Name: 改良導かれるアブレーションのラット聴覚野と脳の病変の局在 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶラット聴覚野のステレオタクシック誘導アブレーション法。座標マップを用いて病変を正確に局在化し、神経科学研究における皮質機能の解明に活用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究は、経済産業省と SAF2016 78898 C2 2 R. スペイン政府の競争力 (MINECO) からの助成金によって支えられました。

両方のスペインの規制 (ロイヤル令 53 2013 - 法 32/2007) に従い、本研究を行ったとケアと生物医学研究における動物の使用に関する欧州連合の指針 (ディレクティブ 2010年/63/EU).
 1。ラットの準備 注: 任意のホルモンの変化を避けるためにラットで実験を行った.
<ol><li>塩酸ケタミン (30 mg/kg) およびキシラジン塩酸塩 5 mg/kg を筋肉内注入の; この用量でミックスを使用して動物ラットがある深く麻酔約 1 h. の麻酔</li>
	<li>ピンチ ラット &#39; s つま先; 不在撤退の反射は完全に意識されていないことを示します。ラットは、ピンチに応答する場合は、初期投与量の 3 分の 1 で補助麻酔を与える</li>。
	<li>頭皮を剃るし、消毒ポビドン ヨード剤外科領域</li>。
	<li>は 38 ° C の温度を維持し、動物を安定させるために加熱パッドに動物を配置 &#39; s 頭脳定位固定フレーム 2 つ耳バーと一口バーを使用します。耳バーで鼓膜の穿孔を避けるために注意を使用します</li>。
	<li>ゲル状目薬または血清生理食塩水のドロップをそれぞれの目に適用することにより、目を保護します</li>。
</ol> 2。ラットの頭骨で AC の位置 <ol><li>、メスを使用すると、頭蓋骨を公開し、頭蓋骨の表面を覆う骨膜を撤回する正中線に沿って切開します</li>。
	<li>前、ラムダ、およびラット脳 22 の Paxinos とワトソンのアトラスによると両耳間 0 を視覚化する頭蓋骨の表面を覆っている血を取り除きます滅菌綿棒を使用します</li>。
	<li>は、メスと頭蓋骨における背側挿入の近く一時的な筋に切開を行います。針と縫合材料を使用して筋を引き、定位脳手術フレーム; 縫合材料を修正これは、側頭骨が公開されます。出血が発生した場合は冷滅菌生理食塩水ですすいでください</li>。
	<li>が完全に確保されているかどうかを確かめて、定位マイクロマニピュレーターで滅菌のストレート針を配置します</li>。
	<li>は、針の先端が耳 0 に設定されるよう、頭蓋骨の表面の真上まで針をゆっくりと下ろします。ゼロとしてこの点を設定し、この点から座標を決定します</li>。
	<li>興味の脳領域、によって定位座標が異なります。ラット脳 22 の Paxinos とワトソンのアトラスを利用して、これらの座標を決定します。座標が決まったら、それらの座標に合わせて針の移動します</li>。
	<li>は、次の 4 つのポイントの座標を使用して AC をターゲット: a: A/P =-5.80 mm M/L = ± 6.4 mm;B: A/P =-2.7 mm, M/L = ± 6.4 mm;C: A/P =-2.7 mm, M/L = 8.67 mm +/-D: A/P =-5.8 mm, M/L = ± 8.67 mm。 低い各これら 4 つのポイントを視覚化する頭骨の上右に針。マーカー ペンを使用して、側頭骨上の点をマークし、; 四角形を描画するためにそれらを接続四角形の骨 ( 図 1) のウィンドウに開くにはガイドとなる</li>。
</ol> 3。AC の外科的露出 <ol><li>オープン電気ドリルと小型のドリルを使用してウィンドウのビット (0.6 mm Ø)。骨を与えるまでは、8,000 rpm で四角形の境界をドリルします。皮質下構造物への損傷を防ぐため冷滅菌生理食塩水で洗浄して掘削面を冷やします。骨がくずれるとき、抵抗を検出できます。脳ドリルしないように注意してください</li>。
	<li>ボーダーがゆるんでいる微細鉗子で覆って骨をプルアップし、冷滅菌生理食塩水で保管しています</li>。
</ol> 4。AC のアブレーション <ol><li>手術顕微鏡 (10 倍) を使用して優しく顕微鏡ナイフで髄膜をカットし、2 つの細かい指摘鉗子を使用してそれらを削除します。出血が発生した場合は冷滅菌生理食塩水ですすいでください</li>。
	<li>には、AC 滅菌 20 G 鈍い先端針に結合手術吸引装置 (圧力-0.24 バー) を使用して優しく吸い出しなさい。この点は重要であり非常に慎重に実行する必要があります: 吸引のみ六つの皮質層と基になる白質ありません</li>。
	<li>穿通動脈が出血を止めるまで吸引します</li>。
	<li>吸引が終了したら、抽出された骨で傷つけられた区域をカバーし、吸収性止血ガーゼを適用します</li>。
	<li>は、側頭筋、元の位置を回復し、傷クリップ (9 mm) を使用して皮膚を縫合しましょう。抗生物質軟膏を適用 (材料の表 を参照してください)。3 日間 1 日 2 回の傷口に軟膏を適用し続ける 。
	メモ: 各アプリケーション、薄い層を傷に適用されます</li>。
	<li>ラット (0.05 mg/kg)、手術後鎮痛 1 h と 72 h の中に、すべての 8 h の後ろに皮下注入ブプレノルフィン</li>
	<li>、目覚めるまで加熱パッドの動物を維持し、回復するその住宅ケージに戻ります</li>。
	<li>は、ケージ仲間が縫合の領域に触れるを防ぐために個別に動物の家、いくつか強化アイテムを提供します。、感染を防ぐため、慎重に、動物が正常に回復して、不快感の任意の兆しを見せていないをチェックして毎日のおがくずを変更します。</li>
</ol> 5。組織コレクション 注意: 個人保護用具 (PPE) を着用し、安全キャビネットを使用してパラホルムアルデヒド (PFA)、固体と水の両方を処理する場合。
 注: 4% (w/v) PFA x リン酸緩衝液 (PBS) 熱 (55 ° C) を使用して 1 を溶解することにより 750 mL ホルムアルデヒド溶液を準備します。ろ紙をホルムアルデヒド溶液をフィルター処理します。リンガーを準備 &#39; 8.5 g nacl、KCl、1,000 mL の水に 0.2 g NaHCO 3 0.25 g を溶解することにより s ソリューション (pH = 6.9).
<ol><li>は、調査のため必要な限り生き残る動物をしましょう。AC 蒸散ラットで研究が完了したら、ペントバルビ タール ナトリウム (60 mg/kg) の 0.1 mL の腹腔注入による anaesthetize それ末期。つま先のピンチと逃避反射の不在によって麻酔の深さを評価します</li>。
	<li>動物は麻酔が深く、リンガーの 125 mL の心腔内灌流 23 を実行 &#39; s ソリューションは 1.8 mm の針ゲージを使用してホルムアルデヒド溶液の 750 mL に続いて内径</li>。
	<li>シンチグラムが終了したら、最初の頚椎でラットの首をはねる</li>。
	<li>は、皮膚を削除し、頭から筋にはさみを使用し、頭蓋骨を公開します。はさみを使って切り取り、後頭を開くし、頭蓋の後部を削除します</li>。
	<li>は、スペンサーのはさみを使用して軌道の骨切り、脳を公開する頭蓋骨の上端に沿ってカットする rongeurs を使用して横断を確認します。脳に損傷を与えないように注意してください</li>。
	一度脳を公開すると、<li>は、細かい指摘の鉗子を用いた硬膜を慎重に取り外します。そっと下をスクープし、脳に指を使用します。脳の発生し、神経 unt をカットイルは無料です。ホルムアルデヒド溶液で脳を浸すし、24 時間の 4 ° C で保存</li>
</ol> 6。AC 病変の局在 <ol><li>ポスト固定後慎重に脳の外側面を公開する矢状ラット脳行列に脳を配置します</li>。
	<li>21 cm 上記カメラを配置して皮質表面のカメラ ホルダーを使用して、選択、&#34; スーパー マクロ撮影 &#34; モード、および脳の表面の写真撮影</li>。
	<li>脳の背側表面を公開するコロナ ラット脳マトリックスに脳を配置し、別の写真を撮ます</li>。
	<li>イメージ エディター プログラムを使用すると、画像を開くし、彼らと仕事を容易にする 50% に縮小します。前、ラムダ、および Paxinos とワトソン座標 19, によると画像の両耳間 0 参照を識別し、写真 ( 図 2) の位置をマークします。脳の外側の画像上、アブレーションの輪郭を描画します。境界を計算します</li>。
	<li>インポート座標は、プライマリ (A1) と AC のセカンダリ領域 (背・腹側皮質) がある 18 写真使用して、エディター プログラムのファイルにマップします。地図上をクリックし、蒸散脳の外側の写真を重ね合わせてドラッグします。
	<ol><li>前を行いラムダ参照座標マップの外側の脳の画像で識別される前とラムダの参照と一致します</li>。
		<li>マップに脳の画像を調整する参照として嗅裂を使用し、( 図 2 b) を一致させます</li>。
	</ol></li> <li>計算交流によって占有される領域を基準にして病変の割合</li></ol>

<ol><li>Talwar, S. K., Gerstein, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+frequency+discrimination+in+the+white+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Auditory frequency discrimination in the white rat.</a> Hear Res. 126 (1-2), 135-150 (1999).</li>
<li>Heffner, H. E., Heffner, R. S., Contos, C., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Audiogram+of+the+hooded+Norway+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Audiogram of the hooded Norway rat.</a> Hear Res. 73 (2), 244-247 (1994).</li>
<li>Malmierca, M. S., Merchán, M. A. Auditory System. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/book/9780123742452">The Rat Nervous System</a>. , Academic Press. San Diego. 995-1080 (2004).</li>
<li>Delano, P. H., Elgoyhen, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+Auditory+Efferent+System%3A+New+Insights+from+Cortex+to+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Editorial: Auditory Efferent System: New Insights from Cortex to Cochlea.</a> Front Syst Neurosci. 10, 1-2 (2016).</li>
<li>Dinse, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+Case+for+Enrichment.+Focus+on+%22Environmental+Enrichment+Improves+Response+Strength%2C+Threshold%2C+Selectivity%2C+and+Latency+of+auditory+cortex+Neurons.%22%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Sound Case for Enrichment. Focus on "Environmental Enrichment Improves Response Strength, Threshold, Selectivity, and Latency of auditory cortex Neurons.".</a> J Neurophysiol. 92 (1), 36-37 (2004).</li>
<li>Polley, D. B., Heiser, M. A., Blake, D. T., Schreiner, C. E., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+learning+shapes+the+neural+code+for+stimulus+magnitude+in+primary+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Associative learning shapes the neural code for stimulus magnitude in primary auditory cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (46), 16351-16356 (2004).</li>
<li>Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracortical+Pathways+Determine+Breadth+of+Subthreshold+Frequency+Receptive+Fields+in+Primary+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intracortical Pathways Determine Breadth of Subthreshold Frequency Receptive Fields in Primary auditory cortex.</a> J Neurophysiol. 91 (6), 2551-2567 (2004).</li>
<li>Talwar, S. K., Musial, P. G., Gerstein, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mammalian+auditory+cortex+in+the+perception+of+elementary+sound+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Role of mammalian auditory cortex in the perception of elementary sound properties.</a> J Neurophysiol. 85 (6), 2350-2358 (2001).</li>
<li>Tan, A. Y. Y., Atencio, C. A., Polley, D. B., Merzenich, M. M., Schreiner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbalanced+synaptic+inhibition+can+create+intensity-tuned+auditory+cortex+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unbalanced synaptic inhibition can create intensity-tuned auditory cortex neurons.</a> Neuroscience. 146 (1), 449-462 (2007).</li>
<li>León, A., Elgueda, D., Silva, M. A., Hamamé, C. M., Delano, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+cortex+basal+activity+modulates+cochlear+responses+in+chinchillas%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Auditory cortex basal activity modulates cochlear responses in chinchillas.</a> PLOS ONE. 7 (4), e36203(2012).</li>
<li>Jager, K., Kossl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticofugal+Modulation+of+DPOAEs+in+Gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Corticofugal Modulation of DPOAEs in Gerbils.</a> Hear Res. 332, 61-72 (2016).</li>
<li>Dragicevic, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Olivocochlear+Reflex+Strength+and+Cochlear+Sensitivity+are+Independently+Modulated+by+auditory+cortex+Microstimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">The Olivocochlear Reflex Strength and Cochlear Sensitivity are Independently Modulated by auditory cortex Microstimulation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 16 (2), 223-240 (2015).</li>
<li>Clarkson, C., Herrero-Turrión, M. J., Merchán, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Auditory+Deafferentation+Induces+Long-Term+Plasticity+in+the+Inferior+Colliculus+of+Adult+Rats%3A+Microarray+and+qPCR+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Cortical Auditory Deafferentation Induces Long-Term Plasticity in the Inferior Colliculus of Adult Rats: Microarray and qPCR Analysis.</a> Front Neural Circuits. 6, 86(2012).</li>
<li>Clarkson, C., Juíz, J. M., Merch́an, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+regulation+in+calretinin+staining+in+the+rat+inferior+colliculus+after+unilateral+auditory+cortical+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Long-term regulation in calretinin staining in the rat inferior colliculus after unilateral auditory cortical ablation.</a> J Comp Neurol. 518, 4261-4276 (2010).</li>
<li>Clarkson, C., Juíz, J. M., Merchán, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+down-regulation+of+sound-induced+c-Fos+protein+expression+in+the+inferior+colliculus+after+ablation+of+the+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Transient down-regulation of sound-induced c-Fos protein expression in the inferior colliculus after ablation of the auditory cortex.</a> Front Neuroanat. 4, 141(2010).</li>
<li>Hunter, K. P., Willott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+bilateral+lesions+of+auditory+cortex+in+mice+on+the+acoustic+startle+response%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of bilateral lesions of auditory cortex in mice on the acoustic startle response.</a> Physiol Behav. 54 (6), 1133-1139 (1993).</li>
<li>Lamas, V., Arevalo, J. C., Juiz, J. M., Merchán, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+input+and+efferent+activity+regulate+the+expression+of+molecules+involved+in+cochlear+micromechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acoustic input and efferent activity regulate the expression of molecules involved in cochlear micromechanics.</a> Front Syst Neurosci. 8, 253(2014).</li>
<li>Lamas, V., Alvarado, J. C., Carro, J., Merchán, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+evolution+of+brainstem+electrical+evoked+responses+to+sound+after+restricted+ablation+of+the+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Long-term evolution of brainstem electrical evoked responses to sound after restricted ablation of the auditory cortex.</a> PLOS ONE. 8 (9), e73585(2013).</li>
<li>Lamas, V., Juiz, J. M., Merchán, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+the+auditory+cortex+results+in+changes+in+the+expression+of+neurotransmission-related+mRNAs+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Ablation of the auditory cortex results in changes in the expression of neurotransmission-related mRNAs in the cochlea.</a> Hear Res. 346, 71-80 (2017).</li>
<li>Doron, N. N., Ledoux, J. E., Semple, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+tonotopic+core+of+rat+auditory+cortex%3A+physiological+evidence+for+a+posterior+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Redefining the tonotopic core of rat auditory cortex: physiological evidence for a posterior field.</a> J Comp Neurol. 453 (4), 345-360 (2002).</li>
<li>Polley, D. B., Read, H. L., Storace, D. a, Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+auditory+receptive+field+organization+across+five+cortical+fields+in+the+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric auditory receptive field organization across five cortical fields in the albino rat.</a> J Neurophysiol. 97 (5), 3621-3638 (2007).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. Sydney. (2005).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564(2012).</li>
</ol>

著者らは、調査した潜在的な利益相反として解釈される可能性が商業や金融関係の不在を宣言します。

成功脳外科の蝶番 2 つの要因: 中と手順の後に生きている動物を維持、関心のある領域を正確に検索します。非耳毒性抗生物質は生存を助けるべきであること、ラット (逃避反射をテスト)、手術中に麻酔が深く、十分な鎮痛薬を受け取るを確認します。さらに、ラットは、それは低体温症を避けるために麻酔から目覚めるまで加熱パッドに保持されるべき。感染症への感受性は減る縫合と適切な技術が重要です: 動物はタイトな十分な傷にあまりテンションをかけることがなく除去を防ぐために注入したする必要がありますので、彼らの傷のクリップで迎え。
AC (または他の皮質領域) を正確に特定する前、ラムダ、および対象地域の制限を計算するための参照として使用する両耳間 0 の位置を決定することが重要です。座標の計算に間違いは、AC の部分切除やその他の周辺地域の不要な吸引になります。したがって、針の先端がだけ両耳間 0 で骨に触れるしがこのプロトコルの説明によると前後とメディオ水平座標に変換します。
本稿では、公開し、AC のアブレーション手術方法も説明しました。3 つの重要なステップがあります: 穴あけ加工、開口部および髄膜, と吸引によりアブレーションの除去。掘削する必要があります実行最小圧力と低速で高切削速度近くの皮質下構造に影響を与えることができる熱を生成します。ただし、低速を維持し、冷却冷滅菌生理食塩水で掘削エリアは、損害を防ぐ必要があります。さらに、最低気圧は頭蓋骨と基になる皮質への後の負傷の突然の中断を避けるために不可欠です。開閉カバー AC 髄膜の除去は、血管を破壊を避けるために慎重に行う必要があります。出血が発生した場合、初期と後期の予後はおおむね良好とそのような動物が信頼性の高い研究の包含の規準を満たしているかどうかは疑問であります。我々 はこの場合は安楽死をお勧めします。最後に、(おそらく効果的な病変の最も困難な面)、誤嚥は灰白質に制限する必要があります。白質の存在を検出するを助けることができる 2 つの指標がある: (1) 白質として、色のコントラストの変更、灰色の物質よりも明るいそして (2) 穿通動脈からの出血の停止。
脳のいずれかの操作が実行された後、ローカリゼーション、サイズ、およびその後の分析および動物から得られたデータの検証のための皮質で行われたプロシージャの拡張機能を評価するために必要です。本稿では、グループ18に記載された座標マップを用いた皮質でアブレーションをローカライズする方法を詳しく説明します。このマップは、組織学的セクション、ラット脳22の Paxinos とワトソンのアトラスとの相関のシリアル セクション再建から得られる解剖学的参照を使用して構築しました。したがって、マップはプライマリ (A1) と AC の二次野 (背と腹) によって区別します。この座標のマップの主な利点は、病変の迅速な同定が矢状脳マトリックスは、脳の外側面から撮影した画像を重ね合わせによりです。別の利点は解剖学の経験の少ない所が彼らの動物モデルに適合させることによってマップを使用できます。脳内灌流制御前、ラムダ、および両耳間 0 参照の間の距離を設定し、マップを拡大縮小する必要があるだけ切り上げまたは切り捨て。マップに脳の画像を調整するのにには、参照として嗅裂を使用します。脳組織切片に決定する必要がありますので、この座標のマップでは、アブレーションの深度を決定できません。
定位法 AC の手術手技との組み合わせは、ラットでは、AC をターゲットしたい任意の捜査によって簡単に合わせることができる基本的な方法です。これは急性実験または永続的なデバイスの注入が必要なのかもしれません。さらに、AC の外科的アブレーション使用されています以前モデルとして公聴会における慢性皮質剥奪の効果を研究します。AC 試練は、一方的な AC 試練他の皮質領域で発揮したり、ストロークのモデルとしての効果を研究にも使用できます。したがって、ここで説明した実験的デザインは、個別に、または実験的デザインの広い範囲に組み合わせに適用できる便利なメソッドです。

ラットは、聴覚神経で最も一般的に使用される動物のモデルの一つです。その動作の堅牢性はそれに 1 日試験の何百ものために働くことができます。その感度と聴覚1,2、および他の哺乳類の3に匹敵する、中央のシステムの解剖学的および機能的な組織のスペクトル視力するラットの広い範囲を分析するための適切な動物モデル聴覚神経科学における最近の研究テーマします。ラット聴覚野 (AC)、特に、構造、組織、および音声処理3の役割を理解しようとしているいくつかの解剖学的および生理学的な研究の対象とされています。今日では、AC は経験依存性可塑性、聴覚、シナプス受容野組織的、聴覚、皮質下で音の処理の皮質コントロールに興味がある神経科学者の間で人気となっています。核4,5,6,7,8,9。これらの新しいアプローチをもたらす課題に対応するには、研究活動を迅速に行う手順を正確に特定でき、外科的 AC を公開します。定位技術は生理学検査せず脳内の特定の領域にローカライズするやすくなります。動物の脳の大きさはわずかに変化するが、ラット脳頭蓋のランドマークから設定定位座標を使用して脳領域の任意の位置を決定できます。
制限された AC のアブレーションは、最も直接聴覚関連皮質の感覚領域の外科的切除です。対照的に他の方法は、冷却またはローカル リドカイン注射10、11,12, 慢性の損失関数の結果を AC の外科的切除など、AC の活動をブロックするために使用します。したがって、AC 試練は皮質の剥奪の長期的な影響だけでなく、病変の可塑性の後続の現象を勉強に適しています。AC の外科的試練定位法の組み合わせは、皮質コントロール剥奪13,14,15 の生理学的な行動、および分子の効果を研究する正常に使用されています ,16,17,18,19。たとえば、聴覚驚愕反射と聴性脳幹反応 (ABR)16の皮質切除の効果を研究する二国間 AC 試練とラットのモデルが使用されています。最近では、我々 は負傷18後 ABR 閾値、振幅、異なる時点での待ち時間でラット AC 農産物の二国間の試練対その片側の効果を比較しています。さらに、制限の AC のアブレーションのラットのモデルはまた劣った collicus13,14,15と内耳17 の鈴木経路変性の影響を研究する使用されています、19。脳のような操作の実行後、ローカリゼーション、サイズ、および大脳皮質の病変の拡張機能を評価するために必要なです。非常に有用な細胞応答20,21に基づく, 純音に反応マップの主な制限がラットの脳における聴覚のフィールドを検索するために必要な電気生理学的手法。以来、すべてではない所があるそのような録音をするための専門知識の必要な機器や、脳の表面の18のイメージに AC のウズラ限界の転送に基づく座標マップを構築しました。このマップは、生理学のテストを行わず、AC を検索する非常に便利なできます。
この議定書では、改良導かれた場所、手術手技、ラットでは、AC のアブレーションの方法について説明します。また、私たちの座標マップ18を使用して蒸散の頭脳の表面の画像上病変の拡張機能を簡単にローカライズする方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>脳定位固定装置フレーム</td><td>David Kopf Ins.</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>手術用顕微鏡</td><td>WILD M650 Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>DAGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>歯科用マイクロモーター</td><td>W&H elco</td><td>5118</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤぎざぎざ</td><td>B ブラウン</td><td>GD021R</td><td>0.6 mm</td></tr><tr><td>外科用吸引器</td><td>Atmos</td><td>Atmoforte E2</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>メリアル</td><td></td><td>30 mg/kg</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バイエル</td><td></td><td>5 mg/kg</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>SM-11</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>ロートン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポビドンヨウ素</td><td>メダ</td><td>ベタジン</td><td></td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水</td><td>血清 B.ブラウン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20G 滅菌針</td><td>テルモネオラス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コットンチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>縫合材料</td><td>B.ブラウン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗生物質軟膏</td><td>Quadriderm (Betametasona、Gentamicina、Clotrimazol) - シェリングプラウ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>dimeda</td><td>10.331.12</td><td></td></tr><tr><td>外科用針</td><td>World Precision Instruments</td><td>501940</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Indivior UK</td><td>Buprex</td><td>0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>dimeda</td><td>08.120.15</td><td></td></tr><tr><td>スペンサーはさみ</td><td>dimeda</td><td>08.804.14</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微手術用ナイフ</td><td>MSP</td><td>7503</td><td></td></tr><tr><td>吸収性止血ガーゼ</td><td>サージセル</td> サジタル<td></td><td></td></tr><tr><td>ラット ブレインマトリックス</td><td>アクティビショナルシステムズ</td><td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>ベトキノール</td><td></td><td>60 mg/kg</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>オリンパス 5.1 MP</td><td>C-5060 ワイドズーム</td><td>レンズ F2.8-4.8</td></tr> 創<tr><td>傷クリップ</td><td>反射 9</td><td></td><td>9 mm</td></tr><tr><td>キャンバス 12</td><td>ACD システム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニードルゲージ</td><td></td><td></td><td>直径 1.8 mm</td></tr><tr><td>セパリー ファンネル</td><td>labbox</td><td>11409</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>GluA2 プライマー Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>CGGCAGCTCAGCTAAAACT</td></tr><tr><td>GluA2 プライマー Reverse</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>TTGTAGCTGGTGGCTGTGTGA</td></tr><tr><td>GluA3 プライマー Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td></tr><tr><td>GluA3 プライマー Reverse</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td></tr></tbody></table>

改良導かれるアブレーションのラット聴覚野と脳の病変の局在

Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

ラット聴覚野 (AC) は経験依存性可塑性、聴覚の知覚・認識過程と音聴覚皮質下核処理の制御に興味を持っている聴覚神経科学研究者の間で人気になっています。新しい対処する課題を正確に特定するための手順と手術公開聴覚皮質研究のこの努力を促進すると。定位脳神経は針や聴覚皮質内のあらかじめ定義された位置に電極を接がに動物モデルにおける前臨床研究で使用します。次のプロトコルでは、斬新な方法で定位メソッドを使用します。我々 は、両方プライマリ (A1) を正確に公開を開いたら、ウィンドウを定義するラットの temporal bone、この方法を使用する交流のセカンダリ (背と腹) 野の表面に 4 つの座標点を識別、行いますし、手術AC のアブレーション。このような操作を実行すると、ローカリゼーション、サイズ、および大脳皮質の病変の拡張機能を評価するために必要です。したがって、AC のウズラ限界を脳の表面に転送することによって構築された座標のマップを使用して AC のアブレーションの死後を簡単に見つける方法についても述べる.改良導かれる場所と座標マップの死後、患部のローカライズの AC のアブレーションの組み合わせ、動物から得られる情報の検証を容易にしよりよい分析につながるとデータの理解。

3 ラット改良導かれた場所、手術手技、AC の一方的なアブレーションを行った。病変の局在を確認 3 つの試練が実行されるラット、AC (プライマリ、背側と腹側皮質) の主要な下位区分を侵入し、AC 面積 (図 2 b) の 80 から 100% の範囲で構成されています。
AC の厳しい試練を実行するここで説明されたプロトコルは、皮質聴覚核における大脳皮質コントロール剥奪の長期的な影響だけでなく、可塑性の後続の現象を研究する研究室で以前使用されています。生理 (ABR) を適用することによって検証された AC 試練のプロトコルこれらの研究行動 (応答を驚愕、prepulse 阻止;PPI), 分子 (DNA マイクロ アレイ、qPCR と西部のしみ) 方法13,14,15,16,17,18,19。ここでは、プロトコルの有効性を示すためには、1 週間を乗り切る 3 つの AC のアブレーション ラットをさせてし、収集組織コレクション中に蝸牛ステップ大人の蝸牛に存在の最も関連性の高い AMPA サブユニットの発現の変化の検討、GluA2、GluA3、qPCR による。AC から成績比較アブレーション ラットおよびすべての手術のプロセスがない皮質切除を行ったシャム対照動物は、GluA2、およびアップ規制ダウン規制を示した GluA3 の両方の蝸牛 (図 3) で、これは私たちの前に一致して研究19。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
図 1: 3 つの異なる手術の手順でラット頭骨のイメージ。(A) の転送は、AC の定位座標の頭骨。4 つのポイントの座標は、: a: A/P =-5.8 mm, M/L = ± 6.4 mm;B: A/P =-2.7 mm, M/L = ± 6.4 mm;C: A/P =-2.7 mm, M/L = 8.67 mm +/-D: A/P =-5.8 mm, M/L = ± 8.67 mm. (B)、座標はウィンドウの開口部をガイドする、側頭骨の表面に四角形を描画する参照として使用されます。(C) 掘削後骨の開かれたウィンドウを示しています。血管と髄膜は脳の表面に観察できます。R: 吻側、d: 背側。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
図 2: ラット脳の病変を検索するための手順です。(A) (Paxinos とワトソン座標19) によるとラムダと前改良注入針と AC のアブレーション脳の背側表面の写真。点線は、脳の背側表面のように前と Interaural 0 9 cm × 9 cm グリッド内の位置をマークします。AC の座標の地図を重ね合わせた蒸散脳の外側面の (B) の写真。病変の境界は、図の赤で表示されます。AC 領域の境界は、地図で黒で表示されます。この例では、AC での占有面積に対する AC のアブレーションの割合は、84.79% です。AC: 聴覚野、IA: 聴覚間 FR: 嗅裂。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
図 3: 片側 AC 試練 7 日後病変の後の AMPA 受容体サブユニット GluA2 と GluA3 の mRNA のレベルで変更します。結果は、フォールドの変更の平均 ± 標準偏差として掲載されています。GluA2 成績の変更は青色で表されます。GluA3 成績の変更は赤で表示されます。GluA2 の大幅な減少と GluA3 の増加は両方の蝸牛で観察される (歯髄およびアブレーションに対側)、手術後 7 日目ないの皮質の試練と偽のコントロールを基準にしてこれは私たちの以前の結果19と一致しています。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

改良導かれる場所、露出、およびラットの大脳皮質聴覚野のアブレーション法について述べる。アブレーションのローカリゼーションは、座標マップ死後を使用して評価されます。

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

この手順の全体的な目標は、聴覚皮質の定位誘導アブレーションと、脳の表面の写真上に病変を特定するための座標マップの使用を説明することです。この方法は、聴覚神経科学の研究者が、音の知覚における経路における皮質の役割に取り組むのに役立ちます。メカニズムとラインの位置可塑性と同様に。この技術の主な利点は、どの研究者も適応できる基本的な方法を使用して、聴覚皮質の外科的曝露とアブレーションを可能にすることです。したがって、この方法は聴覚神経科学の分野で有用であり、視覚や体性感覚などの他のシステムにも適用できます。この方法は、片側性聴覚皮質アブレーションが他の皮質領域に及ぼす欠陥を研究するためにも使用できます。聴覚皮質を正確に特定するには、定位固定装置座標の適切な識別と側頭骨への変換が不可欠であるため、この方法を視覚的に示示することが重要です。この手順を開始するには、麻酔をかけたラットを温熱パッドの上に置いて体温を維持します。.次に、2つのイヤーバーとバイトバーを使用して、動物の頭を定位固定フレームで安定させます。頭皮を剃り、ポビドンヨードで手術部位を消毒します。メスを使用して、正中線に沿って切開を行い、頭蓋骨を露出させ、頭蓋骨の表面を覆っている骨膜を引っ込めます。その後、滅菌綿の先端を使用して、頭蓋骨の表面を覆っている血液をやさしく取り除きます。ブレグマ、ラムダ、および両耳間線を視覚化するために、頭蓋骨の背側挿入部近くの側頭筋をメスで切開します。その後、針と縫合材を使って筋肉を引き出し、側頭骨を露出させるために定位フレームに縫合材を固定します。滅菌されたまっすぐな針を頭蓋骨の表面の真上に来るまでゆっくりと下げ、針の先端が両耳間ゼロになるようにします。この点を 0 に設定します。その後、4つのポイントを使用してACをターゲットにします。次に、針を側頭骨の真上に下げて、これら4つのポイントのそれぞれを視覚化します。側頭骨にマーカーでポイントをマークし、それらを接続して長方形を描画します。長方形は、骨の窓を開くためのガイドとして機能します。この手順では、電動ドリルと小さなドリルビットを使用してウィンドウを開きます。骨があきらめるまで、長方形の周囲を8, 000 rpmでドリルで穴を開けます。皮質下構造の損傷を防ぐために、穴あけ面を冷たい滅菌生理食塩水ですすいで冷却します。骨が崩れたら、脳に穴を開けないように注意してください。境界線がなくなったら、細かい鉗子で覆っている骨を引き上げ、冷たい滅菌生理食塩水で保管します。手術用顕微鏡を使用して、マイクロサージカルナイフで髄膜を優しく切り、先の尖った2つの鉗子を使用して髄膜を取り除きます。出血が発生した場合は、手術部位を冷たい滅菌生理食塩水ですすいでください。次に、滅菌済みの20ゲージの鈍い先端の針に結合された外科用吸引装置を使用して、ACを静かに吸引します。6つの皮質層のみを吸引し、その下にある白質は吸引しません。この点は重要であり、非常に慎重に実行する必要があります。吸引が終了したら、抽出した骨で手術部位を覆い、吸収性止血ガーゼを塗布します。側頭筋を元の位置に戻してから、傷口クリップを使用して皮膚を縫合します。その後、傷口に抗生物質軟膏を塗ります。その後、手術終了後1時間8時間後に、鎮痛剤としてラットの背中にブプレノルフィンを皮下注射します。動物が目を覚ますまで加熱パッドの上に置いたままにし、回復のために飼育ケージに戻します。ACアブレーションラットで行われた研究が完了したら、0.1ミリリットルのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により終末麻酔をかけます。.リンガー溶液とホルムアルデヒドの心臓内投与を行った後、頭から皮膚と筋肉を取り除き、頭蓋骨を露出させます。.スペンサーハサミを使用して、眼窩骨に横方向の切り込みを入れます。その後、頭蓋骨の裏側を取り外し、ロンジャーを使用して頭蓋骨の上端に沿って切り込み、脳を露出させます。脳を傷つけないように注意してください。脳が露出したら、先の尖った鉗子を使用して硬膜を慎重に取り除きます。指を使って脳の下を優しくすくい取り、脳を高めます。次に、脳を持ち上げ、神経が自由になるまで神経を切断します。その後、脳をホルムアルデヒド溶液に浸し、摂氏4度で24時間保存します。固定後、脳を矢状ラット脳マトリックスに慎重に置き、脳の側面を露出させます。カメラホルダーを使用して、皮質表面から21センチメートル上にカメラを置きます。次に、スーパーマクロ撮影モードを選択し、脳の表面を撮影します。その後、画像編集プログラムを使用して、画像を開き、50%縮小します Bregma、Lambda、および両耳間ゼロ参照を特定し、画像内の位置に印を付けます。脳の外側の画像の上にアブレーションの輪郭を描きます。聴覚皮質の一次領域と二次領域が位置する座標マップをエディタープログラムのファイルにインポートします。次に、地図をクリックしてドラッグし、アブレーションされた脳の側面写真に重ね合わせます。座標マップの Bregma と Lambda の参照を、外側の脳の写真で識別された Bregma と IA の参照と一致するようにします。次に、鼻裂を基準にして、脳の画像を地図に合わせて調整し、それらを一致させます。白質が無傷であることを確認することが重要です。これは、最初に脳のシリアルセクションを免疫染色することによって行うことができます。私たちのプロトコルの有効性を実証するために、ACアブレーションされた3匹のラットを1週間生存させた後、蝸牛を採取して、成体の蝸牛に存在する最も関連性の高いAMPAサブユニットであるGluA2およびGluA3の発現の変化をqPCRによって研究しました。ACアブレーションラットと偽対照動物からの転写産物の比較では、両方の蝸牛でGluA2のダウンレギュレーションとGluA3のアップレギュレーションが示され、これは以前の研究と一致しています。手術を試みる際には、最小限の圧力で最低速度で側頭骨をドリルすること、血管が壊れないように髄膜を慎重に除去すること、そして吸引を灰白質に制限することの3つのことを覚えておくことが重要です。一度習得すると、聴覚皮質の外科的露出とアブレーションは、適切に行われれば45分で行うことができます。この手順に続いて、聴覚皮質の欠如がさらなる感覚系の機能にどのように影響するかなどの追加の質問に答えるために、生理学的、行動的、および/または免疫細胞化学的方法を実行できます。

stereotactically-guided-ablation-rat-auditory-cortex-localization

Research

JoVE Journal

Behavior

行動

我々は、神経活動と血中酸素レベル依存（BOLD）MRI信号との関係の調査のためのプラットフォームを提供し、齧歯類の脳における同時機能的磁気共鳴イメージングと電気生理学的記録法を開発した。...

齧歯類の脳における同時fMRIと電気生理学

定位座標を使用して、興奮性毒を注入することにより、特定の脳領域の対象とアブレーション（s）は記載されています。この手法はまた、ラット脳内に他の化学物質の注入に適応することができます。...

大人のラットの特定の脳領域の興奮毒性病変に対する定位手術

このビデオは、無線双方向マルチチャンネル電極ユニットをラットの脳に埋め込んで、マルチチャンネルニューラルネットワークを記録し、刺激する手順を示しています。...

ラット脳への無線双方向微小電極システムの移植

このビデオは、電気刺激を使用して麻酔をかけたラットの橋に組織損傷または梗塞を誘発する手順を示しています。...

電気刺激を用いたラットモデルにおける急性ポンス梗塞の誘導

このビデオでは、ラットの聴覚皮質を切除するための定位誘導手術を示しています。その手順には、定位フレームに固定された麻酔ラットの解剖学的ランドマークの特定、聴覚野の上の頭蓋骨に窓を作ること、皮質層を吸引すること、アブレーションが音響処理に与える影響を評価するための術後ケアの提供などが含まれます。...

ラットの聴覚皮質除去のための定位誘導アブレーション技術

このプロトコルは、齧歯類における同時機能的磁気共鳴画像法及び深部脳刺激のための標準的な方法を記載している。これらの実験のツールを併用することは事実上すべての脳のターゲットに電気的刺激に反応して世界的な下流の活動の探査が可能になります。...

げっ歯類での同時のfMRIと脳深部刺激

ラットの視床下核(STN)に電極を埋め込む方法が説明されています。STNのより良い位置特定は、マイクロレコーディングシステムを使用することで達成されました。さらに、動物の頭部と刺激装置との間の長期的な接続を特徴とする刺激セットアップが提示されます。...

微小電極は、長期的な脳深部刺激のためのラットの視床下核に電極の移植ガイド付き

この研究では、方法論は、ウレタン麻酔下での超指向経路からのマルチサイトインビボ電気生理学的記録をどのように行うかについて提示されている。...

急性<em&gt;インビボ</em&gt;麻酔ラットにおけるHyperdirect経路からの局所場ポテンシャルとマルチユニット活性の電気生理学的記録

ワイヤレス、マルチ チャンネル記録と自由行動下ラットにおける刺激の双方向システムを導入します。システムは軽量でコンパクトなこのように animal´s...

ワイヤレス、 In Vivo記録そして自由行動下ラットにおける神経活動の刺激のための双方向インタ フェース

このプロトコルでは、共局在脳波 (EEG) や麻酔下のラットにおける潜在的なマルチ-層流のローカル...

共局在脳波および齧歯動物のローカル フィールド電位の同時記録

in vivo FDG-PETによる急性脳深部刺激療法により誘導される代謝性神経調節を評価するための前臨床実験法について述べる。この原稿には、定位固定装置手術から刺激治療の適用、PET画像の取得、処理、分析まで、すべての実験ステップが含まれています。...

生体内 ラットの脳深部刺激による活動パターンを明らかにする陽電子放出断層撮影法

学ぶラット聴覚野のステレオタクシック誘導アブレーション法。座標マップを用いて病変を正確に局在化し、神経科学研究における皮質機能の解明に活用できます。

改良導かれるアブレーションのラット聴覚野と脳の病変の局在

さらに動画を探す