Name: 最適化された負の染色：電子顕微鏡による小型·非対称蛋白質構造を調べるためのハイスループットプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学ぶ 最適化された負の染色法を用いて、電子顕微鏡で小型・非対称タンパク質の高解像度構造を可視化するハイスループットプロトコルです。迅速な洗浄と染色ステップにより、抗体やリポタンパク質など多様なタンパク質の高コントラスト画像が得られます。

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私たちは、編集やコメント、および博士博士ミッキーヤンに感謝します。支援のためのレイ張ボー鵬。この作品は、科学局、米国エネルギー省のエネルギー基本科学庁（番号DE-AC02-05CH11231契約）、国立心臓、肺、および国立衛生研究所の血液研究所（によってサポートされていましたなし。R01HL115153）、および国立衛生研究所一般医科学研究所（無。R01GM104427）。

1％新鮮なネガティブ染色溶液の調製（w / v）の<ol><li>暗い部屋、またはボックスに100ミリリットルの脱イオン水を入れたガラス瓶に1mgのウラニルギ（UF）粉末を入れてください。 </li><li>暗い部屋/ボックス中、室温で溶液でO / N撹拌する。解決策を打つからの光を防ぐために、アルミホイルで液ボトルを包みます。 </li><li> 0.2μmのを通して穏やかに溶液を濾過（孔径）フィルターを5 mlシリンジに取り付けられた。濾過した溶液は、いくつかのアルミ箔カバーさファルコンチューブに回収した。フィルターシリンジは、光の露出を防ぐためにアルミホイルでラップしなければなりません。 </li><li> 0.02ミクロン（孔径）のフィルターを通して再び溶液を濾過1mlシリンジに取り付けられた。濾過した溶液を2ミリリットルバイアルに採取し、アリコートした。シリンジおよびバイアルを、使用前にアルミニウム箔で覆われている。 </li><li>直ちに液体窒素を充填した容器の中にバイアルを沈める長い取っ手の鉗子を用いて一定分量バイアルを凍結後に溶液を濾過した。 </li><li>ストレージおよび将来の使用のために-80℃の冷凍庫に凍結したバイアルを転送します。 </li></ol>ネガティブ染色Workstationおよびインキュベーションステーションの調製<ol><li> RTに設定した水浴中で1％UF溶液のバイアルを解凍する。アルミ箔は、光への暴露を防止するために、バイアルの周囲に巻き付けたままであることを確認してください。 </li><li>それは完全にアルミ箔を使用して解凍だ後に溶液を濾過0.02μmのフィルターを装着した1ml注射器を包んだ。バイアルをラップされた新しいアルミホイルに濾過された溶液を収集し、利用を待っているキャップに覆わアイスボックス内の氷の上に置いた。 </li><li>空の蛋白質結晶化プレートの表面上に〜8インチの長いパラフィルムシートを押して指で解プレートを作成します。それは〜直径5mmの円形プレートの行を生成します。各行に6版を作る含まれている氷の内側平坦化された氷の表面にパラフィルムプレートを配置小胞体蓋、染色ワークステーションなど。 </li><li>各行の右側の3枚のプレート上でのUFソリューションフィルタリング各行の左3枚のそれぞれ、ピペット〜35μlの上にピペット〜35μlの脱イオン水。タンパク質を染色する前に、光への曝露を防止するための蓋付きの染色ワークステーションをカバー。 </li><li>氷空のボックスを半充填することによってEMグリッド培養ステーションを用意し、次支持ベース上に搭載することができ、ハンガーに付着した。ピンセット」のヒントは近くの氷表面である、ハンガーのサンプルピンセットを配置します。半分はボックスリップ高さでピンセット」のヒントをカバーしています。培養ステーションを作るために理想的なアイスボックスは空のピペットチップコンテナを使用しています。 </li></ol> 3のOPN操作<ol><li> 10秒間、300メッシュの銅EMグリッドをコーティングされた薄い炭素膜をグロー放電。 </li><li>ピンセットでグリッドをピックアップし、氷の上に45°のチルト、1インチでグリッドを保​​つことによってハンガーにピンセットをフック培養ステーション内面。 </li><li> 〜0.01〜0.005 mg / mlでの最終タンパク質濃度でダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DBPS）とのタンパク質試料を希釈する。預金〜4μlを直ちにEMグリッドの炭素側の希釈後の試料を希釈した。 （タンパク質がDPBSに敏感である場合DPBSは別のバッファに変更することができる） </li><li>培養ステーション内部に約1分間のEMグリッド上のサンプルをインキュベートする。 </li><li>迅速濾紙でグリッドのエッジに触れるを通して余分な溶液を除去します。 </li><li>過剰な溶液は、EMグリッド上で除去した直後にパラフィルムシートの上に、純水表面の最初の一滴（〜35μl）をに迅速にグリッドをタッチします。そして、濾紙で速やかに過剰の水を除去する。 </li><li>パラフィルムの残り2水滴が上のEMグリッドを洗浄することによってさらに2回繰り返し、ステップ3.6（試料は水に非常に敏感である場合は、手順3.6と3.7をスキップすることができます）。 </li><li> EM GRIフロートEMグリッド上の余分な水分を除去した直後に、UF液の最初の一滴の表面には、直ちにdは。そして、10秒間インキュベートする。 UF液面にグリッドを浮遊する前に、3秒以内に水洗手続きを完了してください。洗浄時間が短いほど、より良い品質は次のようになります。 </li><li> 3回 - 〜2用ろ紙にヒントを貫通してピンセットを清掃してください。 </li><li>濾紙でグリッドのエッジを接触させることを通じて、グリッド上の過剰な溶液を除去した後、UFの番目のドロップにグリッドを浮く。 </li><li>第2の液滴の段差3.10の上に進みます。 </li><li> UF液の第三の液滴にグリッドをフロートし、約1分間の染色ステーションをカバーしています。 </li><li>オプションの手順：3.6で説明したように水の上に速やかにグリッドを洗う。この追加のステップは、ロードされた自由な金粒子や汚れの背景の上に含むサンプルの利益になる。 </li><li>目にろ紙をタッチすることにより、過剰の溶液を除去（カーボン側の反対側）の電子グリッド全体の裏側。右濾紙に吸収液を観察した後、室温で窒素ガスの穏やかな流れの下でグリッドを乾燥させる。 </li><li>ペトリ皿の内側のろ紙のシート上にグリッドを配置し、室温で少なくとも30分間乾燥キャップを部分的に料理をカバーしています。いくつかのサンプルについては、時間ベーク40℃のインキュベーターでグリッドを配置します。 </li><li>調べる将来のEMのためのEMグリッドボックスにグリッドを保​​管してください。 </li></ol>調査4。EM <ol><li>グリッド上の小さなタンパク質のEM検査の前に、適切に、TEMを合わせます。 <ol><li> TEMが適切に位置合わせされたかどうかを決定するアモルファスカーボン膜のパワースペクトルで最も高い可視トーンリングの解像度を確認する。 TEMは、多くの異なるユーザーによって共有されるため、TEMは、多くの場合、正しく配置されていません。 </li><li>慎重にアライメントconditioを調整するために、試料の炭素膜領域上のパワースペクトルを確認マシンのnの。最上位の可視トーンリングは、ターゲットと解像度よりも優れています。 注：120 kVの高張力下で動作のLaB 6フィラメントTEMの適切な位置合わせの一例として、20以上のトーンリングは、可視化することができる、対応する解像度が5.0オングストロームよりも良好であることができる。このトーンリングは〜1.6μmでかつ20.4電子/ A2（ 図5）の用量のデフォーカス下で撮像されたアモルファスカーボン膜のフーリエ変換により達成した。 注：高解像度トーンリングの観察が必要な状態ではなく、適切な位置合わせのために十分な条件である。実際に高解像度の画像を達成するために、多くの他のパラメータは、サンプルの品質、放射線損傷、充電及びドリフトならびに照射線量率としても重要である。 </li></ol></li><li>理想的に染色された領域に小さなタンパク質を画像化するために近いシェルツァーフォーカスに戻ってフォーカスを持参してください。 </li><li>虚部を「曇天」エリアを検索メール。理想的に染色された領域は、通常、汚れの厚さは、通常、均等に炭素被覆グリッド（ 図6）上に分布していないので、グリッド上の「曇天」エリアのように見える厚い染みエリアの端の近くに位置しています。一般的に低倍率（&lt;100×）は、第1の撮像のために、ズームインする前に、これらの曇った分野を見つけるのを助けることだった。 </li></ol>

開示するものは何もありません。

従来のNS技術と比較して、のOPNは、小さなタンパク質の信頼性および妥当な高分解能（〜1nmの）構造的な詳細（ 図2）を提供する、連銭アーチファクト（ 図1,9）を防止することができる。クライオEMと比較して、のOPNは、高スループットの方法を提供し、タンパク質およびタンパク質-タンパク質相互6の多種多様を調べることができる。しかし、のOPNはまだ欠点があります。従来のNSと比較して、のOPNは伴う：試料調製におけるⅰ）より複雑な工程; ⅱ）放射性物質、UFを使用した。 ⅲ）により、その光感度のUF染色の短い効力に新鮮な汚れを保つ。 iv）の沈殿がUF溶液は-80℃で保存し、使用前に解凍を必要としなければならない防止するため; v）は、最終的にすべてのUFが有害廃棄物として処理する必要があります。低温電子顕微鏡と比較して、のOPNは、どのまだ発見しないアーティファクトのために比較的低解像度画像のない保証を提供します将来的には。 リポ蛋白連銭形成に対するNS操作手続きの効果 29滴ずつ16、55を混合し、洗浄手順：試験16,29-36,55ためのタンパク質を調製するためのNSプロトコルは、方法50の三つの主要なグループに分類することができる。 i）の混合プロトコルは、特定の比率で染色し、タンパク質試料の予備混合を必要とし、そして最後にEM試験55用の空気乾燥の前にろ紙で過剰な溶液を除去し、グリッド上にコーティングされた炭素膜上に混合溶液を塗布する。 ⅱ）滴ずつプロトコルは、その後、汚れの降下（約4μl）を塗布する前に、過剰な試料溶液を除去し、約1分間の炭素せる座り込みでコーティングEMグリッドに直接（〜4μl）のサンプル降下を適用することを含むグリッドの同じ側のソリューションを提供します。インキュベーションの約1分後、excesを削除清潔なろ紙との接触を通じての染色は、最終的に空気乾燥16,56-58のために提出する。 iii）の洗浄プロトコル（ 図7）、右ろ紙3,29,30によって過剰な溶液を毎回除去した後、脱イオン水で3回洗浄し、1分間炭素でコーティングEMグリッドに試料溶液の適用を必要とする。のOPNプロトコルは、この洗浄手順から変更されました。 NS汚れの種類およびリポタンパク質連銭形成に対する影響 NSでは、重金属による汚れに強い電子散乱は、タンパク質17-20,59からコントラストを提供する。 NSサンプルは、さらに大きな放射線量を受けて、シャープな陰性造影8,9,60によるタンパク質の機能を高めることができる。重金属の汚れのように分類することができるリンタングステン酸（PTA）16を含む、アニオン、メチルアミン、タングステン14およびシリコンタングステン酸61;カチオンそのような酢酸ウラニル（UA）62、UF 3,29,30、および硝酸ウラニル（UN）63などのIC、。最も一般的に使用されるアニオン性NS汚れの一つは、PTA 33,64-67ある。 7.5 - PTAは、通常、pHは7.0で使用されているヘテロポリ酸である。 PTAも陽性染色3,16,68に使用することができます。 PTAの負の電荷は正にリポタンパク質とリポソーム両面に、POPCのような頭部基を、荷電飽和脂質との静電相互作用を媒介することができる。 PTAにも定期的なバッファ塩分29,30（ 図1）の下で、この相互作用29,30を通じて連銭形成を引き起こすことがあります。そのようなUA、UF、国連などのウラニルの汚れは、特に頻繁に生物試料62,69,70のさまざまなNSのために使用されるカチオン性重金属の汚れや、UAのための代替選択肢です。実験は、UFは、POPCなどの不飽和脂肪酸の脂質を含み、リポタンパク質のない連銭の原因が見つかりません。しかし、UFはまだRoule駅を誘導することができるそのようなジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）及び1 - ヘキサデカノイル-2 - オクタデカノイルのsn-グリセロ-3 - ホスホコリン（PSPC）などの飽和脂肪酸、脂質を含有するリポタンパク質上の補助の形成。この相互作用の詳細なメカニズムは不明である。 UA / UF /国連はすべて3.5から4.6までの範囲より低いpH値で動作することができます。このような低いpH値は、pH 14,71に敏感な特定の生体高分子には適していない場合があります。興味深いことに、UA / UFは、未知のメカニズム72を介して、数ミリ秒以内にタンパク質の構造を修正することができます。 PTAとは異なり、UA / UFは酸よりも塩により類似している。 UFは伝えている、UA 73よりも良好な結果を提供することができ、UFと国連汚れ（UFを0.3 nmの国連：〜0.5 nm）のUAよりも小さい粒子径を有するもの3,74。 UFは、以下によりネガティブ染色試薬として使用したとき興味深い例えば、小さなタンパク質（53 kDaのCETP）の二次構造のような詳細が直接生の顕微鏡写真から視覚化することができる以前のクライオ陽性染色（クライオ-PS）法（ 図8）6 を報告した。クライオ-PSでは、染色された試料は、二次構造の崩壊を引き起こす可能性のOPNプロトコルにクライオEMサンプル調製手順の代わりに、乾燥手順に従うことで瞬間凍結であった。クライオ-PSは、小さなタンパク質75の高コントラスト、高分解能イメージングのための方法である。クライオPS画像が報告されたクライオNSプロトコル22からのものと比較して、コントラストを逆転したが、従来の低温電子顕微鏡像からのものと一致した画像コントラストを持っているので、このようにしてそれが低温のPS法と命名された。クライオのPSイメージは染色試薬は、ウラニル、ギは、染色が唯一の外表面構造を可視化することができるという従来の見解に挑戦し、分子表面に浸透することを示している。ウラニルギ分子表面を貫通する方法のメカニズムは不明である。一つの可能​​性はウラニルカチオンが利用可能なタンパク質のカルボキシル基と結合するため、ということであるガラス質氷を囲む、それによってポジティブ染色として作用するタンパク質とウラニルのグループの染色よりも低密度である。クライオ-PS方式は、X線結晶学76-78の位相問題を解決するための一般的なアプローチであった複数の同形置換（MIR）の方法に類似している。 MIRは、結晶試料は、その天然型と同型のフォームを取得するには、ウランを含む重原子溶液で浸漬さ。重原子の添加は、時には結晶形成または単位セル寸法に影響を与えるが、結晶構造決定76-78の追加情報を提供しない。 UFの小粒の恩恵を受けことによって、クライオ-PSは、特にほぼすべてのタンパク質が溶液中で自然に動的かつ不均一であることを考慮すると、タンパク質の構造研究のために重要である単一のタンパク質の高コントラスト及び高解像度画像を提供することができる。このクライオ-PS法の妥当性確認のために、私たちは、EMフィールドからのブラインドテスト用にオープン。 </P&gt; リポ蛋白中の連銭形成に対する塩濃度の影響 従来のPTAネガティブ染色試薬を用いて、観察された連銭形成が可能性が高い代わりに、タンパク質相互作用の脂質の相互作用に関係している。かなりの塩分濃度（0.5 M NaCl）中で調製POPCリポソーム小胞、適度な塩分濃度（0.25 M NaCl）で、比較的弱い塩分濃度（0.1MのNaCl）、および純水（ 図9）のサンプルを撮像する、電子顕微鏡写真は、連銭形成があっ表示塩濃度（ - D図9A）に相関する。 UFとしてネガティブ染色試薬を使用して、何連銭を素早く右に染色する前に、塩濃度を減少させるために洗浄操作を示唆しPOPC関連で連銭を防止するために必要ではなく、独立して、十分なステップであり、POPCリポソーム小胞のサンプル30（ 図2L）は観察されなかったサンプル。 TEMイメージング小さなタンパク質は、近シェルツァーフォーカス条件を必要とします。 高解像度で小さなタンパク質の成功のTEM画像化は、2つの重要な条件が、適切なビームアラインメントと近シェルツァーフォーカス取得条件を必要とします。 ⅰ）適切なビーム位置合わせが比較的高いフォーカスの下で取得したカーボンフィルム画像のフーリエ変換上で可視トーンリング（パワースペクトル）の数を通じて判断することができる。ビームの整列条件より良い、より多くのトーンリングは、視覚化し、測定可能なことができます.. ii）のニアシェルツァーフォーカスの下に画像を取得するもう一つの重要な条件である。生体サンプル像のコントラストを高めることができる79 - （2μmであり、さらに、1）生物学的標本を撮像するための従来の標準的な戦略は、典型的には、高いデフォーカスを利用する。この戦略は、多くの場合、硬質材料の原子分解能構造を画像化するための典型的な戦略とは異なる重要である近くシェルツァーフォーカス（〜50nmのデフォーカス）を利用する。 、より高いデフォーカス生体試料のコントラストを強化することができるが、高解像度の信号が部分的に除去される。その結果、高解像度の信号の共謀は、より高いデフォーカス撮像条件でより低いであろう。その理由は、TEM画像はサンプル構造および機器CTFの畳み込みである、ということである。 CTFは、曲線が頻繁に高い周波数でゼロ振幅を横切る振動させる周波数に対する振動曲線である。 CTFがゼロを越え、この特定の周波数での試料の構造の信号が（ゼロ回、任意の数がゼロになります）解消されるたびに。この周波数で排除信号は、任意のCTF補正アルゴリズム（ゼロで除算したゼロではなく、元の構造の信号の任意のランダムな数とすることができる）によって回収することはできません。より高いデフォーカス画像化の下で、CTFは、多くはより積極的に、このようにしてCTFは、結果として、より頻繁にゼロ振幅を横切る振動する特定の周波数より多くでの構造の信号が除去される。排除される複数の信号、少ない共謀イメージがあります。注目すべきは、画像の共謀が回収またはCTF補正により補正することができない。しかし、異なるデフォーカス下で取得未完了の画像の数が偶数の原子分解能が9-12を達成できる平均化法を介してサンプル構造の完成した構造的シグナルを得相互にそのギャップを埋めるために使用することができる。 平均化法は、いくつかの対称性の高いタンパク質や構造的に関連した剛性のタンパク質の構造を達成するための強力なアプローチである。しかし、それはまだこのような抗体およびHDLのように、特に構造力学と柔軟なタンパク質について、小さな非対称タンパク質の構造研究では依然として厳しい。平均化は、タンパク質粒子の構造およびコンフォメーションが、ジで同一であるという仮定に基づいているfferent向きで、しかし多くのタンパク質は、溶液中で熱力学的変動を受けることが知られている。以前にタンパク質の熱力学的変動の変動を知らなくても平均化法を適用することにより、平均化された構造は、多くの場合、ドメイン10,80または低温電子顕微鏡再構成における解像度81の局所的な変化を引き起こす可能性が欠落している。 単一のタンパク質の小さなタンパク質の3D再構成を達成する成功のような53 kDaのCETP、および3D構造のような160 kDaのIgG1抗体を、適切な位置合わせの条件に近いシェルツァーフォーカス撮像条件を使用することから利益を得る。画像コントラストは、近シェルツァーフォーカス画像に低いと思われるが、コントラストだけで簡単にバックグラウンドで高周波ノイズを低減するためにローパスフィルタリングを適用することによって高めることができる。私たちは信じて、近シェルツァーフォーカス画像は、最大の構造的信号を搬送し、粒子のアライメントの精度を高め、EFFIを高めることができる単一粒子の3次元再構成と個別の粒子電子線トモグラフィー再構成における効率。

タンパク質の機能を理解することは、タンパク質構造の知識を必要とする。 200kDaの - 構造の決定は、その分子量40内にあるタンパク質のための挑戦である。 X線結晶学は、タンパク質結晶化によって制限されます。低温電子顕微鏡（クライオEM）は、分子量が小さい両方のイメージ取得及び小タンパク質の三次元（3D）再構成、の困難を有している核磁気共鳴（NMR）分光法は、40キロダルトン未満の分子量に制限されている200kDaのより。現在の方法は、新しい方法が必要とされ、このサイズのタンパク質を研究に挑戦しているように、200 kDaの1,2 -注目すべきことに、50％以上のタンパク質が、40の範囲内の分子量を有する。 ほとんどの透過型電子顕微鏡（TEMは）は原子分解能、 すなわち、より優れた3オングストロームの分解能が可能であるが、生物学的サンプルからでも、近くにナノメートルの分解能構造を達成することはなく、チャレンジVolです変7。放射線損傷、低コントラスト構造の偏差ならびに脱水などのアーティファクトは全て、高分解能TEM像3,8を妨げる。 さまざまなTEMアプローチの中では、低温電子顕微鏡は、近い生理的条件下9-12の下で対称性の高い大規模な巨大分子の原子分解能構造を達成するための先進的かつ最先端の方法です。低温電子顕微鏡試料は、その後、液体窒素やヘリウム温度13として極低温で結像されるガラス質氷中に巨大分子を埋め込 ​​む、試料溶液を凍結フラッシュを調製する。サンプルがない成果物を提示しておらず、構造8-12にほぼネイティブという点で、低温電子顕微鏡が有利で ​​ある。低温電子顕微鏡は、その欠点を持っているは、i）追加のデバイスをインストールする必要または低温電子顕微鏡機能のための標準的なTEM装置をアップグレードするために購入されている。デバイスが含まれる：抗汚す人、クライオホルダー、低用量モードソフトウェアおよび低用量センシ電性CCDカメラ、これらのデバイスの価格はTEM機器自体の価格よりもはるかに低いものの; ii）の低温電子顕微鏡操作はNS動作よりも長い時間を必要とする。液体窒素温度の操作、サンプル充電、撮像ドリフト、温度勾配、低用量：クライオEMは、さらなる困難を、アドレス指定が必要であるため低温EMを調べると、試料は、多くの場合、試験片を作成し、NSよりもTEM機器を操作するために長い時間を必要とするモデル操作、サンプルの放射線感受性および投与量の制限。少数の低温電子顕微鏡画像は、確かにバランスの取れた温度勾配を用いて調製器具との低温電子顕微鏡の専門家が1時間以下で得ることができるが、これらの余分なステップは、NSデータの取得に比べて有用なデータを取得する速度が遅くなります。 ⅲ）ユーザーは、このような撮像procの中で、低温電子顕微鏡グリッド、低用量の操作、線量測定を凍結し、液体窒素を取り扱う充電を取り扱い、漂流や知識などの追加のトレーニングを必要とするディエッサー;異なるTEMセッション中に同じクライオ試料に対する反復可能なイメージングの静脈）の欠如。低温電子顕微鏡標本を簡単にTEM装置から/への検体搬入出時の氷の汚染による損傷を受ける。この損傷は、試料が14精製/単離することが困難であり、特に懸念される。 v）の小タンパク質（&lt;200 kDaの分子量）が低いためコントラストが画像化されるべき挑戦しています。 vi）の低温電子顕微鏡像のコントラストが低いと、高い雑音は、特に構造的に可撓性のあるタンパク質について、タンパク質方位、コンフォメーションおよび分類の決定に全体の精度を低下させるため、画像間の相互相関値を減少させ、自然に溶液中に変動する4,5。 ネガティブ染色（NS）は、任意の研究室では、任意のタイプのEMで、タンパク質の構造を調べるために利用することができ、比較的「古代」と歴史的な方法である。ブレンナーとホーンは、最初のコンセプトoを開発Fウイルス15を検査するための半世紀前に陰性染色。 NSは、荷電重金属塩で試料をコーティングによって達成される。この概念は、もともと光学顕微鏡と負の画像16を表示する際に、より高い画像コントラストを可能にする、検体の周りに暗闇を提供する染色液に細菌を埋め込 ​​む習慣から来る。重金属イオンは、タンパク質17-20に低密度の原子に比べて電子を分散させるためのより大きな能力を有し、かつコーティング重金属染色は、改善されたコントラストの高い投与量の制限を可能にするからである。 NS標本を容易に粒子配向の決定と低温電子顕微鏡からの画像より三次元再構成のための高コントラスト画像8を提供することができます。 伝統NSは、残念ながら、そのような一般的な集約、分子解離、平坦化および8,21,22スタッキングなどの汚れ-タンパク質相互作用によって誘導される成果物を生成することができます。脂質関連proteのためにそのようなリポタンパク質16,23-30、積み重ね、連銭（ 図1）31-36に一緒にパックされた粒子で一般的なアーティファクトの結果としてプラグ、。そのような非変性ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動のような多くのリポタンパク質の研究、低温電子顕微鏡は、すべてのショーのリポタンパク質粒子が分離された粒子の代わりに、自然に積み重ねられている質量分析39,41、および小角X線回折データ42、13,29,37-40研究一緒に連銭21,29,30,35,42-45を形成する。従来のNSによる連銭形成の観察は、おそらくアポリポタンパク質（アポ）とソリューション13,29,30,46-49標準NSプロトコルに対する感度で構造的に柔軟であるリン脂質から構成されるリポタンパク質間の動的な相互作用によって引き起こされる。このアーティファクトを識別するために、アポリポタンパク質E4（アポE4）パルミトイル - オレオイルホスファチジルコリン（POPC）、高密度リポタンパク質（HDL）のサンプルは、試験サンプルとな凍結とした一連の条件で調製したNS検体をスクリーニングアーティファクト無料で標準29のEM画像。 NSおよびクライオEMから得られた粒径及び形状を比較することにより、染色試薬および塩濃度の特定のタイプは、周知の連銭現象を引き起こすつの重要なパラメータであることが見出された。このように、最適化されたネガティブ染色（のOPN）プロトコルが報告された。 のOPNでは、アポHDLのよく知られた連銭現象はのOPN（ 図2A）によって除去した。統計分析は、低温EMからのものと比較して、大きさと形状でのOPNの収量は非常に類似した画像（5％未満の偏差）を示した、しかし、コントラストが排除された。のOPNの検証が8.4ナノメートル（ 図2C）、アポA-Iの7.8ナノメートル（ 図2B）を含むリポタンパク質試料のほぼすべてのクラスまたはサブクラス6,29,30,50,51、の連銭アーティファクトの除去を検査することによって行われた、9.6 nmのDiscoidal再構成HDL（のrHDL）（ 図2D）、9.3 nmの球形のrHDL（ 図2E）、ヒト血漿HDL（ 図2F）、脂質を含まないアポA-I（ 図2G）、血漿HDL（ 図2H）、低密度リポタンパク質（LDL ）（ 図2I）、中間密度リポタンパク質（IDL）（ 図2J）、超低密度リポタンパク質（VLDL）（ 図2K）、およびPOPCリポソーム（ 図2L）30。 6,29、および柔軟性の高い160kDaのIgG抗体（ 図4AおよびB）4,5,29 -追加の検証が53 kDaのコレステリルエステル転送タンパク質（CETP）（C図3A）を含む、小さな非対称のタンパク質を画像化することにより行った、52、および2つの構造的によく知られているタンパク質、GroELおよびプロテアソーム（ 図2MおよびN）。 Cからの追加の認証を要求するためのolleagues、私たちはこののOPN方法上の任意のブラインドテストに開放されています。 のOPNハイスループットプロトコルはまた、CETPは、リポタンパク質の4つのクラスに再結合HDL相互作用を含む直列条件下で各種タンパク質（に結合したようなCETPの小さなタンパク質のサンプル数百を調べる介してタンパク質のメカニズムを研究するために使用されているように、血漿HDL、LDLおよびVLDL、と/ 3分、20分、1時間、2時間、4時間、8時間、24時間、48時間および72時間を含め9インキュベーション時間の下2抗体、H300及びN13、なしで、 0.5、1：1,1：2,1：4のモル比、 すなわち、1の下4、及び3の希釈、 すなわち、0.1 mg / mlの0.01 mg / mlの0.001 mg / mlの、および追加の対照試料を含む異なる人物による上記実験のトリプルテスト）6,29単独CETP、LDL単独、単独VLDL、。のOPN CETPの画像は、合理的に細かい構造の詳細で高コントラストな画像を提供した。私たちが正常に53 kDaのSMAの3次元密度マップを再構築することができますL1タンパク質CETP（ 図3D - F）単一粒子再建による。私たちは、単一の（一つのオブジェクトなし平均）のIgG抗体の3D構造の中間解像度（〜1.5 nm）を達成するために許可され、 -さらに、高コントラストのOPN画像は、個別のタンパク質（C図4A）から私たちに十分な信号を提供5 -個別の粒子の電子断層撮影（IPET）メソッド（J図4E）を介して。 IPET再構成戦略、方法、ステップバイステップのプロセスおよび構造的変動解析の詳細な説明は、以前4に報告された。 RAW画像と中間結果を含むIPET抗体再建手続きについての映画は、3D密度マップと構造のドッキングもYouTubeで5にアップロードすることによって公衆に利用可能であった。異なる個別の抗体の粒子からの3次元再構成の比較は、タンパク質のダイナミクスと、cを開示する可能性があります化学反応の4,5時にonformational変化。 kDaの1,2 200、これらの小さなタンパク質を画像化の成功は、のOPN法が小さく、非対称の構造決定や機構の発見に向けて、従来のEM境界をプッシュするための有用なツールであることを証明-タンパク質の50％以上が40の範囲の分子量を持っていることを考慮すると、 。したがって、詳細なプロトコルは以下のように提供される。

<table><tbody><tr><td>染色:ギ酸ウラニル</td><td>ストラクチャープローブ株式会社 SPI供給部門</td><td>02545-AA</td><td>http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml</td></tr><tr><td>シリンジ:1 ml NORM-JECT</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491</td></tr><tr><td>シリンジフィルター:0.2 &mu;m&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28145-487</td><td></td></tr><tr><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487 シリンジフィルター:0.02 &mu;mフィルター(アノトップ10)</td><td>Whatman</td><td>6809-1002</td><td>http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx</td></tr><tr><td>Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>D8537</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>パラフィルム:4インチx 125フィート</td><td>VWR</td><td>470152-246</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A</td></tr><tr><td>カーボン フィルム コーティング TEM グリッド: 300 メッシュ</td><td>Pacific Grid-Tech</td><td>Cu-300CN</td><td>http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon</td></tr><tr><td>カーボン フィルム コーティング TEM グリッド: 200 メッシュ</td><td>EMS (Electro Microscopy Sciences)</td><td>CF200-Cu</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx</td></tr><tr><td>ピンセット:デュモントピンセット L5</td><td>EMS(Electro Microscopy Sciences)</td><td>72882-D</td><td></td></tr><tr><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5 Milli-Q Advantage A10超純水製造システム</td><td>EMD Millipore</td><td>Milli-Q Advantage A10</td><td>http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117</td></tr><tr><td>濾紙:グレード1 サークル</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td></td><td></td><td>任意のタイプの</td></tr><tr><td>フィルターチップ:10&micro用の低保持エアロゾルフィルターチップ;L Pipettors</td><td>VWR</td><td>89174-520</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>グロー放電ユニット</td><td>Ted Pella</td><td>91000</td><td>http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm</td></tr><tr><td>フィルター チップ: 40&micro 用の低保持エアロゾル フィルター チップ;L ピペッター</td><td>VWR</td><td>89174-524</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524</td></tr><tr><td>フィルター チップ: VWR シグネチャー 200 & マイクロ;Lピペットチップ</td><td></td><td>VWR37001-528</td><td></td> https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528</tr><tr><td>ピペット</td><td>ピペットマン</td><td>F161201およびF167300</td><td>http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx</td></tr></tbody></table>

最適化された負の染色：電子顕微鏡による小型·非対称蛋白質構造を調べるためのハイスループットプロトコル

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

200 kDaの - タンパク質の構造決定は、むしろ40との間の分子量を有するタンパク質に挑戦されています。天然タンパク質の半分以上40との間の分子量を有することを考慮すると- 200 kDaの1,2、ナノメートル分解能で堅牢でハイスループット方法が必要である。ネガティブ染色（NS）電子顕微鏡法（EM）は、しばしば、タンパク質構造およびタンパク質 - タンパク質相互作用を調べるために研究室で使用されている、容易に迅速、かつ定性的なアプローチである。残念ながら、従来のNSプロトコルは、多くの場合、特に通常連銭の成果物を提示形成リポタンパク質と、タンパク質上の構造的な成果物を生成します。標準としての低温電子顕微鏡（クライオEM）からのリポタンパク質の画像を用いて、NS試料調製条件の重要なパラメータは、最近スクリーニングし、最適化されたNSプロトコル（のOPN）、改変された従来のNSプロトコル3として報告した。 ROのようなアーティファクトuleauxが大きく、さらに、（1付近）合理的に高解像度とともに高コントラスト小さく、非対称タンパク質の画像を提供する、のOPNによって制限され得る。これらの高解像度と高コントラストの画像が電子線トモグラフィー4,5のメソッドを介して、そのような160 kDaの抗体のような個別のタンパク質（単一のオブジェクトなし平均）3D再構成のためであっても好適である。さらに、のOPNは、小さなタンパク質のサンプルの数百を調べるためのハイスループットなツールとなります。例えば、53kDaのコレステリルエステル転送タンパク質（CETP）の以前に公表メカニズムは、試料6の何百ものスクリーニングおよびイメージングを含んだ。低温電子顕微鏡はめったに成功したイメージを考えると、タンパク質未満200 kDaのは、100以上のサンプル条件をスクリーニング伴う任意の調査を公開するために、まだ持って、それが小さなタンパク質を研究するためのハイスループット法のOPNを呼び出すことが公平である。うまくいけば、ここで紹介するのOPNプロトコルは、Eの境界をプッシュするための有用なツールとなりますMは、小さなタンパク質の構造、ダイナミクスとメカニズムへのEM研究を加速します。

以上のタンパク質の半分以上は、電子顕微鏡像および三次元再構成の両方に挑戦している小タンパク質（分子量&lt;200 kDa）のである。最適化されたネガティブ染色は、高いコントラストと異なる生理学的条件下で小さな非対称のタンパク質または複合体の比較的高い解像度（〜1 nm）の画像を得るため、堅牢かつ高スループットのプロトコルである。

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

この手順の全体的な目的は、ネガティブ染色電子顕微鏡法のハイスループットに最適化されたプロトコルを用いて、小さく非対称なタンパク質をイメージングすることです。まず、ネガティブ染色ワークステーションを準備している間に、準備したインキュベーションステーションでタンパク質をインキュベートします。次に、3つの水滴を用いてサンプルを順次、迅速に洗浄します。第3ステップでは、サンプルを3つの染色液ドロップに順次、慎重に染色します。最後のステップとして、EMグリッドの背面からブロッティングして過剰な溶液を除去し、窒素ガス下で穏やかに乾燥させます。最終的に、低デフォーカス条件下でのTEMイメージングにより、小さなタンパク質の高解像度画像を得ることができます。本手法のクライオ電子顕微鏡法に対する主な利点は、その効率性にあります。従来のネガティブ染色による構造的なアーティファクトを低減しつつ、小型で非対称なタンパク質構造の高スループットな解析と高コントラストなイメージングが可能です。本手法を用いることで、コレステロールエステル転送タンパク質のような小型タンパク質のメカニズムにおける構造的基盤への知見を得ることができます。本手法は、IgG抗体、高密度リポタンパク質、プロテアソームなど、サイズが大きく異なる他のタンパク質にも適用可能です。洗浄および染色のステップは、タイミングの変動やサンプルのブロッティング操作だけで最終的な染色結果に劇的な影響を及ぼすため、習得が困難であり、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。この手順の実演は、私の研究室のZ.A.リサーチフェロー向けに行われます。本プロトコルの準備にあたっては、光への曝露を最小限に抑えることに細心の注意を払い、1%尿フォームアルデヒド溶液を作成する必要があります。これには、溶液を最初にろ過する際に、シリンジ N 0.2 micron フィルター部品をホイルで包む操作が含まれます。ろ過後、実験当日に2 mLずつホイルで包んだバイアルに分注し、-80 °Cで保存します。室温の水槽で1アリコート分を解凍し、完全に解凍された状態で使用します。ホイルで包んだ状態で、再度0.02 micronフィルターでろ過します。回収用バイアルも同様にホイルで包んでください。ネガティブ染色液は、使用するまでアイスボックスで保管します。8インチの長さのパラフィルムをピペットチップサポーターで押し付け、ドロップレット保持シートを作成します。これにより、直径5mmのウェルとして機能する溝が形成されます。6列のウェルを作成した後、発泡スチロールトレイ上の氷を平らにし、その上にシートを配置します。次に、左側のシートの最初の3つのウェルに DI water を 35 µL 加えます。続いて、シートの右側の3つのウェルに、調製したネガティブ染色液を 35 µL 分注します。溶液への光照射を最小限に抑えるため、トレイにカバーをかけます。ここを染色ステーションとして使用します。次に、空のピペットチップボックスにピンセットを固定するためのアタッチメントを取り付け、EMグリッドインキュベーションステーションを準備します。ピンセットを装着した際に、氷の表面がピンセットの先端に近くなるよう、ボックスの半分まで氷を満たしてください。まず、カーボンコーティングされた300メッシュの銅製EMグリッドを約10秒間グロー放電処理します。次に、EMグリッドインキュベーションステーションに固定できるピンセットでグリッドをピックアップします。グリッドを氷から0.5インチ上の位置に、45度の傾斜をつけてピンセットで保持します。次に、タンパク質試料をDPBSで希釈し、溶液1 mLあたり50～100 µgのタンパク質濃度にします。希釈液約4 µLを直ちにEMグリッドに滴下します。試料を約1分間インキュベートしてください。1分後、フィルターペーパーでメッシュを素早く叩き、過剰な溶液を取り除きます。その後、染色ステーションにて、パラフィルム上の1滴目の水にメッシュを触れさせます。フィルターで水分を取り除き、次の水滴で濡らすという工程を素早く繰り返します。計3滴の水を使用し、可能な限り迅速に行います。緩衝液の変更がタンパク質に悪影響を及ぼすのを避けるため、グリッドの水洗は速やかに行う必要があります。最後の洗浄液を3秒以内に吸い取った後、すぐに1滴目のネガティブ染色液の上にグリッドを浮かべてください。そのまま10秒間浮かべておきます。その間に、ピンセットの先端をフィルターペーパーに押し当てて清浄します。10秒間浮かべた後、フィルターペーパーで溶液を吸い取り、次の染色液の滴に2秒間浮かべる操作を繰り返します。2秒間かけてピンセットを洗浄します。次に、グリッドの水分を吸い取り、3番目の液滴の上に置きます。このステップの間、1分間、染色ステーションにカバーをかけてください。染色の除去は、グリッドが均一に乾燥するように、EMグリッドの背面を正確な時間だけ接触させて行う必要があります。フィルターペーパーが染色の部分に長時間接触しすぎると、染色の除去量が多くなりすぎ、結像品質の低下を招く可能性があります。次に、グリッドの乾燥に進みます。まず、溶液が転移しなくなるまで、非カーボン側全体をフィルターペーパーに接触させます。次に、窒素ガスを緩やかに吹き付けます。その後、グリッドをフィルターペーパーを敷いたディッシュに移し、ディッシュに部分的に蓋をします。グリッドをディッシュに入れ、室温で30分間乾燥させます。あるいは、脂質を含むサンプルの場合は、40 °Cで1時間加熱乾燥させても構いません。完全に乾燥した後、TEMの調整を開始する前に、EMグリッドをEMグリッド保存ボックスに移します。ネガティブ染色したグリッドのカーボンフィルム領域のパワースペクトルを用いて、視認可能な最高次の thawed ring（融解リング）の分解能を確認します。この分解能は、目標とする分解能よりも高くなければなりません。次に、アライメントを調整するため、試料のカーボンフィルム領域のパワースペクトルを注意深く確認します。適切にアライメントされた状態では、20本以上の Thon rings（ソンリング）が視認でき、これは 5 Å 以上の分解能で視覚化できていることに相当します。これらのリングは、1.6 µmのデフォーカスおよび20.4 e⁻/Å²の線量条件下で、非晶質炭素像のフーリエ変換によって作成されました。次に、EMグリッドの観察中に小さなタンパク質をイメージングするため、フォーカスを約0.1 µmのシェーラーフォーカスに近い条件に戻します。理想的には、低倍率において、染色領域は通常、より厚い染色の雲状領域の縁付近に位置しています。リポタンパク質試料の構造をOPNSで観察した。例として、リコンビナントHDL、ヒト血漿、LDL、ヒト血漿IDL、およびヒト血漿VLDLを用いた。また、53 kilodaltonのCETPのようなより小さな構造も観察した。これはeemによってイメージングに成功した最小のタンパク質の一つです。CETP結晶構造を重ね合わせると、画像と非常によく一致し、極めてダイナミックな様子が分かります。また、160 kilodaltonの免疫グロブリンG抗体を用いて、不均一なタンパク質の観察も行われました。3つのサブドメインが明確に観察されました。IgG1抗体を詳細に検討し、その結晶構造との比較を行いました。IgG1抗体の結晶構造は、ドメインの位置や形状など、多くの点でこれらの抗体のEM像と一致しています。その他の観察分子には、28 kilodaltonの脂質フリーapo lipoprotein A one grow ELおよびプロテアソームが含まれます。本質的に、OPNS法は、小さな非対称構造のEMイメージングおよび関連するメカニズム研究の限界を大幅に拡張するものです。本手順を行う際は、染色試薬への光照射を可能な限り抑え、速やかに試料を洗浄し、イメージングにはニアフォーカス（near treasure focus）を使用することが重要です。単一分子のナノメートル分解能構造や、それらの間の構造変化といった追加の疑問を解決するために、電子トモグラフィーなどの他の手法を実施することができます。この展開を経て、本技術は構造生物学分野の研究者が、ヒト血漿リポタンパク質間におけるコレステロールエステル転送のメカニズムを探索するための道を切り開きました。

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この記事では、ネガティブ染色電子顕微鏡（EM）を用いて生体高分子の三次元（3D）再構成を得るために標準的な方法を説明します。このプロトコルでは、我々はランダムな円錐形の傾斜の再構成法（RCT）を使用して中解像度でサッカロマイセスセレビシエエキソソーム複合体の立体構造を取得する方法について説明します。...

ランダムコニカルチルト方式を使用したエキソソーム複合体の単粒子の電子顕微鏡再構成

負染色電子顕微鏡（EM）で視覚化するタンパク質サンプルは、ポピュラーな構造解析の方法となっている。それは、タンパク質製剤の品質の定性試験のためにもそのような研究されている分子の三次元再構成を計算すると、定量的な構造解析に有用である、と。この記事では、EMグリッドを準備する試料を染色し、電子顕微鏡で試料を可視化するための詳細なプロトコールを提示する。初心者ユーザーは、簡単にこれらのプロトコルに従うことができますし、それらのタンパク質サンプルを評価するため、他の生化学的アッセイに加えて、ルーチン分析としてEMを染色陰性活用する。...

ネガティブステインEMによるタンパク質と高分子複合体の可視化：グリッドの準備から画像取り込みに

この動画では、精製したエクソソームのネガティブ染色の手順を説明しています。陰性に染色されたエクソソームは、透過型電子顕微鏡を用いて画像化されます。この手法は、エクソソームの形態を視覚化するのに役立ちます。...

精製エクソソームのネガティブ染色:透過型電子顕微鏡によるエクソソーム形態の可視化法

多くのタンパク質は、膜表面に付着するとその機能を果たします。ナノディスク膜上の外因性タンパク質の結合は、透過型電子顕微鏡によって間接的に画像化することができます。我々は、ネガティブ染色のリンスホタングステン酸ナトリウムによって誘発されるナノディスクの特徴的なスタッキング(rouleau)が、外部タンパク質の結合によって防止されることを示す。...

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

否定的な変奏曲染色電子顕微鏡検査方法: システムに挑戦に取り組むためのツール

楽器と透過型電子顕微鏡のためのナノリットル サイズ サンプル ボリュームの準備のためのメソッドが表示されます。これは蛋白質の大幅にサンプルの損失を削減し、単一細胞ライセート visual...

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

ここでアセンブリと biolayer 干渉計 (結合) による炭疽菌毒素の分解を監視するためのプロトコルを提案する.次のアセンブリ/分解バイオ...

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル...

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

このプロトコルは、APEX2タグ付けされた膜タンパク質を、最適に保存された細胞超構造内の透過電子顕微鏡法によって局在させることができるクライオAPEX法を記述する。...

超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオAPEX法

ここで提示される電子顕微鏡法と組み合わせてネイティブ細胞膜ナノ粒子系を利用する膜蛋白質のオリゴマー状態の決定のためのプロトコルです。...

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

cryoEMを用いた高分子複合体の構造決定は、ある種のタンパク質や複合体に対して日常的なものとなっている。ここでは、このパイプラインが要約され(サンプルの準備、スクリーニング、データの取得と処理)、読者は、より困難な標本の場合に変更される可能性があり、さらに詳細なリソースと変数に向けられています。...

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

学ぶ 最適化された負の染色法を用いて、電子顕微鏡で小型・非対称タンパク質の高解像度構造を可視化するハイスループットプロトコルです。迅速な洗浄と染色ステップにより、抗体やリポタンパク質など多様なタンパク質の高コントラスト画像が得られます。

最適化された負の染色：電子顕微鏡による小型·非対称蛋白質構造を調べるためのハイスループットプロトコル

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