成体ラット心臓からの高品質心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の同時単離

この手順の全体的な目標は、ラットの心臓から生存可能な心筋細胞、内皮細胞、および線維芽細胞を同時に分離し、個々のin vitro分析を行うことです。この方法は、心肥大、虚血再灌流障害、内皮機能、および心線維症に関与するシグナル伝達メカニズムに関する心血管領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、主要な心臓細胞をすべて同時に単離できるため、関連する研究コストと実験動物の数を削減できる可能性があることです。

蒸留水1本と50ミリリットルのパウエル培地フラッシュ1杯の後、培地を80ミリリットルの新鮮なパウエル培地と交換し、ガラスシリンダーのガラスパスツールピペットを使用して、培地にカルボゲンを連続的に灌流します。次に、2対の細い湾曲した鉗子を使用して、大動脈を介して採取したばかりのラット心臓をランゲンドルフ灌流システムに取り付け、灌流システムのカニューレの端を最初の大動脈枝と大動脈弁の間に配置します。ワニ型クランプで大動脈を固定します。

カニューレの弁を開き、次に外科的縫合糸で心臓を固定します。35ミリリットルの灌流培地を心臓の点眼線に通過させ、残留血液を取り除きます。収集漏斗を心臓の下に置き、蠕動ポンプを開始して、収集漏斗から貯水池に灌流媒体を再循環させます。

灌流培地にコラゲナーゼ溶液を加え、再循環コラゲナーゼ溶液で心臓に30分間灌流します。消化の終わりに、はさみを使用してランゲンドルフシステムから心臓を取り出し、ガラスのペトリ皿に入れます。次に、心房と残りの脂肪組織の両方を心臓から取り除きます。

上皮細胞の汚染を避けるために、2つの鉗子を使用して心膜を慎重に剥がします。心臓を真ん中で切り取り、半分をティッシュチョッパーに入れます。心臓を2〜3回ミンチにし、組織片をランゲンドルフ灌流からの消化緩衝液12ミリリットルを含む15ミリリットルの円錐管に移します。

ティッシュ断片を水浴で5〜10分間消化し、時々5ミリリットルの使い捨てプラスチックピペットと混合します。次に、細胞懸濁液を100マイクロメートルのふるいで50ミリリットルの円錐管にろ過します。灌流システムを最低1リットルの蒸留水で洗い流し、続いて100ミリリットルの0.1正常水酸化ナトリウムを30分間洗い流し、次にさらに2〜3リットルの蒸留水でシステムを洗い流し、洗浄した空気で装置を乾燥させます。

ろ過した細胞を遠心分離で回収し、使い捨てピペットを使用して、上清を含む内皮細胞と線維芽細胞を新しい50ミリリットルのチューブに慎重に移します。ペレットを6ミリリットルのカルシウム溶液1に再懸濁します。1分後、2回目の遠心分離で細胞を回収し、ペレットを6ミリリットルのカルシウム溶液2に再懸濁します。

1分後、12ミリリットルのカルシウム溶液3を加えて細胞懸濁液を希釈し、穏やかに傾けてよく混合します。別の遠心分離の後、ペレットを20ミリリットルの予熱したCCT培地に再懸濁します。次に、ラミニンで事前にコーティングされた20の滅菌35mm細胞培養皿のそれぞれに1ミリリットルの細胞を分注し、細胞を二酸化炭素を含まない細胞培養インキュベーターに入れ、培地を2ミリリットルの新鮮なCCT培地と交換して、2時間後に死んだ細胞を取り除きます。

次に、内皮細胞と上清を含む線維芽細胞を遠心分離し、ペレットを1.5ミリリットルの内皮細胞単離バッファーに再懸濁します。細胞を2ミリリットルのサンプルチューブに移し、マウス抗ラットCD31抗体を細胞に添加し、摂氏4度で30分間インキュベーションし、端から端まで回転させます。インキュベーションの最後に、Pan anti-mouse IGG beads を 20 in インキュベーション、摂氏 4 度、端から端まで回転させて追加します。

ビーズインキュベーションの最後に、細胞を磁気ラックに2分間置き、1ミリリットルのピペットを使用して、主に線維芽細胞を含む上清を慎重に除去します。10ミリリットルの線維芽細胞培養培地が入った10cmの培養皿で線維芽細胞を観察し、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%の細胞培養インキュベーターに1時間置きます。次に、内皮細胞のチューブに1ミリリットルの洗浄バッファーを加え、チューブにキャップをします。

細胞を4〜5回静かに振って、ビーズを再懸濁します。次に、チューブを磁石に戻し、1分後に洗浄バッファーを取り外します。最後の洗浄後、洗浄バッファーを1ミリリットルのMV2内皮細胞培養培地と交換し、内皮細胞を12ウェルプレートの1つのウェルに播種して、細胞培養インキュベーターで一晩培養します。

線維芽細胞のインキュベーション終了時に、付着した細胞を予め温めたPBSを適量で2〜3回洗浄します。次に、予め温めた新鮮な線維芽細胞培養培地を細胞に加え、線維芽細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。翌朝、内皮細胞培養の上清を新鮮な内皮細胞培養培地と交換し、細胞をインキュベーターに戻し、2〜3日ごとに培地を交換します。

次に、付着した線維芽細胞の培養物を、先ほど示したように、あらかじめ温めた新鮮なPBSで洗浄し、細胞にあらかじめ温めた新鮮な培地を送ります。心筋細胞の単離手順により、純度70〜80%の生存可能な棒状の横紋心細胞集団が得られます。その後、心筋細胞の虚血再灌流に応答して、fura AMをロードした単離心筋細胞の細胞内カルシウム振動解析を行うとともに、ATP添加後の磁気ビーズ単離内皮細胞および線維芽細胞におけるカルシウムシグナル伝達の変化の解析を行うことができます。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3時間で完了できます。この手順を試みるときは、この灌流システムを適切にセットアップし、準備ができたらすぐに心臓をシステムに固定することを覚えておくことが重要です。開発後、この技術は、心血管研究の分野の研究者がさまざまな心血管病態生理学に関与するシグナル伝達を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、心細胞の単離と培養の基本的な原理を十分に理解できるはずです。手術器具や細胞培養試薬の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、器具の慎重な使用や手袋の使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。