Name: エスケープ中和抗体でインフルエンザ ウイルスの亜種の世代 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶエスケープ変異体生成法でインフルエンザAウイルスのヘマグルチニンに結合する中和モノクローナル抗体のエピトープを解明する方法です。基本組織培養技術で実施でき、ワクチン設計に有用です。

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このプロジェクトは、一部国立研究所のアレルギーと感染症から連邦政府の資金で賄われている、健康の国民の協会の保健社会福祉省、CEIRS の下で契約 HHSN272201400008C (f. k.);NIH の U19AI109946-01 (F. K.);P01AI097092-04S1 (P.E.L.)。

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著者は利益相反を宣言しません。

エスケープ変異を介して特定の残基の大部分を正確にされているが、このアプローチの主な注意事項の 1 つはエスケープの亜種の点突然変異がありますは、必ずしもによって決定される抗体の分子のフット プリント内対応構造解析。これは立体配座変化の変異の残渣、アロステリック効果に類似している場所の遠位につながる特定の残基に突然変異の能力のためです。別の制限は、この方法論はの中和抗体; のみ実装できます。生体外で選択的な圧力がない抗体は変異体の脱出につながることはありません。しかし、既報の中和抗体によって生成されたエスケープ亜種のパネルを使ってこの制限を克服できます。Tan et al.は、H7N9 ウイルスに対する中和モノクローナル抗体のエスケープ バリアントを使用7非中和抗体のエピトープをマップします。
それにもかかわらず、エスケープのバリエーションの生成によって抗体のエピトープの解明装置の大規模な投資が必要どちらの結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡への現実的な選択肢を提供します。他の選択肢は、アラニンのスキャンまたはペプチド スキャン/トランケーション変異体を用いた Mab の最小限の結合領域を決定します。突然変異誘発をスキャン アラニンは、大量のペプチド スキャンは線形エピトープ3029日のスクリーニング中にバリエーションの数が多いを生成する作業を必要があります。このプロトコルで説明されているメソッドには、特別な機器や技術が不要と実際では、既存の in vitro中和試金興味の抗体のエスケープの亜種を生成するように変更します。
(例えば、茎特異的抗体) 複数の通路が必要な生成のエスケープ バリエーションのプロトコルは開始 0 の通路で抗体濃度に大きく依存。注意の側面で誤ると抗体の半最大阻害濃度より低い半分のログにログを開始し、堅牢なウイルス増殖を可能にすることをお勧めします。研究者は、低免疫学的圧力の存在下で高価のウイルス培養がウイルスの人口に大規模な遺伝的変異があることを推測できます。次の通路に抗体濃度を徐々 に増やすことでの脱出のバリエーションを選択できます。ウイルス増殖が減少すると、イベントで前の通路で抗体濃度の同じ量を維持しながら次の文章のウイルス上清の量を増やすことができます。
万能インフルエンザ ワクチンの大半の目的は、HA の茎地域に向けて強力な抗体応答を引き出すことです。エスケープの亜種茎特異抗体の解析、インフルエンザ ウイルス適応と免疫学的圧力との関係を定義するときに重要です。興味深いことに、茎特異抗体に起因エスケープ変異ウイルスでマウス LD50研究4ですべて弱毒生体内であった。これらの研究は、予防接種の茎ベース プラットフォームの強力なケースを提供します。さらに、小分子阻害剤などの他の抗ウイルス化合物にエスケープ変異を識別するためにこのプロトコルを使用することができます。最後に、この方法論はインフルエンザ ウイルスの表面糖タンパク質に限定されていませんが、他のウイルスの糖蛋白の抗原を確認するもより広く適用できます。

他の RNA ウイルスと同様に、インフルエンザ A ウイルス抗原の亜種のレプリケーション1,2,3の各ラウンドでの多数の生成は、エラーを起こしやすいポリメラーゼが所有しています。インフルエンザ ウイルスには、適応、抗体の結合の損失につながる表面の糖蛋白質の突然変異の蓄積によって達成される抗原ドリフトを介して人間の免疫反応を回避するために驚くべき能力があります。HA とノイラミニダーゼ (NA) のウイルスの表面糖の抗原ドリフト再定式化し、毎年ワクチンを管理する必要性を必要とします。
分離と抗原特異的抗体の作製の技術の進歩は、ワクチンによる抗体4,5,6,7,8の数が多いを得られています。ターンでは、広くインフルエンザ A ウイルスを中和する抗体のエピトープの解析が格段にいくつか万能インフルエンザ ワクチン候補9,10,11,の開発 12,13,14。モノクローナル抗体の抗原の足跡を解明中和の構造の決定要因を明らかにし、ワクチンの設計の方の情報に基づいたアプローチが可能します。しかし、それは現実的なも構造的にウイルス抗原15,エピトープをマップするために x 線結晶構造解析や電子顕微鏡を介して Mab の豊富なパネルを特徴づける研究所の費用対効果16,17,18。
X 線結晶構造解析や電子顕微鏡で高価な機器、特殊な技術と可能性のあるデータを生成する時間の豊富な量が必要です。代替、高速アプローチはエラーを起こしやすい RNA 依存性を介して多様なウイルスの人口の急速な生成を利用した Mab19,20、エピトープを決定するエスケープ変異体を生成する RNA ポリメラーゼ 21,22,23。エスケープのバリエーションの生成は、特別な機器や技術は必要ありませんあり、従来実験用試薬と機器を実行できます。
ここでは、mAb のバインディングに必要な重要な残留でインフルエンザ HA を認識のマッピングでは、手法について述べる。

<table><tbody><tr><td>Falcon 96-well clear flat bottom TC処理培養マイクロプレート、Lid</td><td>Corning, Inc.</td><td>353072</td><td>マイクロ中和アッセイ</td></tr><tr><td>Falcon 96ウェルクリアVボトムプレート</td>用アッセイプレート <td>Corning, Inc.</td><td>353263</td><td>血球凝集阻害アッセイ用のアッセイプレートの使用</td></tr><tr><td>1X Minimal Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11095080</td><td>Infection 培地</td></tr><tr><td>トシルフェニルアラニルクロロメチル (TPCK) 処理トリプシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>未熟な HA0 を HA1 および HA2</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-NP Primary Antibody (IAV)</td> に切断します。<td>EMD Millipore</td><td>MAB8258B</td><td>インフルエンザA型ウイルスのNPタンパク質を認識する抗体</td></tr><tr><td>ビオチン化抗NP一次抗体(IBV)</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB8260B-5</td><td>インフルエンザB型ウイルスのNPタンパク質を認識する抗体</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-HRP抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>18-152</td><td>ビオチン化抗NP抗体</td></tr><tr><td>HRP基質(SIGMAFAST-OPD)の二次抗体として使用します。</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9187-5SET</td><td>o-フェニレンジアミン二塩酸塩水溶性基質、HRP</td></tr><tr><td>96ウェルV底プレート</td>用 <td>Nunc</td><td>249662</td><td>赤血球増加アッセイに使用されるアッセイプレート</td></tr><tr><td>鶏の赤血球</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7201403</td> インフルエンザウイルスがトリゾルアンビオンを<td>凝集する能力を評価するために使用されます</td></tr><tr><td></td><td></td><td>15596026</td><td>RNA</td></tr><tr><td>スーパースクリプトIII</td>の抽出 <td>Invitrogen</td><td>の12574018</td><td>逆転写酵素</td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>増幅PCR産物の単離</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>抗ヒトIgG(H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11013</td><td>ヒト用蛍光二次抗体抗体</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>マウス抗体用蛍光二次抗体</td></tr><tr><td>6ウェルポリスチレンマイクロプレート</td><td>Corning, Inc.</td><td></td><td></td>353934</tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 長期保存 クライオチューブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5012-0020</td><td>ウイルス培養上清</td></tr><tr><td>再集合体 A/California/04/09 (H1)</td>の <td>HA と NA を発現するパレーゼ実験室再集合体ウイルス A/Calic/04/09 (H1N1) と A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) の内部セグメント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>再集合体 A/Shanghai/1/13 (H7)</td><td>Palese Laboratory</td><td></td><td>reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td></tr>ウ<tr><td>シ血清アルブミン溶液 (35%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen gel extration kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Silica-membrane-based purification of DNA fragments</td></tr></tbody></table>

エスケープ中和抗体でインフルエンザ ウイルスの亜種の世代

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

インフルエンザ ウイルスは、適応、ホストの免疫反応を回避するために驚くべき能力を展示します。1 つの方法は、ウイルスの表面糖タンパク質は、抗原の変化です。エスケープの亜種の発生は、ウイルスが免疫検出を脱出する方法の解明と抗体の結合のために必要な重要な残基を識別する強力な方法です。ここでは、ウイルスの赤血球凝集素 (HA) に対する人間やマウスのモノクローナル抗体 (Mab) を用いて A 型インフルエンザ ウイルスのエスケープの亜種を生成する方法のプロトコルについて述べる.私たちの技術を使って、私たち以前頭または、新規鳥 H7N9 HA の茎の抗体の結合のために必要な重要な残基の特徴。プロトコルは他のウイルス システムのために容易に適応することができます。エスケープの変形の解析は、抗原ドリフト、一塩基多型 (SNPs) 抵抗とウイルス フィットネスを授与の決定をモデル化するため、ワクチンや治療薬の設計は重要です。

我々 は以前エスケープの亜種季節性インフルエンザ ウイルス ワクチン、H7N9 予防接種またはシーケンシャル DNA/組換え HA タンパク質ワクチン接種4,5 による人間とマウスのモノクローナル抗体を生成するのにこのメソッドのバリエーションを使用しています。、6,7。前述のように、抗体が最初 HI と中和の試金を使用して次の4,5を続行する特定プロトコルをお知らせするために特徴付けられます。抗体 07 5 D 03、07 5F01、07 5 G 01、07 4B03、07-4E02 07-4 D 05 鳥インフルエンザ H7N9 ウイルス (A/上海/1/2013) (表 1) に対する HI と中和の活動を持つことがわかったし、こうしてプロトコル 1 (ステップ 2.1) が利用されました。41 5E04、045 051310 2B06, 042 100809 2F04 S6 B01 (表 1) などの HI 活動に欠けている、中和抗体のプロトコル 2 (手順 2.2) はエスケープの亜種を生成に使用されました。エスケープ変異のマッピングでは、抗体の多くはウイルス HA4,5 (図 4) で異なる場所に重要な残基を認識を明らかにしました。こんにちは陽性抗体の大半が、H7 HA の以前に報告された抗原部位近く突然変異体残基を脱出しながら負で HI 抗体エスケープ ポイント突然変異の突然変異体では生成、茎地域4,5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗体</td>
			<td>こんにちは活動</td>
			<td>NEUT 活動</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07 5 D 03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07 5F01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07 5 G 01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07 4B03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07 4E02</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07 4 D 05</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41 5E04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>045 051310 2B06</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>042 100809 2F04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6 B01</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1:抗体 HI と中和活性のテーブル。10 H7 固有 Mab 個人実験の H7N9 ワクチン接種から分離された別の in vitro抗ウイルス活動5 を展示します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">前方のプライマー (5' 3')</td>
			<td colspan="4">逆プライマー (5' 3')</td>
			<td colspan="2">Thermocylcer の条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV</td>
			<td colspan="4">TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG</td>
			<td colspan="4">ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT</td>
			<td colspan="2">60 分の 42 ° C、20 94 ° C 2 分/5 サイクル 94 ° C s、50 ° C で 30 秒と 3 分 30 秒 68 ° C に続いて 40 サイクル 94 ° C の 20 s、58 ° C 30 s、と 3 分 30 秒 68 ° C で 10 分間の最終延長時間、68 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBV</td>
			<td colspan="4">GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC</td>
			<td colspan="4">CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC</td>
			<td colspan="2">60 分、30 分の 55 ° C、20 94 ° C 2 分/5 サイクル 94 ° C 45 ° C s、30 ° C で 40 秒と 3 分 30 秒 68 ° C に続いて 20 94 ° C の 40 のサイクル s、58 ° C 30 秒と 3 分 30 秒 68 ° C で 10 分間の最終延長時間、68 ° C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2: 普遍的なインフルエンザ ウイルス プライマー 。インフルエンザ A27 B28ウイルスと自分たちのそれぞれの条件の HA セグメントの増幅用プライマー。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig1.jpg"> 
図 1: こんにちはアッセイ。A (A) 図のための 2 つのマウス H1 固有 Mab 7B2 (頭固有) と 6F12 (茎固有) 96 ウェル V 底プレートと HI 法23の結果の例 (B) を使用してアクティビティをテストするのにはこんにちは試金の設定。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig2.jpg"> 
図 2: 中和アッセイ。図 2 つの人間 Mab 4 055 CR911417の活動をテストすると中和試験をセットアップのための。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig3.jpg"> 
図 3: エスケープ変異の生成します。提案手法は HI と抗体による展示と中和活性に依存になります。(A) に対してエスケープ変異の生成中和こんにちは肯定的な抗体は、(B) 中和負で HI 抗体は抗体量の増加とともに複数の通路を伴うことがあります。 一方、卵、単一通路を必要があります。細胞培養。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig4.jpg"> 
図 4: 新規鳥 H7N9 ha エスケープ変異亜種で生成されたエピトープ マップの例です。ワクチンによる抗体は H7N9 インフルエンザ ワクチンはエスケープ変異亜種を生成に使用された候補者を接種個人から分離されました。赤い表す指定した各残基、モノクローナル抗体の効率的なバインドに必要な重要なアミノ酸の位置。データはデュナン ヘンリーら2015年4から合わせられました。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

我々 は A 型インフルエンザ ウイルスのウイルスのヘマグルチニンを対象とする人間やマウスのモノクローナル抗体の結合のために必要な重要な残基を識別する手法を提案します。プロトコルは、他のウイルスの表面糖蛋白質とそれらの対応する中和抗体に適応することができます。

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

本手法の全体的な目的は、中和モノクローナル抗体のエピトープを解明するための実用的なプロトコルを提供することです。この手法は、免疫学およびウイルス学の分野における重要な疑問への回答に役立ち、宿主とウイルスの相互作用の定義、治療薬および診断ツールの開発を可能にし、それらすべてがワクチンの設計に寄与します。本技術の主な利点は、特別な器具や装置を必要とせず、基本的な組織培養および分子生物学の手法を用いて実施できる点にあります。本手順の実演は、Peter Palese研究室のMD、PhD学生であるMark Baileyが行います。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、赤血球凝集抑制（HI）能および中和活性に基づいて抗体の特性評価を行ってください。HI活性を持つ中和抗体についてさらに解析を行うため、まず目的の抗体を1×PBSを用いて、1希釈あたり100 µLの容量で、濃度を段階的に上げて4段階の希釈系列を調製します。次に、1×PBSを用い、1mLあたり100万プラーク形成単位（PFU）のウイルスストックを400µL調製します。続いて、1mLあたり100万PFUのウイルス液100µLを、各抗体希釈液100µLまたは1×PBS 100µLと混合します。これらのサンプルを、5% CO2供給下の37°Cインキュベーターで1時間インキュベートします。軽くボルテックスした後、各混合液 200 µL を特定病原体不在（SPF）の鶏胚卵に注入します。次に、二酸化炭素を含まない 37 °C で 40～44 時間、卵をインキュベートします。インキュベーション後、ウイルス感染させた鶏胚卵を 4 °C で最低 6 時間静置して殺処分します。次に、既述の方法に従って卵から尿囊液を回収します。最後に、本文のプロトコルに記載されているHIアッセイを行い、エスケープ変異体であることを確認します。HI活性を持たない中和抗体に対するエスケープ変異体を生成するには、抗体量を段階的に増やしながらウイルスを継代させる必要があります。MDCK細胞を、1ウェルあたり100万個の密度で6ウェルプレートに播種します。5%二酸化炭素濃度の37 °Cインキュベーター内で、細胞を最低4時間インキュベートします。その間に、ウイルスストックを1 mLあたり100万プラーク形成単位に希釈します。TPCK処理トリプシンを含む1倍MEMを用いて、抗体を0.02 milligrams per milliliterに希釈した溶液を250-microliter調製します。以降のすべての継代では、より高濃度の抗体を使用してください。希釈したウイルス250 microlitersと、希釈した抗体250 microlitersを混合します。抗体なしのコントロールとしては、1倍MEM 250 microlitersを使用してください。ウイルス抗体混合液を、5%二酸化炭素を含む37°Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。細胞のインキュベート後、ガラス製パストゥールピペットを用いて培地を吸引し、細胞単層を1 mLの1×PBSで洗浄します。各ウェルに混合液を500 µL加え、5%二酸化炭素を含む37°Cのインキュベーターで1時間インキュベートします。1時間後、TPCK処理済みトリプシンを含む1倍MEMを2 mL添加します。感染から48時間後に、顕微鏡で細胞病変効果（CPE）の兆候を確認するか、血球凝集反応を行いウイルスの増殖を検出します。抗体を添加した培養物においてCPEによる増殖が認められた場合は、上清を複数のクライオチューブに回収します。チューブに継代数を記載し、-80 °Cで保存します。上清を100 µL分取して保存し、TPCKトリプシンと抗体を添加した1×MEM 2 mLを用いて、新鮮なMDCK単層細胞に感染させます。継代ごとに、抗体なしのコントロールを必ず含めるようにしてください。ウイルスの増殖が維持できる限界まで、継代ごとに抗体濃度を上昇させ、最終的に抗体濃度 0.6 mg/mL に達するようにします。各継代の上清を複数のバイアルに分注して凍結し、-80 °C で保存します。その後、テキストプロトコルに詳述されている脱出変異体の分離および解析に進みます。候補となるH7N9インフルエンザAワクチンを接種した個体から単離したワクチン誘発抗体を用いて、エスケープ変異株を生成した。エスケープ変異のマッピングにより、多くの抗体がウイルスHA上の異なる位置にある重要な残基を認識していることが明らかになった。赤色で示された各残基は、モノクローナル抗体の効率的な結合に必要な重要なアミノ酸の位置を表しており、HI陽性抗体の大部分は、 previously reported なH7HAの抗原部位付近にエスケープ変異残基を有していた。HI陰性抗体は、ストーク領域に点変異を持つエスケープ変異株を生成した。この手法を習得すれば、他の病原体に対する防御の構造的決定因子の解明に適用できます。本手法は、モノクローナル抗体のエスケープ変異体の作製だけでなく、抗ウイルス化合物に対しても適用可能です。このビデオを視聴することで、in vitroでエスケープ変異体を作製し、モノクローナル抗体の結合エピトープを解明する方法について深く理解できるはずです。この手順を行う際は、ウイルスを扱うことに十分注意し、適切な個人用保護具を着用することが重要です。

generation-escape-variants-neutralizing-influenza-virus-monoclonal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、中和型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体のエスケープバリアントを生成する手法を示しています。抗体中和ウイルス懸濁液を胚のニワトリ卵に注入し、エスケープバリアントを選択的に増殖させます。これにより、ウイルス集団は主にエスケープ変異体となり、ヘマグルチン化アッセイによって確認されました。...

中和抗体に対するインフルエンザウイルスエスケープバリアントの作製

このビデオでは、寒冷適応型組換えインフルエンザウイルスを作成する方法を紹介しています。これには、ヒト細胞に双方向プラスミドをトランスフェクションした後、低温でインキュベーションして、暖かい条件下での複製が減少するという特徴を持つワクチン製造に適したウイルスを生成するというものです。...

ワクチン用の組換え弱毒生インフルエンザウイルスの作製

クローニングされたcDNAからの組換えアレナウイルスのレスキュー、逆遺伝学と呼ばれるアプローチは、研究者はアレナウイルスの生物学のさまざまな側面に、特定のウイルス遺伝子産物の役割、ならびにそれらの異なる特定ドメイン及び残基の寄与を調べることができ。同様に、人間の病原アレナウイルスに対抗するための効果的かつ安全なワクチンの生成のための新規な可能性を提供するワクチン開発のためのFDA承認された細胞株（ベロ）における遺伝学技術を逆転。...

FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

ここでは、昆虫細胞中での新規な中国のH7N9ウイルス由来の正しく折り畳まれ、機能性インフルエンザウイルス表面抗原を発現する方法を記載している。技術は、任意のウイルスまたは細胞表面タンパク質の外部ドメインを発現するように適合させることができる。...

バキュロウイルス発現系を用いた新規H7N9インフルエンザウイルス由来の機能組換えヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質の発現

ハイブリドーマ技術に基づくモノクローナル抗体の生成に最適化されたプロトコールが提示されます。マウスを免疫複合体で免疫した。脾臓細胞は、不死性骨髄腫細胞とPEGおよび電気インパルスによって融合されました。抗体産生ハイブリドーマ細胞は、HATおよび抗原特異的ELISAスクリーニングによって選択されました。...

ハイブリドーマ技術によってマウスモノクローナル抗体の作製

この研究は説明します ウイルス間の抗原性の関係を分析するための画像化ベースのマイクロ中和アッセイ。プロトコルは、フラットベッドスキャナを使用し、滴定、滴定の定量、中和、及び中和定量を含む4つのステップがあります。アッセイは、現在の循環インフルエンザA（H1N1）pdm09、A（H3N2）、およびB型ウイルスでうまく動作します。...

定量的マイクロ中和アッセイの最適化

インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンを対象とする抗体による Fc を介したエフェクターの機能の活性化を測定する手法を提案します。この試金は、Fc...

インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法

インフルエンザ中和抗体は、インフルエンザ感染症の保護と関連付けてください。中和血清中和抗体価の測定し、インフルエンザのひと血清にしばしば使用します。次のインフルエンザの予防接種や感染症現代 3C.2a 3C.3a a (h3n2) ウイルス中和抗体価を測定する SIAT1 MDCK...

試金を使用して SIAT1 MDCK 細胞のインフルエンザ a (h3n2) ウイルス中和によるひと血清中の抗体を中和することを測定

本研究は、高スループットを説明します呼吸器合胞体ウイルス (RSV) の中和抗体の力価を決定するためのマイクロ中和アッセイのイメージングに基づきます。このアッセイの形式は、別のサンプル...

高スループットの改善された呼吸器合胞体ウイルス (RSV) 微量中和試験

このプロトコルは、2つのインフルエンザA株からエンベロープ糖タンパク質を有する高力性ウイルス性偽型粒子(pp)を生成する実験プロセスと、その感染性を決定する方法を記述する。このプロトコルは、異なるエンベロープ糖タンパク質を持つエンベロープウイルスの他のタイプのppsを開発するために非常に適応性があります。...

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

このプロトコルでは、SARS-CoV-2変異体の感染力と中和抗体に対する感受性を迅速に定量化するためのプラットフォームとして、新しいハイブリッドアルファウイルス-SARS-CoV-2偽ウイルス(Ha-CoV-2)のアプリケーションについて説明します。...

SARS-CoV-2変異株の迅速定量と中和抗体へのHa-CoV-2偽ウイルスの応用

学ぶエスケープ変異体生成法でインフルエンザAウイルスのヘマグルチニンに結合する中和モノクローナル抗体のエピトープを解明する方法です。基本組織培養技術で実施でき、ワクチン設計に有用です。

エスケープ中和抗体でインフルエンザウイルスの亜種の世代

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