従来のUVレーザー共焦点顕微鏡を用いて細胞ストレスと死のトリガ

この細胞アブレーションアプローチの全体的な目標は、細胞培養または生きた動物の個々の細胞を選択的にストレスまたは殺すことです。この方法により、研究者は、死にかけている単一の細胞の運命と、周囲のアブレーション部位に対するミクログリアやアストロサイトなどの細胞の応答を研究することができます。この技術の主な利点は、個々の細胞を正確に標的にできることであり、これは405ナノメートルのレーザーを備えた通常の共焦点顕微鏡で達成できることです。

ゼブラフィッシュをモデルシステムとして、運動ニューロン疾患や前頭側頭型認知症などの神経変性疾患を研究しています。運動ニューロンの死とその後の結果を視覚化することは、病気に関与する動的プロセスをよりよく理解する絶好の機会を提供します。用量依存的な方法で細胞ストレスを与えるという私たちのアプローチは、細胞相互作用の詳細な特性評価を可能にします。

例えば、神経死後のミクログリアクリアランス。この方法は、生物の疾患メカニズムに関する洞察を提供しますが、培養中の単離細胞にも同様に適用できます。テキストプロトコルに従って交配用のオスとメスのトランスジェニック系統を設定した後、プラスチック製のティーストレーナーを使用して、タンクの水を濾して産卵が成功した後に胚を収集します。

次に、卵水を使用して卵をすすぎ、シャーレの卵水に移します。受精を決定するために、光学顕微鏡で胚を検査します。次に、受精卵を摂氏28度で孵化させます。

受精後またはDPF後2〜5日に達したら、蛍光化合物顕微鏡にかけ、胚の蛍光色素発現が適切かどうかをスクリーニングします。次に、明るくラベル付けされた魚を卵水を入れた新鮮な皿に分けて、後で埋め込みます。ゼブラフィッシュをアガロースに埋め込むには、卵水が入ったシャーレにMS 222を1リットルあたり4グラムずつ滴下して麻酔液を調製します。

低融点アガロースと卵水のストックを準備し、1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分注します。アリコートを摂氏38〜40度のヒートブロックに入れ、平衡化させます。4時間を超えるイメージング時間の場合は、ガラス底の皿の内側の円に沿って約300マイクロリットルのアガロースをピペットで動かし、中央に小さな開口部があるドーナツ型の円を準備します。

ゼブラフィッシュを顕微鏡検査のためにアガロースに装着するには、テキストプロトコルに従って魚に麻酔をかけた後、調整可能なピペットを使用して幼生を引き上げ、先端の底まで沈めます。幼虫を最小限の液体で予熱したアガロースに落とします。次に、アガロースで魚を引き上げ、事前に準備したガラス底の35ミリメートル皿にすばやく注ぎます。

解剖顕微鏡で、標準的な絵筆を使用して、動物または複数の動物をアガロース内の側面に配置し、体と尾が平らになるようにします。アガロースがしっかりと固まるまで、埋め込まれた魚を10〜15分間座らせます。次に、約2ミリリットルの卵水とトリカインを使用して、35ミリメートルのペトリ皿を慎重に補充します。

幼虫が埋め込まれたペトリ皿を共焦点顕微鏡ステージに置き、明視野照明と40倍の倍率を使用して、動物の脊髄の背側に焦点を合わせます。適切な蛍光設定に切り替えて目的の構造を視覚化し、すべてのイメージングパラメータがその後のアブレーションに必要なものであることを確認します。UVレーザーアブレーション用の構造の厚さを決定するには、Zドライブを使用して、手動で上下に焦点を合わせることにより、対象の構造の上部と下部を確認します。

アブレーションされるZ平面を手動で記録します。たとえば、セルの中心などです。レーザーアブレーションを実行するには、ソフトウェアメニューの上部にあるドロップダウンメニューをクリックしてFRAPウィザードを開始します。

新しいウィンドウで、フォーマット、スキャン速度、および平均化を選択して、アブレーションアプローチの画像パラメータを決定します。アブレーション用のZ面がまだ選択されていない場合は、Liveボタンを押して、蛍光構造またはアブレーション対象のZ面にピントが合うまで試料にピントを合わせます。一般的な画像パラメータを設定したら、ブリーチステップにアクセスして、特定のアブレーションコンポーネントを制御します。

次に、405ナノメートルレーザーを活性化して漂白手順に使用します。次に、ズームインオプションを使用して、スキャンフィールドを縮小することで選択したROIでの漂白強度を最大化し、滞留時間を最大化します。アブレーションの 1 つまたは複数の ROI を、Image Acquisition ウィンドウの描画ツールのいずれかを使用して選択します。

たとえば、軸索ヒロックを約4〜8マイクロメートルの円形描画ツールでターゲットにします。ROIを設定したら、[Time Course]ボタンを選択し、ROIがスキャンおよびアブレーションされるサイクル数を確認します。必要に応じて「プレブリーチ」フレームと「ポストブリーチ」フレームを選択すると、ブリーチプロセスの直前と直後の画像全体の概要を確認できます。

これらの設定により、研究者は複数のレイヤーを改良することができます。この技術は、レーザー出力、スキャン速度、ライン平均化、関心領域のサイズ、および繰り返しの調整を通じて、個々の細胞にストレスや死を引き起こすための高い自由度を提供します。必要なアブレーションパラメータをすべて設定したら、[Run Experiment]を押してアブレーションの効率を監視します。

詳細については、テキストプロトコルを参照してください。この実験では、トランスジェニックゼブラフィッシュの脊髄にあるGFP発現運動ニューロンに対してUVレーザーアブレーションを行いました。3 MINX one、IO one、METなどの運動ニューロンプロモーターによって駆動されるGFP発現により、細胞体、主軸索、および筋肉に伸びる末梢枝を高解像度で可視化できます。

脊髄のニューロンのアブレーションが成功するのは、アブレーションの直後に蛍光が薄れ、再開しない場合です。このアプローチの特異性は、ここで示したように、光変換可能なフォトフルオロKaedeを使用して単一の標的ニューロンを変換し、UV光への曝露後に発光を緑から赤に切り替えることで確認されています。異なる強度の細胞を標的とするために、レーザー出力、スキャン速度、ライン平均化、アブレーションするROIのサイズ、および繰り返しを調整することにより、複数の微調整層が利用可能です。

ここに示すように、UVレーザー強度が低い体細胞でアブレーションされた長い軸索突起を持つ運動ニューロンは、体細胞から軸索に沿って経時的に持続する特徴的なブブレングを示しました。この手順を試行する際は、各共焦点セットアップが一意であり、各機器のレーザー出力は固有であり、異なる場合があることを覚えておくことが重要です。手順の後、アポトーシス細胞死の特徴的な特徴がアブレーションされたニューロンに見られます。

XN 5などのアポトーシスマーカーや、体液変性や外部ブレブなどの形態学的変化を再現性よく検出できます。脊髄の単一または複数のニューロンのアブレーションによって水泳パフォーマンスがどのように影響を受けるかなど、さらなる疑問に答えるために、追加のテストを実施することができます。研究者は、異なるトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を交配することにより、レーザーによる細胞破壊に対する他の細胞の応答を調べることができます。

これらの方法は、MNDのような疾患のin vivoでの正確な分子メカニズムを理解するためのユニークな実験プラットフォームを提供します。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの共焦点顕微鏡法の準備方法と、シングルセルUVレーザーアブレーションの実施方法について十分に理解できるはずです。