Name: 成体ラット心臓からの高品質心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の同時単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶLangendorff灌流系を用いたラット心臓からの心筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞の同時単離法。高生存率の細胞を得て心血管研究のコストと動物使用数を削減する効率的なプロトコルです。

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L. Rinaldi、S.Schäffer、D. Reitz、H. Thomas、A. Weberの技術サポートは感謝しています。著者はまた、広範囲にわたる校正と原稿の言語編集に感謝したいと思います。この研究はGiessen Anschubsfinanzierungの助成によりM. AslamとD.Gündüzに付与されました。

<ol><li>Zaragoza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal models of cardiovascular diseases.</a> J Biomed Biotechnol. 2011, 497841(2011).</li>
<li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-1+cells%3A+a+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).</li>
<li>Barbieri, S. S., Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+cooperates+with+interleukin-1beta+to+alter+beta-catenin+trafficking+in+vascular+endothelium+resulting+in+increased+permeability+and+induction+of+cyclooxygenase-2+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo.</a> FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).</li>
<li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li>
<li>Xu, X., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+adult+rat+heart+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of adult rat heart myocytes.</a> J Vis Exp. (28), (2009).</li>
<li>Gündüz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+extracellular+ATP+protects+against+acute+reperfusion+injury+in+rat+heart+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.Res%22%5BJournal%5D)">Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells.</a> Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).</li>
<li>Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+metabolism+in+cultured+adult+rat+cardiac+fibroblasts%3A+response+to+angiotensin+II+and+aldosterone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone.</a> J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).</li>
<li>Shahzad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+involved+in+postconditioning+protection+of+cardiomyocytes+against+acute+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).</li>
<li>Gündüz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+Stabilizes+Microvascular+Endothelial+Barrier+Function+via+Phosphatidylinositol+3-Kinase%2FAkt-Mediated+Rac1+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation.</a> Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).</li>
<li>Lipps, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+fragment+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+triggers+pro-inflammatory+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro.</a> J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).</li>
<li>Abdallah, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Ca2%2B+cycling+and+mitochondrial+permeability+transition+pores+promotes+reperfusion-induced+injury+of+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes.</a> J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).</li>
<li>Gündüz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ticagrelor+on+endothelial+calcium+signalling+and+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function.</a> Thromb Haemost. , (2016).</li>
<li>Gündüz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+effects+of+ATP+and+adenosine+on+barrier+function+of+rat+coronary+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol.Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature.</a> J Mol.Cell Cardiol. , (2012).</li>
</ol>

著者は宣言することは何もない。

この記事では、心筋細胞、内皮細胞、および線維芽細胞の単離および培養のための再現可能なプロトコールが記載されている。このプロトコルは、ただ1つの細胞型ではなく、心臓組織、 すなわち心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の主要な細胞型の同時かつ高品質の単離を記載する。単離手順の重要なステップは、心臓組織の適切な消化である。消化が不完全であれば、多数の筋細胞が依然として得られるかもしれませんが、その品質は非常に悪く、大部分は収縮が大きく丸められており（ 図2B ）、実験では価値がありません。さらに、内皮細胞および線維芽細胞の収率も低下する。この問題は消化時間を制御することで解決できます。灌流システムから心臓を取り外す前に、鉗子と指先の助けを借りて心臓の柔らかさをチェックすることができます。組織が依然として目立たない場合心臓はさらに5〜10分間灌流することができる。健康な心筋細胞単離における第2の重要なステップは、単離緩衝液中のCa 2+の徐々の回復である。培地中の高濃度のCa 2+の急速な回復は、丸い心筋細胞を生じる。緩衝液の調製に使用される水の品質は...

げっ歯類のモデルは、健康や病気の心血管生理学の理解を広げるためのツールとして長い間使われてきました。これらの動物モデルは、臓器レベルで疾患の病態生理を理解し、心血管疾患の治療に使用される様々な薬理学的薬剤の薬物動態および薬力学を分析することを可能にするが、心血管疾患発症の分子メカニズムの理解および細胞型は、 インビトロ細胞培養モデルの使用を必要とする。この目的のために、心臓血管系からの異なる不死化細胞株が開発された。しかしながら、新たに単離された初代細胞は、生理学的および機能的に生きた組織および生物に関連している。 心臓は、心臓血管のあらゆる主要なタイプの細胞を含む汎用性のある臓器であるラット心臓は依然として心臓血管生理学の理解のために一般的に使用されているモデルである。ここ数十年の間に、個々の細胞型を心臓組織から単離するための異なる方法が記載されている。しかし、これらの方法は、ある特定の細胞型の単離にのみ焦点を当て、細胞分析のためにもはや使用することができない他の型の細胞を喪失させる。ここでは、主要な細胞タイプの心臓組織、すなわち心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の同時かつ高品質の単離を可能にする最適化されたプロトコールが記載されている。これらの細胞型はすべて、異なる実験設定8,9,10および同じ動物の細胞 - 細胞相互作用の分析に使用することができる。

<table><tbody><tr><td>反vWF</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジー。</td><td>SC-14014</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>メルク</td><td>102378</td><td></td></tr><tr><td>カルニチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼII型</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Creatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0780</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Dil-Ac-LDL</td><td>Thermo Scientific</td><td>L3484</td><td></td></tr><tr><td>EDTA溶液 (0.2 M)</td><td>Biochrome AG</td><td>L2113</td><td></td></tr><tr><td>包埋液</td><td>Citiflour</td><td>AF1-25</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞培地 MV2</td><td>PromoCell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS)</td><td>Biochrome AG</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Serva Chemicals</td><td>47991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>アボット</td><td>TU 061219</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン&nbsp;</td><td>Roche/Sigma</td><td>11243217001</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150059</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium (Powder)</td><td>Biochrome AG</td><td>T061</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-81051</td><td></td></tr><tr><td>NaCl solution (0.9%), Sterile</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td>30820080</tr><tr><td>Pan mouse IgG ビーズ (Dynabeads)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11041</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA) 4% 溶液</td><td>Santa Cruz Biotech.</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Thermo Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1x&nbsp;</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック消耗品</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Merck</td><td>4933</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>Merck</td><td>7873</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム溶液 (2 N)</td><td>Merck</td><td>109136</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み濾過システム</td><td>Thermo Scientific</td><td>5660020</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO</td><td>Thermo Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Water, Sterile</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成体ラット心臓からの高品質心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の同時単離

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

ラットは、心臓血管研究で使用される重要な動物モデルであり、心臓肥大、線維症、およびアテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患進行の分子メカニズムのインビトロ分析のためにラットの心臓細胞が日常的に使用される。これらの細胞機構を理解するために、循環系から不死化細胞株を開発するために様々な試みがなされてきたが、初代細胞は、そのような研究のためにより自然かつ近似したin vivo環境を提供する。したがって、特定の細胞型に取り組んでいる異なる研究室では、目的のラット心臓細胞の個々の型を単離するためのプロトコールが開発されている。しかし、複数の細胞タイプの分離を可能にするプロトコルは欠けている。ここでは、単一の調製物から高品質の主要な心臓細胞型（心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞）の単離を可能にする最適化されたプロトコールが記載されており、細胞分析に使用する。これにより、利用可能なリソースを最も効率的に使用することができ、時間を節約し、研究費を削減することができます。

<html>単離手順は、計画された実験のために使用することができる70〜80％の生存可能な棒状の線条体心筋細胞（ 図2Aおよび2C ）の収率をもたらす。私たちの研究室では、心筋細胞はCa 2+シグナル伝達の解析に日常的に使用されています。 図5Aは、Fura-AM（5μM）を負荷した心筋細胞における虚血/再灌流に応答する細胞内カルシウム[Ca 2+ ] i振動を示す。 図5Bは、ATP（100μM）添加後の内皮細胞および線維芽細胞における[Ca 2+ ] iの変化を示す。種々の心臓細胞型における[Ca 2+ ] iの変化を以前に記載されたように分析した。 6,11,12 <p c...

ラット心臓から様々な心臓細胞型を単離するためのいくつかのプロトコールが開発され、記載されている。ここでは、単一の調製物から高品質の主要な心臓細胞型（心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞）の単離を可能にし、実験コストを削減する最適化プロトコルが記載されている。

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

本手順の目的は、ラット心臓から生存可能な心筋細胞、血管内皮細胞、および線維芽細胞を同時に単離し、個別にin vitro解析を行うことです。この手法は、心肥大、虚血再灌流障害、内皮機能、および心線維化に関与するシグナル伝達メカニズムに関する、心血管領域における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、主要な心細胞をすべて同時に単離できるため、関連する研究コストや実験動物数を削減できる可能性があることです。蒸留水と50 mLのPowell培地でそれぞれ1回ずつ洗浄した後、培地を80 mLの新鮮なPowell培地に交換し、ガラスシリンダーからガラスパステールピペットを用いて、培地にカルボゲンを連続的に灌流させます。次に、2組の細い曲鉗子を用いて、採取したばかりのラット心臓を大動脈経由でLangendorff灌流装置に装着し、灌流装置のカニューレの先端を第一大動脈分枝と大動脈弁の間に配置します。大動脈をクロコダイルクランプで固定します。カニューレのバルブを開き、外科用縫合糸で心臓を固定します。灌流液35 millilitersを心臓に滴下させ、残留血液をすべて除去します。心臓の下に回収漏斗を配置し、ペリスタルティックポンプを作動させて、回収漏斗からリザーバーへ灌流液を再循環させます。コラゲナーゼ溶液を灌流液に加え、再循環させるコラゲナーゼ溶液を用いて心臓を30分間灌流します。消化終了後、ハサミを用いて心臓をランゲンドルフ装置から取り出し、ガラス製ペトリ皿に移します。次に、両心房および心臓に残っている脂肪組織を除去します。上皮細胞の混入を避けるため、2本のピンセットを用いて心膜を慎重に剥がします。心臓を中央で切断し、その半分ずつを組織チョッパーに入れます。心臓を2〜3回細切し、組織片をLangendorff灌流に使用した消化緩衝液12 mLが入った15 mLコニカルチューブに移します。組織片をウォーターバスで5〜10分間消化し、その間、5 mL使い捨てプラスチックピペットで時々混合します。次に、細胞懸濁液を100 µmのフィルターでろ過し、50 mLコニカルチューブに回収します。灌流システムを、最低1 Lの蒸留水で洗浄した後、0.1 N 水酸化ナトリウム 100 mLで30分間洗浄し、さらに2〜3 Lの蒸留水でシステムを洗浄して、装置をエアブローで乾燥させます。遠心分離によりろ過した細胞を回収し、ディスポーザブルピペットを用いて、血管内皮細胞と線維芽細胞を含む上清を新しい50 milliliterチューブに慎重に移します。ペレットを6 milliliterのcalcium solution oneで再懸濁します。1分後、2回目の遠心分離で細胞を回収し、ペレットを6 milliliterのcalcium solution twoで再懸濁します。1分後、カルシウム溶液3を12 mL添加して細胞懸濁液を希釈し、緩やかに傾けて十分に混ぜ合わせます。再度遠心分離を行った後、あらかじめ加温しておいたCCT培地20 mLでペレットを再懸濁します。次に、ラミニンをあらかじめコーティングした滅菌済みの35 mm細胞培養ディッシュ20枚に、細胞を1 mLずつ分注し、二酸化炭素を含まない細胞培養インキュベーターに入れます。2時間後、死細胞を除去するために培地を新鮮なCCT培地2 mLに交換します。次に、血管内皮細胞と線維芽細胞を含む上清を遠心分離し、ペレットを1.5 millilitersの血管内皮細胞分離バッファーで再懸濁します。細胞を2 milliliterのサンプルチューブに移し、マウスanti-rat CD31抗体を細胞に添加し、4 °Cでエンドツーエンド回転させながら30分間インキュベートします。インキュベーション終了後、Pan anti-mouse IGGビーズを添加し、4 °Cでエンドツーエンド回転させながら20分間インキュベートします。ビーズのインキュベーション終了後、細胞をマグネットラックに2分間静置し、1 mLピペットを用いて、主に線維芽細胞を含む上清を注意深く取り除きます。10 mLの線維芽細胞培養液を入れた10 cm培養皿に線維芽細胞を確認し、細胞を37 °C、5% CO2の細胞培養インキュベーターに1時間置きます。次に、血管内皮細胞の入ったチューブに1 mLの洗浄バッファーを加え、チューブに蓋をします。細胞を4〜5回静かに振盪し、ビーズを再懸濁させます。その後、チューブをマグネットに戻し、1分後に洗浄緩衝液を除去します。最後の洗浄後、洗浄緩衝液を1 mLのMV2血管内皮細胞培養培地に交換し、血管内皮細胞を12ウェルプレートの1ウェルに播種し、細胞培養インキュベーター内で一晩培養します。線維芽細胞のインキュベーション終了後、接着した細胞を予熱したPBSの適切な量で2〜3回洗浄します。次に、予熱した新鮮な線維芽細胞培養液を細胞に添加し、線維芽細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。翌朝、血管内皮細胞培養の上清を新鮮な血管内皮細胞培養液に交換して細胞をインキュベーターに戻し、半合流（semi-confluency）に達するまで2〜3日ごとに培地を交換します。次に、先ほど示したように、接着した線維芽細胞の培養物をあらかじめ温めておいた新鮮なPBSで洗浄し、あらかじめ温めておいた新鮮な培地を添加します。この心筋細胞単離手順により、純度70～80%の、生存した棒状で横紋のある心筋細胞群が得られます。その後、fura AMをロードした単離心筋細胞を用い、虚血再灌流に対する細胞内カルシウム振動解析を行うことができます。また、磁気ビーズで単離した内皮細胞および線維芽細胞において、ATP添加後のカルシウムシグナリングの変化に関する解析も可能です。この手法を習得すれば、適切に実施することで3時間で完了させることができます。本手順を行う際は、灌流システムを正しくセットアップし、準備が整い次第速やかにシステム内で心臓を固定することが重要です。この手法の開発により、心血管研究分野の研究者が、さまざまな心血管病理生理に関与するシグナル伝達を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、心細胞の分離および培養の基本原理について十分に理解していただけます。手術器具や細胞培養試薬の使用は極めて危険である場合があるため、器具の慎重な取り扱いや手袋の着用など、本手順の実施中は常に適切な予防策を講じることを忘れないでください。

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Biology

生物学

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成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養

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単成マウス心臓の心房と心室の両方から筋細胞と非筋細胞を同時に分離する方法について説明する。このプロトコルは、高生存性心筋細胞および非筋細胞の一貫した収量をもたらし、フェノタイピングおよびインビトロ分析のための最適な細胞特異的培養条件を詳述する。...

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

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マウス心筋細胞を一貫して単離するための簡単で効果的な方法

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