最適化された負の染色：電子顕微鏡による小型·非対称蛋白質構造を調べるためのハイスループットプロトコル

この手順の全体的な目標は、ネガティブ染色電子顕微鏡のハイスループット最適化プロトコルを使用して、小さく非対称なタンパク質をイメージングすることです。これは、まず、調製したインキュベーションステーションでタンパク質をインキュベートし、ネガティブ染色ワークステーションを調製することによって達成されます。手順の2番目のステップは、サンプルを3つの水滴で順番にすばやく洗浄することです。

3番目のステップは、サンプルを3つの染色液滴に順番に注意深く染色することです。最後のステップは、EMグリッドの裏側からブロッティングして余分な溶液を取り除き、窒素ガス下で穏やかに乾燥させることです。最終的には、低焦点ぼけ条件下でのTEMイメージングにより、小さなタンパク質の高解像度画像を表示することができます。

この技術の主な利点は、クライオ電気顕微鏡よりも設定されています。これにより、従来のネガティブ染色による構造アーティファクトを低減しながら、小さく非対称なタンパク質構造のハイスループット検査と高コントラストイメージングが可能になります。この方法は、コレステロールエステル移動タンパク質のような小さなタンパク質メカニズムの構造的基盤についての洞察を提供することができます。

また、IgG One抗体高密度リポタンパク質やプロテアソームなど、サイズが大きく異なる他のタンパク質にも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、タイミングのばらつきのために洗浄と染色のステップを学ぶのが難しく、サンプルブロッティングでさえ完成した染色タンパク質に劇的な影響を与える可能性があるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。このプロトコルの準備をするときは、光への曝露を最小限に抑えることに細心の注意を払って、1%小便器のフォーム8溶液を作成する必要があります。

これには、最初に溶液をろ過する時間になったときに、シリンジN 0.2ミクロンフィルター部品をホイルで包むことが含まれます。濾過後、実験当日に2ミリリットルのホイルで包まれたバイアルアリコートを摂氏マイナス80度で保存します。完全に解凍したら、室温の水浴でアリコートを解凍します。

パーツをホイルで包んだ0.02ミクロンのフィルターで再度ろ過します。収集バイアルもホイルで包む必要があります。ネガステインは、使用するまでアイスボックスに移します。

ピペットチップサポーターに8インチの長さのパラメータを押して、液滴保持シートを作成します。これにより、直径5ミリメートルの井戸として機能する道路のくぼみが作成されます。6列のウェルを作成した後、発泡スチロールトレイの表面に氷を平らにし、シートを氷の上に置きます。

次に、左側のシートの最初の3つのウェルに35マイクロリットルのDI水を追加します。次に、シート内の右側の3つのウェルに、調製したネガティブステイン溶液35マイクロリットルをロードします。溶液への光の露出を最小限に抑えるために、トレイを覆います。

これは染色ステーションとして機能します。次に、ピンセットを取り付けるためのアタッチメントが付いた空のピペットチップボックスからEMグリッドインキュベーションステーションを準備します。ピンセットを取り付けるときに氷の表面がピンセットの先端に近づくように、ボックスの半分に氷を入れます。

最初に、薄いカーボンコーティングされた300メッシュの銅EMグリッドを約10秒間放電します。次に、EMグリッドインキュベーションステーションに引っ掛けるピンセット付きのグリッドを拾います。ピンセットをグリッドに吊るして、グリッドが氷から半インチ上に45度の傾きになるようにします。

次に、DPBSでタンパク質サンプルを溶液1ミリリットルあたり50〜100マイクログラムのタンパク質で希釈します。すぐに約4マイクロリットルの希釈液をEMグリッドに適用します。サンプルを約1分間インキュベートします。

1分後、メッシュを濾紙ですばやく軽くたたいて、余分な溶液を取り除きます。次に、染色ステーションで、パラフィルムの最初の水滴にメッシュを触れます。フィルターを乾燥させ、次の液滴でフィルターを補充するプロセスをすばやく繰り返します。

合計3つの水滴を使用し、できるだけ早くこれを行います。グリッドの水洗いは、バッファーの変更がタンパク質に悪影響を及ぼさないように、迅速に行う必要があります。最後の洗浄を3秒以内に軽くたたいた後、ネガティブ染色液の最初の一滴でグリッドを浮かせ始めます。

そこに10秒間浮かべます。その間、ピンセットの先端を濾紙に押し込んで清掃します。10秒間のフロートの後、数回、濾紙で溶液を拭き取り、次の汚れの液滴に2秒間別のフロートを開始します。

2秒間でピンセットを掃除します。次に、グリッドをブロットして乾かし、3番目の液滴に置きます。このステップで染色ステーションを1分間覆います。

汚れを取り除くには、グリッドが均一に乾燥するように、EMグリッドの裏側に正確な時間触れる必要があります。濾紙が汚れに長時間触れると、汚れが取り除かれすぎて画像が悪くなる可能性があります。次に、グリッドの乾燥を進めます。

まず、溶液が移るまで、非カーボン面全体を濾紙に接触させます。次に、窒素ガスを穏やかに流します。次に、グリッドを濾紙で裏打ちされた皿に移し、皿を部分的に覆います。

グリッドを皿の中で室温で30分間乾燥させます。あるいは、脂質を含むサンプルを摂氏40度で1時間焼くこともできます。完全に乾いたら、EMグリッドをEMグリッドストレージボックスに移してから、最初にTEMを位置合わせします。

目に見える最も高い融解リングの解像度を、ネガティブに染色されたグリッドのカーボンフィルム領域のパワースペクトルで確認します。これは、目標の解像度よりも優れているはずです。次に、アライメントを調整するために、試料の炭素膜領域のパワースペクトルを慎重に確認します。適切に整列した条件下では、20個を超えるTト環を可視化することができ、これは5オングストロームよりも優れた可視化に相当します。

リングは、1.6ミクロンの焦点ぼけと20.4電子/平方の線量の下で、アモルファスカーボン像の毛皮転写によって作られました。オングストローム。次に、EMグリッドの検査中に小さなタンパク質をイメージングするために、焦点を約0.1マイクロメートルのScherzer焦点に近い状態に戻します。理想的には、汚れた領域は通常、低倍率で汚れた厚い曇った領域の端近くにあります。

リポタンパク質標本の構造をOPNSで観察しました。例としては、組換えHDL、ヒト血漿、LDL、ヒト血漿IDL、およびヒト血漿VLDLが含まれます。53キロダルトン、CETPなどの小さな構造物も見られました。

これは、eemによってイメージングに成功した最小のタンパク質の1つです。CETP結晶構造のスーパーインポジションは、画像に非常によく一致し、非常にダイナミックです。不均一なタンパク質も160キロダルトンの免疫グロブリンG抗体で観察されました。

3つのサブドメインがはっきりと見えました。IgG one抗体の詳細な調査を使用して、その結晶構造と比較しました。IgG one抗体の結晶構造は、ドメイン位置やその形状など、多くの点でこれらの抗体のEMビューと一致します。

他の見られた分子には、28キロダルトン、脂質を含まないアポリポタンパク質A one grow EL、およびプロテアソームが含まれます。基本的に、OPNS法は、小さな非対称構造のEMイメージングの境界を大幅に前進させるだけでなく、手順を試みながら関連する機構研究を行います。染色試薬への光への曝露をできるだけ減らすことが重要であり、標本をすばやく洗浄し、宝物の焦点の近くでイメージングに使用しますこの手順に続いて。

電子線トモグラフィーのような他の方法は、単一分子のナノメートル分解能構造やそれらの間の確認変化のような追加の質問に答えるために実行することができます。この開発の後、この技術は、構造生物学の分野の研究者がヒト血漿リポタンパク質間のクラスターエステル移動の磁石を探索する道を開きました。