エスケープ中和抗体でインフルエンザ ウイルスの亜種の世代

この方法の全体的な目標は、中和モノクローナル抗体のエピトープを解明する方法に関する実用的なプロトコルを提供することです。この方法は、免疫学およびウイルス学の分野における重要な質問に答えるのに役立ち、宿主ウイルスの相互作用を定義し、治療法や診断ツールを開発し、これらすべてがワクチンの設計に役立ちます。この技術の主な利点は、特別な器具や機器を使用せずに、基本的な組織培養および分子生物学技術で実行できることです。

この手順を実演するのは、Peter Paleseの研究室の医学博士で博士課程の学生であるMark Baileyです。この手順は、血液凝集阻害(HI)に基づく抗体の特性評価、およびテキストプロトコルに記載されている中和活性から開始します。HI活性を有する中和抗体は、まず、目的の抗体を4回希釈して、希釈あたり100マイクロリットルの容量でPBSの1倍の濃度を増加させることにより、さらに分析されます。

次に、400マイクロリットルの容量のPBSの1倍で1ミリリットルあたり100万プラーク形成単位のウイルスストックを調製します。次に、ウイルス1ミリリットルあたり100万のプラーク形成単位を100マイクロリットルと、各抗体希釈液100マイクロリットルまたはPBSの1倍100マイクロリットルと混合します。サンプルを摂氏37度のインキュベーターで1時間インキュベートし、5%の二酸化炭素を入れます。

短時間ボルテックスした後、各混合物の200マイクロリットルを特定の病原体を含まない胚鶏の卵に注入します。次に、卵を二酸化炭素なしで摂氏37度で40〜44時間孵化させます。孵化後、ウイルスに感染した胚の卵子を摂氏4度に最低6時間置いて犠牲にします。

次に、前述のように卵から尿膜液を採取します。最後に、テキストプロトコルに記載されているようにHIアッセイを実施することにより、エスケープバリアントを確認します。HI活性を欠く中和抗体に対するエスケープバリアントを生成するには、抗体の量が増加している状態でウイルスを継代する必要があります。

MDCK細胞を6ウェルプレートに1ウェルあたり100万個の細胞密度でプレート化します。細胞を摂氏37度のインキュベーターで最低4時間インキュベートし、5%の二酸化炭素でインキュベートします。その間、ウイルスストックを1ミリリットルあたり100万プラーク形成単位に希釈します。

250マイクロリットルの容量でTPCK処理トリプシンを使用して、1回のMEMで0.02ミリグラム/ミリリットルの抗体を1回希釈して調製します。後続のすべての継代には、より高い抗体濃度を使用してください。希釈したウイルス250マイクロリットルと希釈した抗体250マイクロリットルを混合するか、抗体なしコントロールとしてMEMの1倍を250マイクロリットル混合します。

ウイルス抗体混合物を、5%二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターで30分間インキュベートします。細胞のインキュベーション後、ガラスパスツールピペットを使用して培地を吸引し、細胞の単層をPBSの1倍1ミリリットルで洗浄します。500マイクロリットルの混合物をウェルに加えてから、摂氏37度のインキュベーターで5%の二酸化炭素と1時間インキュベー

1時間後、TPCK処理されたトリプシンを含むMEMの1倍の2ミリリットルをウェルに補給します。感染後48時間で細胞変性効果(CPE)の兆候がないか顕微鏡で細胞をチェックしたり、血液凝集アッセイを行ってウイルスの増殖を検出したりします。抗体を添加した培養物に増殖CPEがある場合は、上清を複数のクライオチューブで回収します。

チューブに通路番号をラベル付けし、摂氏マイナス80度で保管します。上清の100マイクロリットルを保存して、TPCKトリプシンと抗体を補充した1倍のMEMの2ミリリットルでMDCKの新鮮な単層を感染させます。すべての通路に抗体なしのコントロールを含めることを忘れないでください。

抗体の最終濃度が1ミリリットルあたり0.6ミリグラムであっても、ウイルスの増殖がまだ生存可能になるまで、各継代で抗体の濃度を増加させます。各通路の上清の複数のバイアルを凍結し、摂氏マイナス80度で保存します。テキストプロトコルに詳述されているように、エスケープされたバリアントの分離と分析に進みます。

H7N9インフルエンザA型ワクチン候補を接種した個人から単離されたワクチン誘導抗体を用いて、エスケープ変異体を作製した。エスケープ変異体マッピングにより、抗体の多くがウイルスHAの異なる場所にある重要な残基を認識することが明らかになりました。赤で示されている各残基は、モノクローナル抗体の効率的な結合に必要な重要なアミノ酸の位置を表しており、HI陽性抗体の大部分は、以前に報告されたH7HAの抗原性部位付近の変異体残基から逃れています。HI陰性抗体は、ストック領域に点変異を有するエスケープ変異体を作製した。

この手法を習得すると、他の病原体に対する防御の構造的決定要因を解明するために適用できます。この技術は、モノクローナル抗体のエスケープバリアントを生成するだけでなく、抗ウイルス化合物に対しても行われます。このビデオを見れば、in vitroでエスケープバリアントを生成することにより、モノクローナル抗体の結合エピトープを解明する方法を十分に理解できるはずです。

この手順を試みる際には、ウイルスを扱う際には注意し、適切な個人用保護具を使用することを忘れないでください。