エスケープ中和抗体でインフルエンザ ウイルスの亜種の世代

本手法の全体的な目的は、中和モノクローナル抗体のエピトープを解明するための実用的なプロトコルを提供することです。この手法は、免疫学およびウイルス学の分野における重要な疑問への回答に役立ち、宿主とウイルスの相互作用の定義、治療薬および診断ツールの開発を可能にし、それらすべてがワクチンの設計に寄与します。本技術の主な利点は、特別な器具や装置を必要とせず、基本的な組織培養および分子生物学の手法を用いて実施できる点にあります。

本手順の実演は、Peter Palese研究室のMD、PhD学生であるMark Baileyが行います。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、赤血球凝集抑制（HI）能および中和活性に基づいて抗体の特性評価を行ってください。HI活性を持つ中和抗体についてさらに解析を行うため、まず目的の抗体を1×PBSを用いて、1希釈あたり100 µLの容量で、濃度を段階的に上げて4段階の希釈系列を調製します。

次に、1×PBSを用い、1mLあたり100万プラーク形成単位（PFU）のウイルスストックを400µL調製します。続いて、1mLあたり100万PFUのウイルス液100µLを、各抗体希釈液100µLまたは1×PBS 100µLと混合します。これらのサンプルを、5% CO2供給下の37°Cインキュベーターで1時間インキュベートします。

軽くボルテックスした後、各混合液 200 µL を特定病原体不在（SPF）の鶏胚卵に注入します。次に、二酸化炭素を含まない 37 °C で 40～44 時間、卵をインキュベートします。インキュベーション後、ウイルス感染させた鶏胚卵を 4 °C で最低 6 時間静置して殺処分します。

次に、既述の方法に従って卵から尿囊液を回収します。最後に、本文のプロトコルに記載されているHIアッセイを行い、エスケープ変異体であることを確認します。HI活性を持たない中和抗体に対するエスケープ変異体を生成するには、抗体量を段階的に増やしながらウイルスを継代させる必要があります。

MDCK細胞を、1ウェルあたり100万個の密度で6ウェルプレートに播種します。5%二酸化炭素濃度の37 °Cインキュベーター内で、細胞を最低4時間インキュベートします。その間に、ウイルスストックを1 mLあたり100万プラーク形成単位に希釈します。

TPCK処理トリプシンを含む1倍MEMを用いて、抗体を0.02 milligrams per milliliterに希釈した溶液を250-microliter調製します。以降のすべての継代では、より高濃度の抗体を使用してください。希釈したウイルス250 microlitersと、希釈した抗体250 microlitersを混合します。抗体なしのコントロールとしては、1倍MEM 250 microlitersを使用してください。

ウイルス抗体混合液を、5%二酸化炭素を含む37°Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。細胞のインキュベート後、ガラス製パストゥールピペットを用いて培地を吸引し、細胞単層を1 mLの1×PBSで洗浄します。各ウェルに混合液を500 µL加え、5%二酸化炭素を含む37°Cのインキュベーターで1時間インキュベートします。

1時間後、TPCK処理済みトリプシンを含む1倍MEMを2 mL添加します。感染から48時間後に、顕微鏡で細胞病変効果（CPE）の兆候を確認するか、血球凝集反応を行いウイルスの増殖を検出します。抗体を添加した培養物においてCPEによる増殖が認められた場合は、上清を複数のクライオチューブに回収します。

チューブに継代数を記載し、-80 °Cで保存します。上清を100 µL分取して保存し、TPCKトリプシンと抗体を添加した1×MEM 2 mLを用いて、新鮮なMDCK単層細胞に感染させます。継代ごとに、抗体なしのコントロールを必ず含めるようにしてください。

ウイルスの増殖が維持できる限界まで、継代ごとに抗体濃度を上昇させ、最終的に抗体濃度 0.6 mg/mL に達するようにします。各継代の上清を複数のバイアルに分注して凍結し、-80 °C で保存します。その後、テキストプロトコルに詳述されている脱出変異体の分離および解析に進みます。

候補となるH7N9インフルエンザAワクチンを接種した個体から単離したワクチン誘発抗体を用いて、エスケープ変異株を生成した。エスケープ変異のマッピングにより、多くの抗体がウイルスHA上の異なる位置にある重要な残基を認識していることが明らかになった。赤色で示された各残基は、モノクローナル抗体の効率的な結合に必要な重要なアミノ酸の位置を表しており、HI陽性抗体の大部分は、 previously reported なH7HAの抗原部位付近にエスケープ変異残基を有していた。HI陰性抗体は、ストーク領域に点変異を持つエスケープ変異株を生成した。

この手法を習得すれば、他の病原体に対する防御の構造的決定因子の解明に適用できます。本手法は、モノクローナル抗体のエスケープ変異体の作製だけでなく、抗ウイルス化合物に対しても適用可能です。このビデオを視聴することで、in vitroでエスケープ変異体を作製し、モノクローナル抗体の結合エピトープを解明する方法について深く理解できるはずです。

この手順を行う際は、ウイルスを扱うことに十分注意し、適切な個人用保護具を着用することが重要です。