最適化された負の染色：電子顕微鏡による小型·非対称蛋白質構造を調べるためのハイスループットプロトコル

この手順の全体的な目的は、ネガティブ染色電子顕微鏡法のハイスループットに最適化されたプロトコルを用いて、小さく非対称なタンパク質をイメージングすることです。まず、ネガティブ染色ワークステーションを準備している間に、準備したインキュベーションステーションでタンパク質をインキュベートします。次に、3つの水滴を用いてサンプルを順次、迅速に洗浄します。

第3ステップでは、サンプルを3つの染色液ドロップに順次、慎重に染色します。最後のステップとして、EMグリッドの背面からブロッティングして過剰な溶液を除去し、窒素ガス下で穏やかに乾燥させます。最終的に、低デフォーカス条件下でのTEMイメージングにより、小さなタンパク質の高解像度画像を得ることができます。

本手法のクライオ電子顕微鏡法に対する主な利点は、その効率性にあります。従来のネガティブ染色による構造的なアーティファクトを低減しつつ、小型で非対称なタンパク質構造の高スループットな解析と高コントラストなイメージングが可能です。本手法を用いることで、コレステロールエステル転送タンパク質のような小型タンパク質のメカニズムにおける構造的基盤への知見を得ることができます。

本手法は、IgG抗体、高密度リポタンパク質、プロテアソームなど、サイズが大きく異なる他のタンパク質にも適用可能です。洗浄および染色のステップは、タイミングの変動やサンプルのブロッティング操作だけで最終的な染色結果に劇的な影響を及ぼすため、習得が困難であり、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。この手順の実演は、私の研究室のZ.A.リサーチフェロー向けに行われます。本プロトコルの準備にあたっては、光への曝露を最小限に抑えることに細心の注意を払い、1%尿フォームアルデヒド溶液を作成する必要があります。

これには、溶液を最初にろ過する際に、シリンジ N 0.2 micron フィルター部品をホイルで包む操作が含まれます。ろ過後、実験当日に2 mLずつホイルで包んだバイアルに分注し、-80 °Cで保存します。室温の水槽で1アリコート分を解凍し、完全に解凍された状態で使用します。

ホイルで包んだ状態で、再度0.02 micronフィルターでろ過します。回収用バイアルも同様にホイルで包んでください。ネガティブ染色液は、使用するまでアイスボックスで保管します。

8インチの長さのパラフィルムをピペットチップサポーターで押し付け、ドロップレット保持シートを作成します。これにより、直径5mmのウェルとして機能する溝が形成されます。6列のウェルを作成した後、発泡スチロールトレイ上の氷を平らにし、その上にシートを配置します。

次に、左側のシートの最初の3つのウェルに DI water を 35 µL 加えます。続いて、シートの右側の3つのウェルに、調製したネガティブ染色液を 35 µL 分注します。溶液への光照射を最小限に抑えるため、トレイにカバーをかけます。

ここを染色ステーションとして使用します。次に、空のピペットチップボックスにピンセットを固定するためのアタッチメントを取り付け、EMグリッドインキュベーションステーションを準備します。ピンセットを装着した際に、氷の表面がピンセットの先端に近くなるよう、ボックスの半分まで氷を満たしてください。

まず、カーボンコーティングされた300メッシュの銅製EMグリッドを約10秒間グロー放電処理します。次に、EMグリッドインキュベーションステーションに固定できるピンセットでグリッドをピックアップします。グリッドを氷から0.5インチ上の位置に、45度の傾斜をつけてピンセットで保持します。

次に、タンパク質試料をDPBSで希釈し、溶液1 mLあたり50～100 µgのタンパク質濃度にします。希釈液約4 µLを直ちにEMグリッドに滴下します。試料を約1分間インキュベートしてください。

1分後、フィルターペーパーでメッシュを素早く叩き、過剰な溶液を取り除きます。その後、染色ステーションにて、パラフィルム上の1滴目の水にメッシュを触れさせます。フィルターで水分を取り除き、次の水滴で濡らすという工程を素早く繰り返します。

計3滴の水を使用し、可能な限り迅速に行います。緩衝液の変更がタンパク質に悪影響を及ぼすのを避けるため、グリッドの水洗は速やかに行う必要があります。最後の洗浄液を3秒以内に吸い取った後、すぐに1滴目のネガティブ染色液の上にグリッドを浮かべてください。

そのまま10秒間浮かべておきます。その間に、ピンセットの先端をフィルターペーパーに押し当てて清浄します。10秒間浮かべた後、フィルターペーパーで溶液を吸い取り、次の染色液の滴に2秒間浮かべる操作を繰り返します。

2秒間かけてピンセットを洗浄します。次に、グリッドの水分を吸い取り、3番目の液滴の上に置きます。このステップの間、1分間、染色ステーションにカバーをかけてください。

染色の除去は、グリッドが均一に乾燥するように、EMグリッドの背面を正確な時間だけ接触させて行う必要があります。フィルターペーパーが染色の部分に長時間接触しすぎると、染色の除去量が多くなりすぎ、結像品質の低下を招く可能性があります。次に、グリッドの乾燥に進みます。

まず、溶液が転移しなくなるまで、非カーボン側全体をフィルターペーパーに接触させます。次に、窒素ガスを緩やかに吹き付けます。その後、グリッドをフィルターペーパーを敷いたディッシュに移し、ディッシュに部分的に蓋をします。

グリッドをディッシュに入れ、室温で30分間乾燥させます。あるいは、脂質を含むサンプルの場合は、40 °Cで1時間加熱乾燥させても構いません。完全に乾燥した後、TEMの調整を開始する前に、EMグリッドをEMグリッド保存ボックスに移します。

ネガティブ染色したグリッドのカーボンフィルム領域のパワースペクトルを用いて、視認可能な最高次の thawed ring（融解リング）の分解能を確認します。この分解能は、目標とする分解能よりも高くなければなりません。次に、アライメントを調整するため、試料のカーボンフィルム領域のパワースペクトルを注意深く確認します。適切にアライメントされた状態では、20本以上の Thon rings（ソンリング）が視認でき、これは 5 Å 以上の分解能で視覚化できていることに相当します。

これらのリングは、1.6 µmのデフォーカスおよび20.4 e⁻/Ųの線量条件下で、非晶質炭素像のフーリエ変換によって作成されました。次に、EMグリッドの観察中に小さなタンパク質をイメージングするため、フォーカスを約0.1 µmのシェーラーフォーカスに近い条件に戻します。理想的には、低倍率において、染色領域は通常、より厚い染色の雲状領域の縁付近に位置しています。

リポタンパク質試料の構造をOPNSで観察した。例として、リコンビナントHDL、ヒト血漿、LDL、ヒト血漿IDL、およびヒト血漿VLDLを用いた。また、53 kilodaltonのCETPのようなより小さな構造も観察した。

これはeemによってイメージングに成功した最小のタンパク質の一つです。CETP結晶構造を重ね合わせると、画像と非常によく一致し、極めてダイナミックな様子が分かります。また、160 kilodaltonの免疫グロブリンG抗体を用いて、不均一なタンパク質の観察も行われました。

3つのサブドメインが明確に観察されました。IgG1抗体を詳細に検討し、その結晶構造との比較を行いました。IgG1抗体の結晶構造は、ドメインの位置や形状など、多くの点でこれらの抗体のEM像と一致しています。

その他の観察分子には、28 kilodaltonの脂質フリーapo lipoprotein A one grow ELおよびプロテアソームが含まれます。本質的に、OPNS法は、小さな非対称構造のEMイメージングおよび関連するメカニズム研究の限界を大幅に拡張するものです。本手順を行う際は、染色試薬への光照射を可能な限り抑え、速やかに試料を洗浄し、イメージングにはニアフォーカス（near treasure focus）を使用することが重要です。

単一分子のナノメートル分解能構造や、それらの間の構造変化といった追加の疑問を解決するために、電子トモグラフィーなどの他の手法を実施することができます。この展開を経て、本技術は構造生物学分野の研究者が、ヒト血漿リポタンパク質間におけるコレステロールエステル転送のメカニズムを探索するための道を切り開きました。