胞培養の配向は、矢印で示された流れの方向と常に平行であるとは限らないことが観察された。周期的な剪断ストレスに対する一部の応答を、ラット網膜微小血管内皮細胞単層において示している。剪断リング内での72時間の周期的な流体剪断ストレスにより、Beta-actinローディングコントロールと比較して、血小板内皮細胞接着分子（Platelet-endothelial cell adhesion molecule）が有意に減少した。

一度習得すれば、適切に行うことで、約3時間で複数のシアリングを製作することが可能です。この手順を実施する際は、内皿と外皿を慎重に合わせ、両者の間に密閉されたシールが形成されていることを確認することが重要です。このビデオを視聴することで、血管内皮細胞を用いたin vitroでの周期的な流体フローおよびせん断応力研究を行うための簡便な方法として、シアリングの製作および使用方法を十分に理解できるはずです。塩化メチレンの取り扱いは危険を伴う可能性があるため、それが必要な工程を行う際は、常にドラフトチャンバー内で作業するなど、十分な予防措置を講じてください。