Name: コレステロール粒子の形態を調節することで脂質低下薬の効果 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぶ脂質低下薬がコレステロール粒子の形態を調節するメカニズムをプラークアレイ法で可視化する方法。イメージングフローサイトメトリーによりVLDL・LDL粒子のプロファイル変化を解析し、動脈硬化症診断のバイオマーカー同定に応用できます。

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この作品は、Plaxgen 研究で賄われていた SM (plx 社-1008) に与えられる補助金。IRB の承認の下で動脈硬化科目から血清試料を採取、パロ ・ アルト医療研究財団研究所に感謝します

1 準備の蛍光ラベル コレステロールと脂質低下薬 注: 私たちの以前の記事で説明したように蛍光コレステロール集計とスタチン系薬剤が準備された。 21 します詳細については本研究で使用されるデータ解析ソフトウェア、化学分析装置、フローサイト イメージング試薬の 材料表 を参照してください。。
<ol><li>凍結乾燥コレステロールの蛍光標識を可溶化 (1 mg Ex/Em = 495 nm/507 nm) を 1 mL 100% アルコールの粉末</li>。
	<li>2,040 × g で 3 分のサンプルを遠心し、プラークアッセイ配列の水溶性蛍光標識コレステロール骨材を含む上清を使用します</li>。
	<li>薬の準備のため個別に可溶化粉末 (2 mg) を 1 ml 100% アルコールのオメガ 3 脂肪酸、エゼチミブ、アトルバスタチン ロバスタチン シンバスタチン</li>。
	<li>2,040 × g で 3 分間遠心分離した後薬剤アッセイを含む上清を使用します</li>。
	<li>同様に、可溶化個別に粉末 (2 mg) フルバスタチン、ロスバスタチン、ナイアシン、2 mg/mL の原液を作るために脱イオン水 1 mL に fibrate と</li>。
	<li>2,040 × g で 3 分間遠心分離後プラークアッセイ配列で薬を含む上清を使用します</li>。
</ol> 2。審査 体外 コレステロール粒子形成配列プラークアッセイ <ol><li>使用化学アナライザー-1 (材料の表を参照) コレステロール粒子形成のプラークアッセイ配列を設定します。丸底、セクション 1 で調製試薬を用いる低蛋白結合 96 ウェル プレートでアッセイを実行します。各 200 μ L でも最終反応体積を維持し、3 通すべてのアッセイを行う。
	<ol><li>まず、リン酸の負荷 194.5 μ L 緩衝生理食塩水 (PBS) 各ウェルにします</li>。
		各も各脂質低下薬ソリューションの 2.5 μ L (5 μ g) を追加し、30 の板を振る <li>ソリューションに薬剤を均一に混合する化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことで s。薬は陰性対照サンプルに追加されません</li>。
		<li>最後に、各ウェルに 2 μ L (2 μ g) 蛍光コレステロール集計ソリューションを追加し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
		<li>37 ° C、200 rpm で設定 2 h のラボ シェーカーでプレートをインキュベートします</li>。
		<li>インキュベーション後、フローサイトメトリーによる粒子の画像を取得します</li>。
	</ol></li></ol> 3。キャプチャ画像のコレステロール粒子を用いたイメージング フローサイトメトリー <ol><li>オープン データ収集テンプレート正しい計測器設定を読み込めません。クリックして " ファイル " を選択、" テンプレートを開く … " テンプレート ファイルを選択</li>。
	<li>をクリックして " フラッシュ、ロック、負荷 " サンプル読み込み用計測器を準備する</li>。
	<li>時、" を読み込むサンプル " 対話ボックスが開き、をクリックして " OK " イメージングの流れの cytometer にセクション 2 でも作成から 50 μ L のサンプルをロードする</li>。
	<li>をクリックして " を実行 |セットアップ " リアルタイムでイメージング領域にパーティクルを表示する</li>。
	<li>イメージングの領域に粒子が良いフォーカスをクリックして " を実行 |取得 " 黄色蛍光、蛍光グリーン、明るいフィールド (BF) 暗視野 (側散布/SSC) の高スループット方法で各オブジェクトの画像を同時に取得する</li>。
	<li>3.2 3.5 各サンプルから 5,000-10,000 の粒子を取得する手順を繰り返します</li>。
	<li>画像解析ソフトを使用してオブジェクトの蛍光強度と形態学的変化を決定するすべての raw 画像ファイルを分析します。
	<ol><li>をクリックして、" ツール " 画像解析ソフトの上部にあるボタンをクリックし、[" バッチ データ ファイル " が開かれるドロップ ダウン メニューから、" バッチ " ウィンドウ</li>。
		<li>で、" バッチ " ウィンドウ、クリックして、" 追加バッチ " ボタンを開いて、" バッチを定義 " ウィンドウ</li>。
		<li>で、" バッチを定義 " ウィンドウ、クリックして、" ファイルの追加 " ボタンし raw イメージ ファイルを選択し、[、" テンプレート " 適切なデータ分析テンプレート ファイルを選択し、選択ボタンをクリックして " [ok] " と " 送信バッチ "raw 画像ファイルの処理、分析を開始します</li>。
	</ol></li></ol> 4。プラーク配列分析による評価の脂質低下薬コレステロール粒子の精製及ぼす <ol><li>ステップ 2.1 で説明したよう実行精製 VLDL、LDL、HDL リポタンパク質/粒子を用いたコレステロール粒子形成アッセイ。96 ウェル プレートでプラークの配列分析を実行します。
	<ol><li>、PBS のすべての井戸を読み込む; 各ウェルに 200 μ L の最終巻を使用します</li>。
	</ol></li> <li>ネガティブ コントロール追加 4 μ g VLDL、LDL、または HDL 蛋白質/粒子個別に薬なしもし、30 の板を振る s.
	<ol><li>の脂質低下薬の効果を調べると、4 μ g VLDL、LDL を追加または HDL 蛋白質/粒子それぞれ個別にも、30 の板を振る s.</li>
		<li>井戸 4 μ g VLDL や LDL、HDL で追加した、2.5 μ L (5 μ) エゼチミブ、ロバスタチン、シンバスタチン、またはナイアシン ソリューションを追加し、30 の板を振る化学アナライザー-1 に置くことで s.</li>
		<li>最後に、すべてのウェルに 2 μ L (2 μ g) 蛍光標識コレステロール集計ソリューションを追加し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
	</ol></li> <li>37 ° C、200 rpm で設定ラボ シェーカーで 2 h のプレートをインキュベートします</li>。
	<li>次のステップ 3.1 から 3.5 イメージング フローサイトメトリーを使用してサンプルを取得します</li>。
	<li>3.7 の手順で説明されているように画像解析ソフトを使用して raw イメージ ファイルを分析します</li>。
	<li>解析テンプレートでコレステロール粒子集団の同定のため以下のゲーティング スキームを使用します。
	<ol><li>飽和緑チャンネル ピクセル数 (x 軸) と暗視野のチャネルのプロット上飽和画素数 (y 軸)、いずれかのチャネルで 1 つ以上の飽和ピクセル オブジェクトは拒否します</li>。
		<li>飽和ピクセル グリーン チャンネルの強度 (x 軸) と SSC 強度 (y 軸) を使用してせずにオブジェクト/粒子を印刷: オブジェクト、緑のチャネルと SSC 強度に基づいて 3 つの地域 (VLDL、LDL、HDL) のいずれかに分類できます 。
		注: これらのゲートは、蛋白質を使用して精製された VLDL、LDL、HDL 粒子/薬がなければ実施制御実験から生成されたデータに基づいて作成されました</li>。
	</ol></li> <li>各サンプルの脂質低下薬の効果を判断するに記載されている手順 6.5 として総リポ蛋白粒子濃度だけでなく、各サブポピュレーション (VLDL、LDL、HDL) の比率を計算します。
	<ol><li>計算粒子濃度 (粒子/mL) 次の同等化を使用して: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg"> 注:、VLDL、LDL、および HDL ゲート蛍光ドット プロット領域検出 〜彼らのそれぞれ球と残りの 80% 〜 粒子の 20% が他ゲート領域とオーバー ラップします</li>。
	</ol></li></ol> 5。血清脂質濃度の測定 <ol><li>化学アナライザー - 2 LDL、HDL、コレステロールおよびトリグリセリドの濃度を決定する、年齢をマッチさせたノーマルと高脂血症被験者から得られた血清を使用します</li>。
	<li>LDL、HDL、コレステロールおよびトリグリセリドの濃度と血清で上限と下限の基準値を超えて識別の異常な濃度を定義します</li>。
	<li>に従って通常の参照値あded 試薬製造元によって: コレステロール (4 200 mg/dL)、HDL (3.0 65 mg/dL)、(4-100 mg/dL)、LDL およびトリグリセリド (9-200 mg/dL).</li>
	<li>血清脂質低下薬の有無のスクリーニングのためにそれらを使用コレステロールとトリグリセリドの値より低い基準値以下またはより高い参照の上と異常値を持つ識別します</li>。
</ol> 6。血清中コレステロール粒子形成に対する薬物の効果を分析 <ol><li>使用化学アナライザー-1 血清中コレステロール粒子形成のプラークアッセイ配列を設定します。丸底、低蛋白結合 96 ウェル プレートでアッセイを実行します。200 μ L/ウェルの最終反応量を使用し、3 通すべてのアッセイを実行します</li>。
	<li>試薬を段階的に読み込むことによって板を準備する。
	<ol><li>コントロール井戸を準備します</li>。
		<li>ロード 193 μ L の PBS を各ウェル</li>。
		<li>2.5% (v/v) 患者血清 (ウェルあたり 1 つだけ血清サンプル) を追加し、30 の板を振る化学アナライザー リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
		<li>蛍光標識コレステロールの追加 2 μ L (2 μ g) を各ウェルにソリューションを集約し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
	</ol></li> <li>薬井戸の準備します。
	<ol><li>ロード 191 μ L の PBS を各ウェル</li>。
		<li>2.5% (v/v) 患者血清 (ウェルあたり 1 つだけ血清サンプル) を追加し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
		<li>追加 2 μ L エゼチミブ、ロバスタチン、シンバスタチンまたはナイアシン ソリューション (4 μ g) すべてのウェルには、陰性対照の井戸を除きます。ウェルあたり 1 つだけ薬を追加し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
		<li>蛍光標識コレステロールの追加 2 μ L を各ウェルにソリューション (2 μ g) を集約し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s.</li>
	</ol></li> <li>すべての井戸の後にのみ薬剤を読み込む (制御および薬物治療)、それぞれ血清サンプルを装填しているし、このステップの終わりに蛍光標識のコレステロールを追加</li>。
	<li>37 ° C、200 rpm で設定ラボ シェーカーで 2 h のプレートをインキュベートします</li>。
	<li>流れの cytometer 次の手順 3.1 3.6 で説明する設定をイメージングによるサンプルを取得します</li>。
	<li>バッチ 3.7 の手順で説明されているように同じテンプレートを使用してすべてのイメージ ファイルを処理のためのソフトウェアの分析画像を使用します。
	<ol><li>4.5 および 4.6 の手順の説明に従って、プロット上ゲートを描画することによってデータの分析を実行します</li>。
	</ol></li> <li>応答を判断する脂質低下薬効果/(低、中、高) の各サンプルに対して、総リポ蛋白粒子濃度だけでなく、HDL、LDL、VLDL を構成する全粒子の割合を計算します。subpopulations</li>。
	<li>プロット オブジェクトのヒストグラムを HDL、LDL、VLDL の集団 ' s 明視野像、球状または線形領域の長さ (長さ・幅) とゲートから減算の幅: (長さ・幅) を持つオブジェクト ≤ に陥る 2 μ m、球状のおよび線形の割合を計算するための球状領域形粒子</li>。
	<li>は、球状と線形形 LDL および HDL コレステロール粒子孵化各薬剤の有無にかかわらず各血清サンプルの特定の割合を比較します。各血清サンプルで得られた値を帳票、間で球状と線形の割合形薬の効果の定量 SD ± 2 の範囲内にある LDL および HDL の粒子を受け入れる</li>。
</ol>

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博士 Madasamy Plaxgen 株式会社から助成を受けたし、競合する金融関心を持っています。他の著者は開示する競合金融興味を持ってないです。

一般に、分布と血液の循環、HDL、LDL、VLDL のコレステロール粒子の機能特性主に代謝、遺伝的、疫学的、携帯と血漿因子22,23によって決定されます。本研究では脂質の変更の影響を調べるバッファー内薬エゼチミブ、ロバスタチンとシンバスタチン、アトルバスタチンなど高脂溶性薬物がコレステロール粒子の形態により高いレベルの複雑さを誘発を明らかにしました。超親水性のロスバスタチン、フルバスタチンの薬で観測された低レベルの効果と比較。これらの結果は、良い契約、バッファーおよび血清サンプル21で LDL と HDL のコレステロール粒子形成を調節する際にスタチン系薬剤の非酵素的方式の効果を説明する私たちの以前の研究でしたがって、本研究の結果は、非酵素的エゼチミブ、fibrate、ナイアシン、コレステロール粒子形成を調節することに直接的な役割を果たす可能性がありますオメガ 3 脂肪酸薬の作用機構を明らかにしました。薬とコレステロール骨材間の相互作用が球状と線形鎖の形態を示す 2-60 μ m2、大型コレステロール粒子のアセンブリをもたらすことが可能です。
精製されたリポ蛋白粒子を使用して得られた結果がコレステロール集計および組成とコレステロールの形態学的性質を変更することが HDL、LDL、VLDL の蛋白質を含むプラズマの要因間の相互作用を提案するほか、粒子。精製リポ蛋白粒子を含む薬物治療の結果には、VLDL 粒子形成に比べて LDL コレステロール粒子形成で観察された効果の高いレベルの薬の効果が示されます。ロバスタチンとシンバスタチン、エゼチミブの薬はプロ薬として使用され、その投与法が生理学的濃度を上回る可能性があります。
興味深いことに、HDL、LDL、VLDL コレステロール粒子形成のプロファイルを変更することで薬の効果の変化を示した血清試料のスクリーニング、線形の形成に及ぼす影響特に LDL および HDL の粒子の形。これらの薬剤は、高脂血症と年齢をマッチさせた正常血清 LDL および HDL のコレステロール粒子形成形線形減少を誘発しました。シンバスタチン、エゼチミブ、ロバスタチン、およびナイアシンの線形形粒子の形成を減らすことで薬の効果が高かった。球状と線形鎖形態通常と高脂血症の血清コレステロール粒子の同定を示唆と同様の形態を有する粒子が生体内での条件のフォームがあります。以前の研究は、ディスクと針のようなコレステロール結晶を来す-/-マウス モデル24,25,26 とアポ-/- 、人間の動脈硬化性プラークの存在を識別しました。、27,28。
血で循環する HDL 粒子存在異種混合物および機能活動と共に小規模および大規模サイズ HDL 粒子のレベルが逆のコレステロールの輸送を介して自分の心臓保護効果を発揮する重要な要因として経路29,30。最近の研究は識別する HDL コレステロール粒子亜分画31 コレステロール排出、抗炎症、抗血栓、抗酸化などの複数の生物学的機能における役割を解明するための重要性を強調しています。.さらに、多くの研究は、昇順にプラズマ1,5,21の HDL のレベルを中程度に低脂質低下療法の効果を報告しています。したがって、本研究の結果は、コレステロール粒子の形態学的特徴に新たな洞察を提供します。特に、高脂血症被験者の血清試料中の線形形 HDL コレステロール粒子のより高いレベルの検出は診断と脂質修飾の影響評価のための信頼性の高いバイオ マーカーこと示唆している患者における薬。しかし、さらに調査が必要なコレステロール粒子の形態と CVD への関連付けを理解する大きな臨床サンプルを用いたします。
プラークアッセイ配列コレステロール粒子のアセンブリに薬の効果を調べるため、我々 使用蛍光ためコレステロール集計と 5 µgof の医薬品をラベルのの 2 μ g: (1) 薬は競争力のある両方の蛍光コレステロールをラベルにバインドと内因性脂質血清サンプル中に存在(大きいサイズと 2 〜 60 μ2に至る形状にまとめられる 5,000、10,000 コレステロール粒子を取得しました 2)、各サンプルから(麻薬 (5 μ g に投与量 300 ng) と高用量コレステロール粒子形成のプロファイルに検出可能な変化は見られなかったと孵化させるそれらの 1 ~ 5%, 血清サンプル中の薬剤応答のワイド バリエーションを観察 3)(4) コレステロール集計と脂質低下薬の相互作用は、非酵素的反応により媒介されます。それ故に、アッセイに使用する試薬の濃度は生理的レベルよりも高い可能性があります。
結論としては、体外イメージング法のコレステロールの形態と組成を調節することで幅広い脂質低下薬の効果を決定するため、この研究で説明した利点を正常に示しました。粒子。可視化と画像解析アルゴリズムの星座を用いた脂質粒子の形態の定量化の方法は、アテローム性動脈硬化と脂質低下療法の成果を評価する両方の診断を助けるかもしれない。

多数の臨床試験は、高密度リポタンパク質 (HDL) コレステロールの増加の中程度のレベルに低密度リポタンパク質 (LDL) コレステロールおよび低の血漿中濃度を減らすことで脂質低下薬の有益な効果を示しているがアテローム性動脈硬化関連心血管イベント1,2,3,4、5のプライマリとセカンダリの両方の発生を防ぎます。Hmg-coa 還元酵素阻害剤のスタチン系薬剤は、内因性コレステロール血6,7で LDL コレステロールのレベルを循環下にリードを回すで肝臓で合成をブロックします。同様に、ナイアシンの効果を低くしている脂質はトリグリセリド合成8に関与する肝酵素アシル 2 ジアシルグリセ ロール肝細胞の直接的および非競合的阻害によって媒介されます。比較的、エゼチミブは9小腸の上皮細胞にあるニーマン ・ ピック C1-Like 1 (NPC1L1) 蛋白質による外因性コレステロールの吸収を制限することによって血漿 LDL のレベルを低減します。フェノフィブラート、別の脂質低下薬トリグリセリドの血中濃度を大幅に低減、また適度ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体経路10LDL コレステロールを減少させます。以外にも、オメガ 3 脂肪酸は、LDL11の血漿中濃度を下げることにより抗動脈硬化の効果があると報告されます。
LDL コレステロールを下げることで、主な効果に加え、脂質低下薬がある HDL レベルを向上、血管内皮機能を改善、炎症を減らす血小板を抑制など多面的効果の数集計12,13,14。ただし、HDL コレステロール粒子の増加とその構造的特徴を変更のこれらの薬剤の基になるメカニズムは完全には理解されていません。以来、これらの薬が心血管疾患のアテローム性動脈硬化関連 (スッテパー) の治療に広く処方されて、さらに形態学的特徴および脂質粒子の分布の決定の役割を調べることが不可欠です。約 600 の脂質および分子 22 種類、様々 なサイズ、形状、密度、および組成15,16,17 に存在するコレステロールの成っているひと血漿 lipidome.超遠心分離、NMR、勾配ゲル電気泳動法などの分析手法は、LDL と HDL の粒子との亜分画18,19を特徴付けるに使用されます。ただし、これらのメソッドのアプリケーションは形態および脂質粒子のアセンブリを調節することで薬の効果を決定するを目的とした研究に限定されます。流れの cytometer ベース プラーク配列は機能生化学アッセイ開発の検出、血清の可視化派生脂質およびアミロイドのプラク粒子20。体外イメージング研究ではこの説明法の利点は、バッファーと血清試料中のコレステロール粒子の形態と分布を変えることで薬剤の効果を脂質変調の識別を有効にします。

<table><tbody><tr><td>TopFluor蛍光コレステロール</td><td>Avanti極性脂質</td><td></td><td>ストア100&micro;-20°Cのlアリコート。C</td></tr><tr><td>シンバスタチン(プロドラッグ)</td><td>ケイマンケミカルズ</td><td></td><td>ストア100&マイクロ;-20°Cのlアリコート。C</td></tr><tr><td>ロバスタチン(プロドラッグ)</td><td>ケイマンケミカルズ</td><td></td><td>ストア100&micro;-20°Cのlアリコート。C</td></tr><tr><td>ロスバスタチン</td><td>ケイマンケミカル</td><td></td><td>ズストア100&micro;-20°Cのlアリコート。C</td></tr><tr><td>アトルバスタチン</td><td>ケイマンケミカル</td><td></td><td>ズストア100&micro;-20°Cのlアリコート。C</td></tr><tr><td>フルバスタチン</td><td>ケイマンケミカル</td><td></td><td>ズストア100&micro;-20°Cのlアリコート。C</td></tr><tr><td>エゼチミブ(プロドラッグ)</td><td>ケイマンケミカルズ</td><td></td><td>ストア100&マイクロ;-20°Cのlアリコート。C</td></tr><tr><td>ナイアシン</td><td>ミリポアシグマ</td><td></td><td>ストア 100 & マイクロ;-20°Cのlアリコート。C</td></tr><tr><td>フィブラート</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>ストア100&マイクロ;-20°Cのlアリコート。C</td></tr><tr><td>オメガ3脂肪酸</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>ストア100&micro;-20°Cのlアリコート。C</td></tr><tr><td>精製 VLDL タンパク質/粒子</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精製 LDL タンパク質/粒子</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精製 HDL タンパク質/粒子</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト 年齢一致血清</td><td>Dx Biosamples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒトアテローム性動脈硬化症 血清</td><td>Bioserve</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト正常血清</td><td>スタンフォード血液中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LDL測定試薬パック</td><td>ロシュ・ディアンゴスティクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDL測定試薬パック</td><td>ロシュ・ディアンゴスティクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>総コレステロール測定</td><td>ロシュ・ディアンゴスティクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルマイクロタイタープレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリグリセリド測定</td><td>ロシュ・ディアンゴスティクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amnis Imaging Flow cytometer</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEAS 画像解析ソフトウェア</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902</td><td>Awarness Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemistry Analyzer-2, Intergra 400</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

コレステロール粒子の形態を調節することで脂質低下薬の効果

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

脂質低下薬高脂血症患者の治療は、低密度リポタンパク質 (LDL) レベルとプラズマの高密度リポタンパク質 (HDL) コレステロールの増加の中程度のレベルに低の大幅な削減につながります。ただし、コレステロール粒子の形態と分布を変えることでこれらの薬の役割はよくわかっていません。ここでは、cytometry 流れのイメージングとの組み合わせでプラークの配列法を用いたコレステロール粒子の形態学的特徴を調節することで脂質低下薬の効果の in vitro評価について述べる.ロスバスタチン、フルバスタチン、fibrates ナイアシンを誘導するのに対し、ロバスタチン、シンバスタチンとエゼチミブ、アトルバスタチンは、球状と線形鎖状粒子の形成を誘導すること示されたコレステロール粒子画像解析、唯一球形状粒子の形成。次、非常に精製された低密度リポタンパク質 (VLDL) とこれらの薬剤を添加して LDL 粒子は粒子集団のコレステロールの形態とイメージのテクスチャの変化を示した。さらに、50 の血清試料のスクリーニングは、高脂血症 (18.3% 平均) 年齢をマッチさせた正常 (平均 11.1% の) サンプルと比較して患者の線形形 HDL コレステロール粒子のより高いレベルの存在を明らかにしました。また血清中の LDL および HDL のコレステロール粒子形成形の線形を減らすことに脂質低下薬の効果にばらつきが観測されました。これらの調査結果を示す細胞による脂質代謝改善効果、脂質低下薬が非酵素作用機序によってコレステロール粒子の形態を変調直接。これらの結果の成果には、動脈硬化の診断に通知し最適な脂質低下療法を予測する可能性があります。

本研究の目的は、コレステロール粒子の形態を調節することで脂質を低下させる生体外で薬剤効果を評価することでした。脂質低下薬の比較では、コレステロール粒子の形態学的特徴を調節することでその効果の変化を明らかにしました。

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

この研究の全体的な目標は、プラークアレイ法を使用してコレステロール粒子の形態学的特徴を調節する脂質低下薬の効果を評価し、アテローム性動脈硬化症の診断と薬物効果の決定のための潜在的なバイオマーカーを特定することです。コレステロール粒子形成の調節における脂質低下薬の役割は、ほとんど理解されていません。ここでは、脂質低下薬がコレステロール粒子形成のプロファイルと形態学的特徴を変えるのに直接的な役割を果たしていることを示しています。in vitroイメージング法に基づくプラークアレイ法が他の粒子検出法よりも優れている点は、血清中の脂質低下薬の効果を評価するためのコレステロール粒子の可視化が可能になることです。Plaxgenのラボ技術者であるJason Lundryが、化学分析装置を使用してプラークアレイアッセイをどのようにセットアップしたかを実演します。Millipore SigmaのシニアサイエンティストであるRaymond Kongが、イメージングフローサイトメトリーを使用してサンプル処理を行う方法を示します。最後に、Plaxgenの検査技師であるDavid Liu氏が、コレステロール粒子画像のデータ分析を実演します。化学分析装置-1を使用して、コレステロール粒子形成のためのプラークアレイアッセイをセットアップします。アッセイ全体を通して、各ウェルの最終反応量を200マイクロリットルに維持し、すべてのアッセイを3回に分けて実施します。まず、丸底の低タンパク質結合性96ウェルプレートの各ウェルに、194ポイント5マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水、またはPDSをロードします。各ウェルに、各脂質低下薬液の2点5マイクロリットルを加え、ネガティブコントロールサンプルに薬物は添加しない。その後、プレートを化学分析装置-1反応プレートに載せて30秒間振とうし、薬剤を溶液に均一に混合します。最後に、蛍光標識されたコレステロール凝集液2マイクロリットルを各ウェルに加えます。前回と同様に、プレートを化学分析装置-1反応プレートに載せて30秒間振とうします。次に、プレートをラボ用シェーカーで37°C、200rpmに設定した2時間インキュベートします。インキュベーション後、イメージングフローサイトメトリーにより粒子の画像を取得します。データ集録テンプレートを開き、正しい計測器設定をロードします。「ファイル」をクリックし、「テンプレートのロード」を選択して、テンプレート・ファイルを選択します。「Load」をクリックして、サンプルをロードするための装置を準備します。Load Sampleダイアログボックスが開いたら、[OK]をクリックして50マイクロリットルのサンプルをイメージングフローサイトメーターにロードします。粒子がイメージングエリアにリアルタイムで見えるようになるまで待ちます。イメージング領域内の粒子にピントが合ったら、[取得]をクリックして、暗視野、明視野、緑色蛍光、および黄色蛍光の各オブジェクトの画像をハイスループットで同時に取得します。取得の最後に、Returnボタンをクリックしてサンプルを返却します。これらの手順を繰り返して、各サンプルから5, 000〜10, 000個の粒子を取得します。画像解析ソフトウェアを使用してすべての生画像ファイルを解析し、テキストプロトコルに記載されているように、物体の蛍光強度と形態学的変化を決定します。丸底の低タンパク質結合性96ウェルプレートを、ウェルあたり200マイクロリットルの最終反応量を使用して、試薬を段階的にロードして調製します。まず、コントロールウェルを準備します。各ウェルに193マイクロリットルのPBSをロードします。患者血清の2.5%を添加し、ウェルごとに1つの血清サンプルのみをロードします。その後、プレートを化学分析装置の反応プレートに載せて30秒間振とうします。次に、2マイクロリットルの蛍光標識コレステロール凝集体溶液を各ウェルに加えます。再度、プレートを化学分析装置-1反応プレートに置いて30秒間振とうします。薬で井戸を準備するには、各井戸に191マイクロリットルのPBSをロードします。次に、ウェルごとに各患者血清の2.5%を添加し、プレートを化学分析装置-1反応プレートに置いて30秒間振とうします。エゼチミブ、ロバスタチン、シンバスタチン、またはナイアシン溶液の2マイクロリットルを、ネガティブコントロールウェルを除くすべてのウェルに追加します。ウェルごとに1つの薬剤のみを追加します。先ほどと同じようにプレートを30秒間振るに進みます。次に、プレートを30秒間振とうする前に、2マイクロリットルの蛍光標識コレステロール凝集体溶液を各ウェルに加えます。次に、プレートを37°C、200rpmに設定したラボ用シェーカーで2時間インキュベートします。インキュベーション後、前回と同じ設定に従ってフローサイトメトリーをイメージングしてサンプルを取得します。画像分析ソフトウェアを使用して、テキストプロトコルで説明されているように、すべての画像ファイルをバッチ処理します。ここに示されているのは、スタチンによって誘導される球状および線状の鎖状のコレステロール粒子を非酵素メカニズムで同定する代表的な結果です。他の脂質低下薬によって誘発されるコレステロール粒子形成の2つの異なる形態の確認が示されています。エゼチミブ、ナイアシン、フィブラート、オメガ3脂肪酸を含みます。ここに示されているのはドットプロットで、X軸は緑色の蛍光チャネルで検出されたコレステロール粒子のスペクトルを示しています。また、Y軸は側方散乱光を表示し、ゲーティングは蛍光ドットプロットで検出された非常に低密度のリポタンパク質、低密度リポタンパク質、および高密度のリポタンパク質粒子の領域を示しています。これらの結果は、エゼミド、ロバスタチン、シンバスタチン、ナイアシンなどの薬剤がない場合に、脂質低下効果が精製されたVLDLおよびLDLコレステロール粒子のプロファイルをどのように変化させるかを示しています。ここに示されているのは、VLDL、LDL、およびHDLコレステロール粒子形成のプロファイルを調節する、さまざまな脂質低下薬の異なる効果を特定するための3つの異なる血清サンプルのスクリーニングです。これらのプロファイルは、3つの異なる血清サンプル間で応答レベルにもばらつきがあることを示しています。血清サンプル1のスクリーニングにより、薬物を使用せずに、およびさまざまな脂質低下薬の存在下で形成された球状および線状のコレステロール粒子について、血清由来コレステロール粒子の2つの異なる形態が確認され、球状および線形鎖形状を示します。そこで、コレステロール粒子形成とその臨床的意義との関係を調節する脂質低下薬の効果を特定するためのinvitroイメージングアプローチを成功裏に実証しました。私たちの予備的な結果は有望であり、大規模な臨床サンプルを使用してこのプラークアレイアッセイをさらに検証する過程にあります。標準的な脂質パネルは、血清中のLDLコレステロールとHDLコレステロール値を測定します。私たちのプラークアレイアッセイは、アテローム性動脈硬化症のリスクの精度を向上させることを目指しており、血清を使用して脂質低下薬物反応を予測します。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

コレステロールアッセイは、培養細胞からのコレステロール流出率と細胞から放出されるコレステロールを受け入れるようにプラズマ受容体の能力を定量化するために設計されています。アッセイは、細胞内プールと細胞外受容体へのコレステロールのリリース間でのコレステロールコレステロール、平衡で細胞を標識で構成されています。...

コレステロール流出アッセイ

以上のタンパク質の半分以上は、電子顕微鏡像および三次元再構成の両方に挑戦している小タンパク質（分子量&lt;200 kDa）のである。最適化されたネガティブ染色は、高いコントラストと異なる生理学的条件下で小さな非対称のタンパク質または複合体の比較的高い解像度（〜1 nm）の画像を得るため、堅牢かつ高スループットのプロトコルである。...

最適化された負の染色：電子顕微鏡による小型·非対称蛋白質構造を調べるためのハイスループットプロトコル

このプロトコルは、ライブセル イメージング細胞型システムを使用したリアルタイム流入速度と LDL コレステロールの取り込みを測定する効率的な方法を提供します。この手法は、細胞の形態およびそれ故に潜在的な細胞毒性を監視しながら LDL...

LDL コレステロールの取り込みアッセイ セルにライブセル イメージングを使用して正常性の監視

ここでは、定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応ベースのプロトコルが、リポタンパク質粒子の天然マイクロ RNA 含量 (絶対/相対) の決定のために提示される。加えて、マイクロ RNA...

マイクロ Rna による天然リポタンパク質粒子の濃縮とその絶対/相対マイクロ Rna 含量とその細胞移動速度の決定

コレステロールを飽和させて哺乳動物の組織や細胞を豊かにするシクロデキストリンの適用と、ゼノプス卵母細胞を豊かにするコレステロールを豊富なリン脂質系分散液(リポソーム)の使用の2つの方法が提示される。これらの方法は、分子、細胞、および器官機能におけるコレステロール値の上昇の影響を決定するのに役立ちます。...

哺乳類組織の富化とコレステロールを伴うゼノプス卵母細胞

血漿リポタンパク質の分析にはいくつかの方法が使用されています。しかし、超遠心は依然として最も人気があり、信頼性の高い方法の1つです。ここでは、逐次密度超遠心を用いて血漿からリポタンパク質を分離する方法と、診断と研究の両方の目的でアポリポタンパク質を分析する方法について説明する。...

超遠心分離による血漿リポタンパク質の単離と分析

本明細書では、ヒト血漿または血清全体に存在する高密度リポタンパク質(HDL)によって脂質ドナー粒子から特異的に除去された蛍光リン脂質の量を測定するためのプロトコルについて説明します。HDL...

高密度リポタンパク質特異的リン脂質流出アッセイ

神経膠芽腫（GBM）の現在のex vivoモデルは、ヒト腫瘍浸潤の生理学的に関連する研究のために最適化されていない。ここでは、我々は、新鮮なヒトGBM組織からの器官型スライス培養物の生成および維持のためのプロトコールを提示する。経時顕微鏡法および定量的細胞移動分析技術の説明が提供される。...

腫瘍細胞移動の研究および抗浸潤性薬物の患者特異的効果の研究のためのヒト神経膠芽腫の器官型スライス培養モデル

このプロトコルの目的は、腫瘍および非腫瘍細胞の両方を含む混合培養物を用いてインビトロで抗がん剤の特異性を評価することです。...

抗がん剤の特異性を評価します<em&gt;インビトロ</em

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眼薬の薬物動態試験でウサギの眼の使用

学ぶ脂質低下薬がコレステロール粒子の形態を調節するメカニズムをプラークアレイ法で可視化する方法。イメージングフローサイトメトリーによりVLDL・LDL粒子のプロファイル変化を解析し、動脈硬化症診断のバイオマーカー同定に応用できます。

コレステロール粒子の形態を調節することで脂質低下薬の効果

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