コレステロール粒子の形態を調節することで脂質低下薬の効果

この研究の全体的な目標は、プラークアレイ法を使用してコレステロール粒子の形態学的特徴を調節する脂質低下薬の効果を評価し、アテローム性動脈硬化症の診断と薬物効果の決定のための潜在的なバイオマーカーを特定することです。コレステロール粒子形成の調節における脂質低下薬の役割は、ほとんど理解されていません。ここでは、脂質低下薬がコレステロール粒子形成のプロファイルと形態学的特徴を変えるのに直接的な役割を果たしていることを示しています。

in vitroイメージング法に基づくプラークアレイ法が他の粒子検出法よりも優れている点は、血清中の脂質低下薬の効果を評価するためのコレステロール粒子の可視化が可能になることです。Plaxgenのラボ技術者であるJason Lundryが、化学分析装置を使用してプラークアレイアッセイをどのようにセットアップしたかを実演します。Millipore SigmaのシニアサイエンティストであるRaymond Kongが、イメージングフローサイトメトリーを使用してサンプル処理を行う方法を示します。

最後に、Plaxgenの検査技師であるDavid Liu氏が、コレステロール粒子画像のデータ分析を実演します。化学分析装置-1を使用して、コレステロール粒子形成のためのプラークアレイアッセイをセットアップします。アッセイ全体を通して、各ウェルの最終反応量を200マイクロリットルに維持し、すべてのアッセイを3回に分けて実施します。

まず、丸底の低タンパク質結合性96ウェルプレートの各ウェルに、194ポイント5マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水、またはPDSをロードします。各ウェルに、各脂質低下薬液の2点5マイクロリットルを加え、ネガティブコントロールサンプルに薬物は添加しない。その後、プレートを化学分析装置-1反応プレートに載せて30秒間振とうし、薬剤を溶液に均一に混合します。

最後に、蛍光標識されたコレステロール凝集液2マイクロリットルを各ウェルに加えます。前回と同様に、プレートを化学分析装置-1反応プレートに載せて30秒間振とうします。次に、プレートをラボ用シェーカーで37°C、200rpmに設定した2時間インキュベー

インキュベーション後、イメージングフローサイトメトリーにより粒子の画像を取得します。データ集録テンプレートを開き、正しい計測器設定をロードします。「ファイル」をクリックし、「テンプレートのロード」を選択して、テンプレート・ファイルを選択します。

「Load」をクリックして、サンプルをロードするための装置を準備します。Load Sampleダイアログボックスが開いたら、[OK]をクリックして50マイクロリットルのサンプルをイメージングフローサイトメーターにロードします。粒子がイメージングエリアにリアルタイムで見えるようになるまで待ちます。

イメージング領域内の粒子にピントが合ったら、[取得]をクリックして、暗視野、明視野、緑色蛍光、および黄色蛍光の各オブジェクトの画像をハイスループットで同時に取得します。取得の最後に、Returnボタンをクリックしてサンプルを返却します。これらの手順を繰り返して、各サンプルから5, 000〜10, 000個の粒子を取得します。

画像解析ソフトウェアを使用してすべての生画像ファイルを解析し、テキストプロトコルに記載されているように、物体の蛍光強度と形態学的変化を決定します。丸底の低タンパク質結合性96ウェルプレートを、ウェルあたり200マイクロリットルの最終反応量を使用して、試薬を段階的にロードして調製します。まず、コントロールウェルを準備します。

各ウェルに193マイクロリットルのPBSをロードします。患者血清の2.5%を添加し、ウェルごとに1つの血清サンプルのみをロードします。その後、プレートを化学分析装置の反応プレートに載せて30秒間振とうします。

次に、2マイクロリットルの蛍光標識コレステロール凝集体溶液を各ウェルに加えます。再度、プレートを化学分析装置-1反応プレートに置いて30秒間振とうします。薬で井戸を準備するには、各井戸に191マイクロリットルのPBSをロードします。

次に、ウェルごとに各患者血清の2.5%を添加し、プレートを化学分析装置-1反応プレートに置いて30秒間振とうします。エゼチミブ、ロバスタチン、シンバスタチン、またはナイアシン溶液の2マイクロリットルを、ネガティブコントロールウェルを除くすべてのウェルに追加します。ウェルごとに1つの薬剤のみを追加します。

先ほどと同じようにプレートを30秒間振るに進みます。次に、プレートを30秒間振とうする前に、2マイクロリットルの蛍光標識コレステロール凝集体溶液を各ウェルに加えます。次に、プレートを37°C、200rpmに設定したラボ用シェーカーで2時間インキュベートします。

インキュベーション後、前回と同じ設定に従ってフローサイトメトリーをイメージングしてサンプルを取得します。画像分析ソフトウェアを使用して、テキストプロトコルで説明されているように、すべての画像ファイルをバッチ処理します。ここに示されているのは、スタチンによって誘導される球状および線状の鎖状のコレステロール粒子を非酵素メカニズムで同定する代表的な結果です。

他の脂質低下薬によって誘発されるコレステロール粒子形成の2つの異なる形態の確認が示されています。エゼチミブ、ナイアシン、フィブラート、オメガ3脂肪酸を含みます。ここに示されているのはドットプロットで、X軸は緑色の蛍光チャネルで検出されたコレステロール粒子のスペクトルを示しています。

また、Y軸は側方散乱光を表示し、ゲーティングは蛍光ドットプロットで検出された非常に低密度のリポタンパク質、低密度リポタンパク質、および高密度のリポタンパク質粒子の領域を示しています。これらの結果は、エゼミド、ロバスタチン、シンバスタチン、ナイアシンなどの薬剤がない場合に、脂質低下効果が精製されたVLDLおよびLDLコレステロール粒子のプロファイルをどのように変化させるかを示しています。ここに示されているのは、VLDL、LDL、およびHDLコレステロール粒子形成のプロファイルを調節する、さまざまな脂質低下薬の異なる効果を特定するための3つの異なる血清サンプルのスクリーニングです。

これらのプロファイルは、3つの異なる血清サンプル間で応答レベルにもばらつきがあることを示しています。血清サンプル1のスクリーニングにより、薬物を使用せずに、およびさまざまな脂質低下薬の存在下で形成された球状および線状のコレステロール粒子について、血清由来コレステロール粒子の2つの異なる形態が確認され、球状および線形鎖形状を示します。そこで、コレステロール粒子形成とその臨床的意義との関係を調節する脂質低下薬の効果を特定するためのinvitroイメージングアプローチを成功裏に実証しました。

私たちの予備的な結果は有望であり、大規模な臨床サンプルを使用してこのプラークアレイアッセイをさらに検証する過程にあります。標準的な脂質パネルは、血清中のLDLコレステロールとHDLコレステロール値を測定します。私たちのプラークアレイアッセイは、アテローム性動脈硬化症のリスクの精度を向上させることを目指しており、血清を使用して脂質低下薬物反応を予測します。