電気けいれん発作になったラットとシナプス後密度タンパク質のてんかん発作による変化を調べることで

電気制御性発作の誘発とその後の海馬の小規模分画の全体的な目標は、ラットの脳に全体的な発作活動を誘発し、海馬のシナプス後密度におけるタンパク質の発作活動誘発性変化を調べることです。この方法は、発作時に特定の脳領域でどのスナップティックタンパク質が調節されているか、そのような調節が神経可塑性に寄与するかどうかなど、映画の神経プロセスにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この電気けいれん性発作誘発プロトコルの主な利点は、ニューロン死を伴わずに、法の脳活動のローバル緩和を生き生きと誘導できることです。

手順を実演するのは、私とヒ・ジョン・チョン博士の研究室のハン・ギル・ジョンです。この手順を開始するには、雄のラットを蓋付きの清潔で空のケージに入れます。ラットを30分間慣らしてから、パルス発生器をECS誘導に設定します。

リセットボタンを押してパルス発生器を準備し、準備完了ボタンが点灯していることを確認します。パルス発生器にイヤークリップが取り付けられていないことを確認します。次に、ショックボタンを数秒間押してから、イヤークリップをパルスジェネレーターに差し込みます。

このステップでは、イヤークリップを滅菌生理食塩水で濡らし、それらが飽和していることを確認します。次に、ラットの耳を生理食塩水に浸したガーゼで包むことにより、滅菌生理食塩水で濡らします。濡れたらガーゼを外します。

片耳に1つのクリップでクリップを耳に取り付け、メイン軟骨バンドの外側に配置します。ショックボタンを数秒間押して、発作を観察します。偽の場合は、発作制御はなく、ラットを同じように扱いますが、電流は供給しません。

クローヌスが始まったら、イヤークリップを外し、1〜5の改訂されたラシーンスケールに従って発作行動を記録します。これには、ステージ4での4肢クローヌスでの飼育、ステージ5での4肢クローヌスでの飼育と落下が含まれます。発作は約10秒続くはずです。

タイマーを使用して発作時間を記録します。発作終了後、ラットを自宅のケージに戻します。ラットをさらに5分間監視して、発作からの回復を確認します。

ケージに単独で収納し、ケージを回復室に戻します。この手順では、1匹のラットから2つの海馬を30ミリメートルの組織培養皿に置き、ハサミを使用して細かく刻みます。その後、みじん切りにした海馬を手動ガラスホモジナイザーに移し、1ミリリットルの氷冷ホモジナイズバッファーを追加します。

次に、丸いペシルをガラスホモジナイザーに挿入します。ガラスホモジナイザーを氷の上に置いた状態で、海馬組織の小さな片が消えるまで、1分間、10〜15回、ペシルを優しく着実に上下にストロークします。次に、1マイルピペットを使用してホモゲノートを1.7マイルの微量遠心チューブに移し、ホモゲノートをGの800倍で摂氏4度で10分間遠心分離し、不溶性の組織と核を含むペレットから核後上清を分離します。

その後、S1画分の50マイクロリットルと950マイクロリットルを2本の別々の新しい1.7ミリリットル微量遠心チューブに移し、これらのチューブを氷上に保管します。また、P1フラクションペレットを氷上に保存します。続いて、950マイクロリットルのS1画分をGの13倍、800倍、摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞質可溶性タンパク質が豊富な上清と、シナプトソームタンパク質を含む膜結合タンパク質が豊富なペレットを分離します。

S2フラクションを新しい1.7ミリリットルの微量遠心分離機に移し、氷上に保存します。その後、P2フラクションペレットを498マイクロリットルの氷冷精製水に再懸濁します。1モルのヒープを2マイクロリットル加えると、最終濃度は4ミリモルのヒープになります。

懸濁液を摂氏4度で30分間攪拌しながらインキュベートします。30分後、再懸濁したP2画分を氷上に保存します。このステップでは、P2フラクションを25,000倍Gおよび摂氏4度で20分間遠心分離し、溶解した上清と溶解したペレットを分離します。

LS2フラクションを新しい1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移し、氷上に保存します。次に、LP1ペレットを250マイクロリットルに50ミリモルヒープで再懸濁し、250マイクロリットルの1パーセント洗剤と1×PBSを混合します。懸濁液を摂氏4度で静かに攪拌しながら15分間インキュベートします。

その後、再懸濁したLP1ペレットを25,000倍Gおよび摂氏4度で3時間遠心分離し、非PSDフラクション上清をPSDフラクションペレットから分離します。上清を1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移し、PSDペレットを100マイクロリットルの50ミリモルのヒープに再懸濁します。この図では、代表的なウェスタンブロットは、偽の海馬、発作のないラット、および急性ECSを受けたラットの海馬からのS2、P2、およびPSD画分におけるNMDA受容サブユニットGluN2B、ampa受容体、GluA2、およびSTEP61のタンパク質発現を示しています。

細胞質可溶性タンパク質α-チューブリンは、S2画分に富んでいます。シナプトフィジンはシナプス前小胞タンパク質であり、粗膜P2画分には濃縮されますが、PSD画分には濃縮されませんが、PSD-95はP2とPSDの両方の分画に濃縮されます。ここに示されているのは、急性ECSの3時間後と24時間後のP2およびPSD画分中のGluN2BおよびGluA2の定量化です。

P2画分におけるGluN2BおよびGluA2の発現は、S2画分におけるα-チューブリンに正規化されました。PSD画分におけるGluN2BおよびGluA2発現において、PSD画分におけるPSD95に正規化した。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば5〜6時間で完了します。

この手順に続いて、ECSによって他のシナプスタンパク質が変化するかという追加の質問に答えるために、タンパク質混合物に基づく質量、スペクターメトリーのような自動質量化を行うことができます。その開発後、この技術は、神経疾患の分野の研究者がシナプス機能障害の根底にあるメカニズムを探求する道を開きました。このビデオを見れば、法的な理由でECSを誘導する方法、海馬からの均質化とPSD分画を行う方法、ECS後のシナプスタンパク質の変化を調べる方法についてよく理解できるはずです。