Name: 電気けいれん発作になったラットとシナプス後密度タンパク質のてんかん発作による変化を調べることで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶ電気けいれん発作誘導法でラットの海馬におけるシナプス後密度タンパク質の変化を解析する手法。神経可塑性とうつ病治療のメカニズム解明に貢献します。

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著者は博士エリック C. ボルトンをありがとう PSD 分別のため小規模のプロトコルと私たちを提供するためのジョンズ ・ ホプキンス大学で博士リチャード ・ l. Huganir の研究室での分別および博士グラハム H. Diering 彼の遠心分離機を使用することが可能します。

動物科目を含むすべての実験手順は、機関の動物は気とイリノイ大学アーバナ ・ シャンペーン校で利用委員会によって承認されています。
1. ラット コロニーの維持
<ol><li>ラット (材料の表を参照) を繁殖し、12 時間の明暗サイクルとアドリブへの食料と水の標準的な条件でそれらを維持します。</li>
	<li>(P) 28 生後日ラットの子犬を引き離すし、2-4 の男性または女性の同腹子のグループにそれらの家します。</li>
	<li>非毒性の永久的な黒のマーカーで識別のためにラットの尾をマークします。</li>
	<li>週 3 回雄ラットの重さし、自分の bodyweights を記録します。</li>
</ol>2. ECS マシンの準備
<ol><li>7:30、駆除動物準備室のベンチとベンチに ECS マシン (パルス発生器) を配置します。</li>
	<li>ふた付きのきれいで、空のケージで 200-250 グラムの重量を量る個々 の雄ラットを配置します。ECS の誘導と扱われるすべての雄ラットのためにこれを繰り返します。30 分間、慣らすラットをしましょう。</li>
	<li>ラットは檻の中で娯楽 habituating、ECS 誘導用パルスジェネレーター ショック期間 0.5、0.5 ms のパルス幅 100 パルス/秒の周波数に設定 s、および電流 55 mA (図 1A)。</li>
	<li>パルス発生器を準備するには、「リセット」ボタンを押すと「準備」のボタンが点灯していることを確認します。耳クリップがパルス発生器に接続されていないと、数秒間の「ショック」ボタンを押していることを確認します。 注: この時点で、パルス発生器は ECS 誘導のため準備ができています。</li>
	<li>耳クリップをパルス発生器に差し込みます。</li>
</ol>3. 急性 ECS の誘導
注: 参照してください図 1B、トップ パネル。
<ol><li>滅菌生理食塩水で耳クリップを濡れているし、彼らが飽和していることを確認します。</li>
	<li>生理食塩水に浸したガーゼでそれらをラップすることによって滅菌生理食塩水でネズミの耳を濡れています。一度彼らはウェット、ガーゼを削除します。</li>
	<li>耳、軟骨の主要なバンドを越える位置ごとの 1 つのクリップを取り付けます。</li>
	<li>真のループが確立されている ECS マシンで確認します。ない場合は、エラー メッセージまたは「1」の読書がコンピューターに表示されます。</li>
	<li>厚い, 非金属製の手袋を着用します。手袋をはめた手でラットを軽く押しながら、数秒間の「ショック」ボタンを押すし、ゆっくりと発作を観察するラットのグリップを解放します。(NS)「発作がない「偽のコントロールは、同じラットを扱う、現在を提供しませんします。</li>
	<li>クローヌスが始まる耳クリップを外し、「口と顔の運動」が含まれています (ステージ 1)、「頭うなずいて」(ステージ 2)「前肢クローヌス」改訂ラシーンのスケール22よると焼付き挙動を記録 (第 3 期)、「前肢クローヌスと飼育」(ステージ 4) と「飼育と前肢クローヌスと落ちる」(5 期)。発作は約 10 に続く必要があります s。タイマーを使用して発作の持続時間を記録します。</li>
	<li>発作終了後、ラットをその家のケージに戻ります。ラットの発作からの回復性を確認する別の 5 分のラットを監視します。単独でケージに入ってそれを維持し、回復室にケージを返します。</li>
	<li>次のラットに ECS 誘導を繰り返します。</li>
	<li>残りの日の朝は少なくとも 1 回と午後まで彼らは実験のために安楽死させて次の日に、ラットを監視します。 注: ECS 誘導法の臨床症状に注意を要求する付随的副作用としてと 。たとえば、ECS 誘導プロトコルは、ラットに 15 s、原因の不必要な苦痛よりも長く続く発作を引き起こすことができます。この場合、(10 mg/kg, i. p.) はジアゼパムあるいはペントバルビ タール (25-30 mg/kg, i. p.) を使用して発作を終了します。ラットは、呼吸困難や厳しい行動異常発作停止を開発する場合、は、斬首刑に続いて炭酸ガス吸入による安楽死します。</li>
</ol>4. 慢性 ECS の誘導
注: は、図 1B下のパネルを参照してください。
<ol><li>前述の手順 1-3 で、連続 7 日間の朝の同じ時間で 1 日あたり 1 つの ECS を誘発します。</li>
	<li>ラット 2 回自宅に返される翌日ケージを監視します。</li>
</ol>5. 均質化となったラットの分別
注: は、図 2を参照してください。
<ol><li>320 mM ショ糖、ピロりん酸ナトリウム 5 mM、1 mM EDTA、10 mM HEPES pH 7.4 を含む新鮮な均質化バッファー (溶液) を準備 200 nM オカダ酸とプロテアーゼ阻害剤。フィルター滅菌真空ろ過 0.22 μ m 孔径のフィルターを使用してバッファー、氷の上に置きます。</li>
	<li>特定の時点で次の ECS の急性または慢性 ECS (図 1) ポイントは、斬罪にギロチンを使用してその後 5-10 分のための CO2吸入ラットを安楽死させます。</li>
	<li>脳を取り外して解剖23,24を前述のように氷の上に金属製のプレートになった。</li>
	<li>30 mm の培養に 1 匹のラットからの 2 つの場所なった皿し、はさみを使用して小さな断片にそれらをミンチします。</li>
	<li>1 mL ピペットを使用してマニュアルのガラス ホモジナイザーにみじん切りにしたなったを転送し、1 mL の冷たい均質化バッファー (溶液、ステップ 5.1) を追加します。丸杵をガラス ホモジナイザーに挿入します。ガラスのホモジナイザーは、氷の上ですが、ゆっくりと着実にストローク上下、1 分間 10-15 回杵に海馬組織の小片が消えるまで。</li>
	<li>磨砕液を 1 mL ピペットを使用して 1.7 mL 遠心チューブに転送し、不溶性の組織と核 (P1 分数) を含むペレットから postnuclear 上清 (S1 分数) を区切るための 4 ° C で 10 分間の 800 x g でホモジネートを遠心分離します。1 mL ピペットを使用して 2 つの独立した新しい 1.7 mL 遠心管に 50 μ L と S1 の端数の 950 μ L を転送、これらのチューブを氷に保存できます。氷の上の P1 分数ペレットを保存します。</li>
	<li>13,800 x g と別の培養上清 (S2 分数) ゾル性細胞質可溶性タンパク質を豊かに 4 ° C で 10 分間の S1 分数 (950 μ L) を遠心し、ペレット (P2 分画)、濃縮膜結合蛋白質、シナプトソーム蛋白質を含みます。氷の上で格納、S2 分数を 1 mL ピペットを使用して新しい 1.7 mL 遠心機に転送。</li>
	<li>498 μ 1 mL ピペットを使用して冷たい水で (P2 分数) ペレットを再懸濁します。1 M HEPES (pH 7.4) の 2 μ l 添加 4 mM HEPES (pH 7.4) の最終的な集中を達成するために 20 μ L ピペットを使用します。30 分ストアの撹拌で 4 ° C で氷で再懸濁の P2 分数をインキュベートします。</li>
	<li>BCA アッセイを用いた S1、S2、P2 の分数のタンパク質濃度を決定します。1 mg/mL の濃度を達成し、使用するまで-80 ° C で保存する各画分に 50 mM HEPES (pH 7.4) を追加または PSD を分離する P2 端数を処理します。</li>
</ol>6. 粗膜蛋白質 (P2) 画分から psd ファイルの分離
<ol><li>(LS2 分数) の分離の上澄みと分離のペレット (LP1 分数) を分離する遠心分離機の 25,000 x g と 4 ° C で 20 分間 P2 分数 (500 μ L)。氷の上で格納、LS2 分数を 1 mL ピペットを使用して新しい 1.7 mL 遠心チューブに転送。</li>
	<li>1 1 mL ピペットを使用して PBS バッファー x 1% 洗剤の 250 μ L 混合 50 mM HEPES (pH 7.4) の 250 μ L で LP1 ペレットを再懸濁します。15 分のために穏やかな攪拌と 4 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>遠心分離機の再懸濁の LP1 ペレット 25,000 x g とペレット (PSD 分数) から清 (非 PSD 分数) を分離する 4 ° C で 3 時間。1.7 mL の微量遠心チューブに上清を除去し、50 mM HEPES (pH 7.4) の 100 μ L で PSD ペレットを再懸濁します 200 μ L ピペットを使用しています。</li>
	<li>LS2、非-PSD、PSD 分数 BCA アッセイを用いたタンパク質濃度を決定します。1 mg/mL の濃度を達成するために使用されるまで-80 ° C で保存し各画分に 50 mM HEPES (pH 7.4) を追加します。 注: 手順 5-6 (すなわち液 A、HEPES バッファー、および PBS バッファー) で使用されているすべてのソリューションは、イオン ・有機物・微粒子の無料純水ですべきであります。</li>
</ol>7. 西部にしみが付くこと
<ol><li>氷の上の各蛋白分画を解凍します。(S2、P2、および PSD 1 mg/ml) 各画分の 12 μ L を 20 μ L ピペットを使用して新しい 1.7 mL 遠心チューブに転送します。</li>
	<li>5 x SDS サンプルバッファーの 3 μ L を追加し、75 の ° c の水浴中で 30 分間インキュベートします。部屋の温度 (RT) にサンプルを冷却します。</li>
	<li>蛋白質のサンプルの 10 μ L を 20 μ L ピペットを使用して 4-20% 勾配 15 よく櫛の SDS ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 (SDS-PAGE) ゲルのウェルに読み込みます。SDS-PAGE 装置、80-100 V 連続したバッファーのゲルを実行 (25 mM トリス、グリシン、190 mM と 0.1 %sds; pH 8.3)。 注: 各ゲルは、NS ラットおよび次の急性または慢性の ECS 異なる時点で ECS ラットからの蛋白質のサンプルを含める必要があります。</li>
	<li>25-30 V で転送装置で二フッ化ビニル (PVDF) 膜への SDS のページから蛋白質のゲルの転送 (60 mA) 転送バッファーに 9-12 時間 (25 mM トリス、190 mM グリシンと 20% メタノール; pH 8.3)。</li>
	<li>PVDF 膜に転送装置から外し、トリス緩衝生理食塩水 (TBS) 室温多目的ローテーター上で 5 分間洗浄</li>
	<li>5% の牛乳の膜をブロックし、0.1 %1 のため TBS でトゥイーン 20 は、洗浄バッファーで一次抗体 (表 1) でそれをインキュベート (1% のミルクと 0.1 %tbs でトゥイーン 20) 4 ° C で多目的回転子の一泊 (希薄のための材料表を参照してください)。</li>
	<li>洗浄バッファーの 4 回 10 分ずつの膜を洗浄し、ペルオキシダーゼ (HRP) をインキュベーションして-標識二次抗体室温多目的回転子の 1 h のバッファーを洗濯するに</li>
	<li>5 分 10 分のための 4 回膜洗浄バッファーの放置と TBS を洗ってください。</li>
	<li>1 分用強化 chemifluorescence 基板の膜をインキュベートし、x 線フィルムにそれを公開します。フィルムのプロセッサを露出したフィルムを現像します。</li>
</ol>8 西部のしみの定量化
<ol><li>西部のしみの TIFF ファイルとしてこのファイルをコンピューターに保存でスキャン。</li>
	<li>「ファイル」、「画像を開く、」右矢印「グレー スケール」下のグレースケール画像として ImageJ プログラムで西部のしみを開く</li>
	<li>ImageJ ツールバーから長方形選択ツールを選択し、興味の蛋白質の 1 つの西部のしみの帯域をカバーする四角形を描画します。</li>
	<li>「分析」の下で地域と選択したバンドの平均密度を取得する「測定」をヒットします。</li>
	<li>そのサイズと形状を変更することがなく背景領域に四角形を移動します。領域と背景の平均密度に 8.4 手順を繰り返します。</li>
	<li>興味の蛋白質のバンドのバック グラウンド減算密度を与える西部のしみバンドの背景バンドの平均密度の値を減算します。</li>
	<li>関心のすべての西部のしみバンド 8.2 8.6 手順を繰り返します。</li>
	<li>Α-チューブリン; などのハウスキーピング遺伝子産物のバック グラウンド減算バンド密度による興味の蛋白質のバンドのバック グラウンド減算密度を分割します。この手順では、興味の蛋白質の正規化された値を生成します。</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ここでは、ラットになったニューロン活動のグローバルな刺激を引き出す ECS 誘導法について述べる。ECS 人間1,2,3薬物難治性うつ病の治療に臨床的に使用される電気けいれん療法の動物モデルであります。重度のうつ病の治療に電気けいれん療法の使用にもかかわらず、正確なメカニズムは不明します。ECS の齧歯動物の反 depressant のような行動を誘導する海馬神経新生4,32を刺激するため、ECS が新しい場合を調査するため広く使用されています、海馬歯状回で大人生まれるニューロン抗うつ剤動作5,32に貢献します。
ECS は、てんかん注入電極、角膜電極または耳クリッ...

電気けいれん療法は、重度の薬剤抵抗性うつ病、双極性うつ病、パーキンソン病、統合失調症1,2を含む、大鬱病性障害患者を治療するために使用されています。この療法は、帽状電極1,2,3経由で麻酔をかけられた患者の頭に配信電気刺激による発作が生成されます。ECS の反復的な管理は、薬剤抵抗性うつ病1,2,3に臨床的に有益されています。しかし、ヒトの抗うつ効果の長期的効果の正確なメカニズムは、とらえどころのない推移しています。ECS は、電気けいれん療法の動物モデルで、その治療メカニズムを調査する使用は広く。齧歯類で、なったで成体神経新生を促進する ECS 急性と慢性の ECS 治療と再編成ニューラル ネットワーク4、5、認知の柔軟性に寄与する可能性があります。さらに、ECS による脳活動のグローバルな昇格、転写の豊富さを変更脳由来神経向性因子6、および代謝型グルタミン酸受容体 17 N メチル D アスパラギンなど複数のタンパク質など(NMDA) 型グルタミン酸受容体サブユニット7。これらの変更は、シナプス結合の数、構造、および海馬7,8,9の強度の長期的な修正を媒介に関与しています。
ECS のモデルで電気刺激がてんかん注入電極、角膜電極または耳電極を介して全般強直間代けいれん発作10,11を換起する齧歯動物に配信されます。脳定位固定装置注入電極の脳外科手術では、実験者の損傷を最小限に抑える手術技能を改善するために膨大な時間を必要とします。少ない侵襲角膜電極や麻酔を必要とする角膜上皮剥離や乾燥原因になります。耳クリップ電極の使用は、手術や麻酔なしの齧歯動物で使用できる最小限の損傷の原因となるために、これらの制限をバイパスします。確かに、耳クリップ電極を介して現在に目を覚まし配信ラットは確実にステージ 4 5 強直間代発作を誘発してなった10代でシナプス蛋白質の変化がわかった。
齧歯動物の脳の特定領域におけるシナプス蛋白質の ECS による豊かさを調べると、その検出と定量に最も適している実験方法を選択することが重要です。脳の細胞レベル下の分別は、水溶性ゾル性細胞質蛋白質の粗分離膜蛋白質;オルガネラ範囲蛋白質;そして PSD12,13,14など、特別な細胞レベル下の構造の蛋白質。PSD は、ニューロンのシナプス蛋白質は、シナプス後膜12,13,15に近い高濃度で整然と密な細胞内ドメインです。PSD の分離は豊かさとシナプス グルタミン酸受容体、足場蛋白質および PSD12のシグナル伝達タンパク質の機能のダイナミックな変化から、PSD で濃縮シナプス蛋白質の研究に有用,15,16,17は、シナプス可塑性といくつかの神経疾患17,18, synaptopathy に関連付けられます。PSD を浄化するために使用される従来の細胞レベル下の分別のショ糖勾配14,差動遠心分離によって脳の粗膜画分から洗剤不溶性分画の分離に関与19. この従来の方法での大きな課題は大量の齧歯動物の脳1914,が必要です。10-20 の齧歯動物の治療あたり PSD 画分を分離するための準備は広範なコストと時間の投資が必要です、多くの治療法がある場合、実質的に不可能です。
このような課題を克服するために、我々 は直接 PSD 画分のショ糖勾配遠心法20,21, なしを分離し、単一のラットのなったから psd ファイルを分離するために適用できるようにそれを修正するより簡単な方法を適応しています。脳。私たち小規模 PSD 画法結果約 2 なった、免疫沈降とウェスタンブロットなどを含むいくつかの生化学的な試金で使用するために十分なから PSD タンパク質の 30-50 μ g。西部にしみが付くことシナプス後密度タンパク質 95 (PSD-95) の濃縮とシナプス マーカー シナプトフィジンおよび可溶性細胞質タンパク質 α-チューブリンの除外を明らかにして psd ファイルを分離する方法の成功例を示します。私たち ECS の誘導と小規模の PSD の分別方法は他の齧歯動物の頭脳領域に容易に適応、ECS の PSD タンパク質の発現に及ぼす影響を評価するための比較的シンプルで信頼性の高い方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>Spargue-Dawley ラット</td><td>チャールズリバー研究所</td><td></td><td>ECS供給</td></tr><tr><td>パルス発生器</td><td>Ugo Bsile, Comerio, Italy</td><td>57800</td><td>ECS供給</td></tr><tr><td>MilliQ浄水システム</td><td>EMD Millipore</td><td>Z00Q0VWW</td><td>細胞内分画供給</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>EM科学</td><td>SX 1075-3</td><td>細胞内分画供給</td></tr><tr><td>Na4O7P2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>221368</td><td>細胞内分画供給</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E9884</td><td>細胞内分画供給</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H0527</td> 細胞<td>内分画供給</td></tr><tr><td>岡田酸</td><td>TOCRIS</td><td>1136</td><td>細胞内分画供給</td></tr><tr><td>停止プロテアーゼ阻害剤</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>78429</td><td>細胞内分画供給</td></tr><tr><td>NaVO3</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72060</td><td>細胞内分画供給</td></tr><tr><td>EMD ミリポアステリト 滅菌真空ボトルトップフィルター</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>SCGPS05RE</td><td>細胞内分画供給</td></tr><tr><td>アイリスハサミ</td><td>WPI(ワールドプレシジョン機器)</td><td>500216-G</td><td>細胞内分画供給</td></tr><tr><td>30 mm 組織培養皿</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>08-772B</td><td>細胞内分画供給</td></tr><tr><td>ガラス製ホモジナイザーとテフロン乳棒</td><td>VWR</td><td>89026-384</td><td>細胞内分画供給</td></tr><tr><td>1.7 mL 微量遠心チューブ</td><td>デンビル・サイエンティフィック社></td><td>C2170 (1001002)</td><td>細胞内分画供給</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XT/XF Centrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004521</td><td>Subcellular Fractionation supplies</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#23228</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#1859078</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)</td><td>BIO-RAD</td> <td>#4561086S</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Runningラボ</td><td></td><td>で製造されたバッファーウェ</td><td>スタンブロット用品&nbsp;</td></tr><tr><td>MiniPrecast Gels用Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell 4-gel</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>トランスファーバッファー</td><td>Made in lab</td><td></td><td>Western blot supplies.&nbsp;</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-1</td><td>ウェスタンブロット供給</td></tr><tr><td>グリシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP381-5</td><td>ウェスタンブロット供給</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>436143</td><td>ウェスタンブロット供給</td></tr><tr><td>メタノール&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr>PSDアイソレーション用<td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>界面活性剤</td></tr><tr><td>ミニトランスブロットモジュール&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703935</td><td>ウェスタンブロット用品</td></tr><tr><td>無脂肪インスタント粉ミルク</td><td>お得な</td><td></td><td>ウエスタンブロット用品</td></tr><tr><td>多目的ローテーター&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model-2314</td><td>ウェスタンブロット供給</td></tr><tr><td>Hyblot CL オートラジオグラフィーフィルム</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp;</td><td>E3018 (1001365)</td><td>ウェスタンブロットは</td></tr><tr><td>、強化された化学蛍光基質を供給します&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td>ウェスタンブロットは</td></tr><tr><td>、Konica SRX-101A フィルムプロセッサーを供給し</td>ます <td>KONICA MINOLTA</td><td>SRX-101A</td><td>ウェスタンブロットは</td></tr><tr><td>、抗体名</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>Cell Signaling</td><td>#2507</td><td>抗体希釈 = 1:500 - 1,000、時間 = 9 - 12 時間、反応温度 = 4 &deg;C, Host Species = Rabbit</td></tr><tr><td>Synaptophysin</td><td>Cell Signaling</td><td>#4329</td><td>抗体希釈 = 1:500 - 1,000, 時間 = 9 - 12 時間, 反応温度 = 4 &deg;C、宿主種=ウサギ</td></tr>α<tr><td>-チューブリン</td><td>サンタクルス</td><td>SC-5286</td><td>抗体希釈= 1:500-1,000、時間= 9-12時間、反応温度= 4&deg;C、宿主種=マウス</td></tr><tr><td>GluN2B</td><td>ニューロマブ</td><td>75-097</td><td>抗体希釈= 1:500-1,000、時間= 9-12時間、反応温度= 4&�度;C、宿主種 = マウス</td></tr><tr><td>GluA2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Sab 4501295</td><td>抗体希釈 = 1:500 - 1,000、時間 = 9 - 12 時間、反応温度 = 4 &deg;C、宿主種=ウサギ</td></tr><tr><td>STEP</td><td>Santacruz</td><td>SC-23892</td>抗体<td>希釈= 1:200-500、時間= 9-12時間、反応温度= 4&deg;C、宿主種=マウス</td></tr><tr><td>ペルオキシダスアフィニピュアロバ抗マウスIgG(H + L)</td><td>ジャクソン免疫研究所</td><td>715-035-150</td><td>抗体希釈= 1:2,000-5,000、時間= 1時間、反応温度= RT、宿主種=ロバ</td></tr><tr><td>ペルオキシダスアフィニピュアロバ抗ウサギIgG(H + L)</td><td>ジャクソン免疫研究所</td><td>711-035-152</td><td>抗体希釈= 1:2,000-5,000、時間= 1時間、反応温度= RT、宿主種=ロバ</td></tr></tbody></table>

電気けいれん発作になったラットとシナプス後密度タンパク質のてんかん発作による変化を調べることで

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

電気けいれん発作 (ECS) 重度のうつ病の最も効果的な治療、電気けいれん療法の実験動物モデルであります。ECS は低い死亡率と神経細胞死全般強直間代けいれん発作を誘発して画面抗てんかん薬に広く使われているモデルです。ここでは、ECS 誘導法について述べる短い 55 mA の電流が 0.5 に渡されるかどれで男性に s ラット耳クリップ電極を介して重量で 200-250 g。このような二国間の刺激生成期続いた約 10 4 5 間代発作 s。急性または慢性の ECS の中止後、ほとんどのラットの行動と区別する回復偽「発作がない「ラットの。ECS は、世界的に脳の活動を高めます、活動依存的シナプス蛋白質と複数のメソッドを用いたシナプス強度への影響の変化を確認するそれ使用されてもいます。特に、西部のしみとの組み合わせでシナプス後密度 (PSD) の細胞レベル下の分別のこの特殊なシナプス構造体でシナプス蛋白質の豊富な定量可能します。齧歯動物の頭脳の大規模な量を必要とする従来の分別方法と対照をなして我々 はショ糖勾配遠心法なし、単一のラットのなったから psd ファイルを分離するための小規模な画法をここで説明します。このメソッドを使用して、分離された PSD 割合にシナプス後膜蛋白質、PSD95、GluN2B、GluA2 などが含まれていることを紹介します。シナプス マーカー シナプトフィジンと可溶性細胞質タンパク質 α-チューブリンが成功した psd ファイルの分離を示す PSD 分数から除外しました。さらに、慢性的な ECS 減少単一のラットからの海馬の PSD タンパク質の遺伝的、薬理学的、または機械的治療後変更を検出する小規模 PSD 分別手法を適用できることを示す、PSD の GluN2B 式.

ここで説明されて詳細な手順を使用して 1 つの電気ショック (55 mA、100 パルス/秒 0.5 s) ラット (図 1A B) 4-5 強直間代発作へ耳クリップ電極による臨時ステージを届け。ラットの合計 8 は急性の ECS 誘導を受け、ステージ 4-5 強直間代発作を表示しました。発作が続いた約 10 s、およびすべてのラットが発作停止の 1-2 分以内に回復します。偽「発作がない」ラットは電気ショック受けなかったし、したがって発作が表示されませんでした。合計 4 せ物のラットが使用されました。慢性の ECS 誘導ラットは 7 日間連続の 1 日あたり 1 つの電気ショックを受けた、ステージ 4-5 各電気ショック (図 1A B) 時に強直間代発作を表示されます。ラットの合計 8 が慢性の ECS 誘導を受け、合計 4 せ物のラットは「発作がない」ラットとして使用されました。慢...

電気けいれん発作 (ECS) 重度のうつ病に対する電気けいれん療法の実験動物モデルであります。ECS はグローバル、シナプス形成、シナプス可塑性につながる海馬の活動を刺激します。ここでは、ラットの ECS 誘導、シナプス蛋白質のてんかん発作による変化を調べることになったの細胞レベル下の分別の方法について述べる.

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

電気痙攣による発作誘発およびそれに続く海馬の小規模分画法の全体的な目的は、ラット脳に全般的な発作活動を誘発し、発作活動によって引き起こされる海馬のポストシナプス密度におけるタンパク質の変化を調べることです。この手法は、発作時にどのシナプスタンパク質が特定の脳領域で制御されるか、またそのような制御が神経可塑性に寄与するかなど、神経プロセスにおける重要な疑問に答えるのに役立ちます。この電気痙攣誘発プロトコルの主な利点は、神経細胞死を伴わずに、ラット脳の活動を広範囲にわたって迅速に活性化させることができる点にあります。本手順の実演は、Hee Jung Chung博士の研究室の私とHan Gil Jeongが行います。まず、蓋付きの清潔で空のケージに雄ラットを入れます。ラットを30分間順化させた後、ECS誘導用のパルスジェネレーターを設定します。リセットボタンを押し、レディボタンが点灯していることを確認して、パルスジェネレーターを準備します。イヤークリップがパルスジェネレーターに装着されていないことを確認してください。次に、ショックボタンを数秒間押し、その後、イヤークリップをパルスジェネレーターに接続します。このステップでは、耳クリップを滅菌生理食塩水で濡らし、十分に浸透させます。次に、生理食塩水に浸したガーゼで耳を包み、ラットの耳を滅菌生理食塩水で濡らします。耳が濡れたら、ガーゼを取り除きます。各耳に1つずつクリップを取り付け、主軟骨帯より外側に配置します。ショックボタンを数秒間押し、痙攣を観察します。偽処置群（痙攣コントロールなし）については、同様に処置を行いますが、電流は流しません。クローヌスが始まったら、イヤークリップを外し、1から5までの改訂Racineスケールに従って発作行動を記録します。これには、ステージ4での四肢のクローヌスを伴う立ち上がり、およびステージ5での四肢のクローヌスを伴う立ち上がりと転倒が含まれます。発作は約10秒間持続させる必要があります。タイマーを使用して、発作の持続時間を記録します。発作が停止した後、ラットをホームケージに戻します。発作から十分に回復したことを確認するため、さらに5分間ラットを観察します。ケージ内で単独飼育し、ケージを回復室に戻します。この手順では、1匹のラットから採取した2つの海馬を30 mmの組織培養ディッシュに置き、ハサミで細かく刻みます。その後、刻んだ海馬を手動ガラスホモジナイザーに移し、氷冷したホモジナイズ緩衝液を1 mL加えます。次に、ガラスホモジナイザーに丸いペスティルを挿入します。ガラスホモジナイザーを氷上に置いた状態で、ペスティルを上下にゆっくりと一定の速度で10〜15回、1分間ストロークし、海馬組織の小さな破片が消失するまでP操作を行います。その後、1 mLピペットを用いてホモジネートを1.7 mLマイクロ遠心チューブに移し、4 °Cで800 ×gにて10分間遠心分離し、不溶性組織と核を含むペレットから核後上清を分離します。その後、S1画分の50 µLと950 µLをそれぞれ別の新しい1.7 mLマイクロ遠心チューブに移し、氷上で保存します。また、P1画分のペレットも氷上で保存してください。続いて、950 µLのS1画分を13,800 ×g、4 °Cで10分間遠心分離し、細胞質可溶性タンパク質が濃縮された上清と、シナプトソームタンパク質を含む膜結合タンパク質が濃縮されたペレットに分離します。S2画分を新しい1.7 mLマイクロ遠心チューブに移し、氷上で保存します。次に、P2画分のペレットを498 µLの氷冷精製水で再懸濁します。1 M HEPESを2 µL加え、最終濃度を4 mM HEPESにします。懸濁液を4°Cで30分間、攪拌しながらインキュベートします。30分後、再懸濁したP2画分を氷上に保存します。このステップでは、P2画分を25,000 ×g、4°Cで20分間遠心分離し、溶出した上清と溶出したペレットを分離します。LS2画分を新しい1.7 milliliterマイクロチューブに移し、氷上で保存します。次に、LP1ペレットを250 microlitersの50 millimolar heeps、250 microlitersの1%洗剤、および1 X PBSの混合液で再懸濁します。この懸濁液を4 °Cで15分間、緩やかに撹拌しながらインキュベートします。その後、再懸濁したLP1ペレットを25,000 ×g、4°Cで3時間遠心分離し、非PSD画分の上清とPSD画分のペレットを分離します。上清を1.7 mLマイクロ遠心チューブに移し、PSDペレットを100 µLの50 mM HEPESに再懸濁します。この図では、代表的なウェスタンブロットにより、偽手術群、けいれんなし群、および急性ECS投与群のラット海馬から得られたS2、P2、およびPSD画分における、NMDA受容体サブユニットGluN2B、AMPA受容体GluA2、およびSTEP 61のタンパク質発現を示しています。細胞質可溶性タンパク質であるalpha-TubulinはS2画分に濃縮されています。Synaptophysinはシナプス前小胞タンパク質であり、粗膜P2画分には濃縮されていますが、PSD画分には濃縮されていません。一方、PSD-95はP2画分とPSD画分の両方に濃縮されています。ここでは、急性ECS投与から3時間後および24時間後におけるP2画分およびPSD画分中のGluN2BとGluA2の定量結果を示しています。P2分画におけるGluN2BおよびGluA2の発現量は、S2分画のalpha-Tubulinで標準化しました。PSD分画におけるGluN2BおよびGluA2の発現量は、PSD分画のPSD 95で標準化しました。この手法を習得し、適切に実施すれば、5～6時間で完了させることができます。この手順に続き、どのシナプス蛋白がECSによって変化しているかという追加の疑問に答えるため、蛋白混合物に基づいた質量分析（mass spectrometry）などの分析を行うことができます。この手法の開発により、神経疾患分野の研究者は、神経疾患のトランスジェニックマウスなどのモデル動物において、シナプス機能不全の根本的なメカニズムを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、マウスにおけるECSの誘発方法、海馬からのホモジナイズおよびPSD分画の実施方法、そしてECS後のシナプス蛋白の変化を調べる方法について、十分な理解が得られるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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