Name: 神経細胞のコミュニケーションと軸索の信号伝搬特性を研究するためマイクロ電極アレイとのインタ フェース (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学ぶマイクロ電極アレイとマイクロ流体デバイスの統合技術を用いた神経細胞コミュニケーションと軸索信号伝搬の研究方法。専用ソフトウェアで活動電位を検出・解析し、神経回路の情報伝達メカニズム解明に貢献します。

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この作品は、フェダー - Fundo Europeu デ Desenvolvimento 競う 2020 年まで地域の資金によって融資された - FCT - カルーストを通じて競争力と国際化 (POCI)、ポルトガルの 2020 年とポルトガル語で Operacional プログラム資金パラ Ciência e、技術/Ministério da Ciência、技術 e Ensino 優れたプロジェクト PTDC/CTM-ナン/3146/2014 (POCI-01-0145-フェダー-016623) のフレームワーク。ホセ ・ C ・ マテウスは FCT (PD/BD/135491/2018 年) によって支えられました。サンパウロ aguiar 氏は、プログラム Ciência - プログラム Operacional ・ ・圏環境共生分野 (POPH) - 科学的な雇用促進、ESF と MCTES とプログラム Investigador FCT POPH とマイプ社会 Europeu によって支持されました。マイクロ流体デバイスをジョアン ペドロ コンデとバージニア州の朱の監督の下で INESC - サン ・ マイクロシス テムズ、ナノテクノロジー、ポルトガルで作製しました。

( Decreto レイ113/2013 で立法はポルトガル語に転置) 欧州連合 (EU) 指令 2010年、63、EU によると動物を含むすべてのプロシージャを行った。実験的プロトコル (0421/000/000/2017) は、特定のポルトガル語に公式機関動物福祉と実験 (Direção ジェラール山脈・ デ ・ Alimentação e Veterinária - DGAV) の両方のホスト機関の倫理委員会で承認されました。
1. 文化メディアとその他のソリューションの準備
注: はたて当日使用のコーティング溶液を準備します。未使用のコーティング溶液及び培地は、下記のとおり 4 ° C または-20 ° C で保存されるかもしれない。
<ol><li>0.05% (v/v) Poly(ethylene imine) (PEI) 実用的なソリューションの 10 mL を準備します。<ol>
<li>精製 PEI を溶解することにより 0.25% (w/v) ペイ原液 20 mL を準備 (材料表参照) 滅菌水で。</li>
		<li>8 mL の滅菌蒸留水に 0.25% (w/v) ペイ原液 2 mL を希釈します。よく混合し、使用します。未使用の溶液は 4 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 μ g/mL ラミニン溶液 1 mL を準備します。<ol>
<li>基本培地の 995 μ L で 1 mg/mL ラミニン原液の 5 μ L を希釈 (材料の表を参照してください)。よく混合し、使用します。未使用ソリューションは、-20 ° C で 1-2 週間冷凍保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>HEPES バッファー ハンクの平衡塩溶液 (H HBSS) の 1 リットルを準備します。<ol>
<li>50 mL の純水に粉末を HEPES 11.9 g を溶解することにより 1 M HEPES 溶液を準備します。7.2 pH を調整します。</li>
		<li>800 mL の純水に 5.6 mM グルコース、0.3 mM ナトリウム リン酸水素 138 mM 塩化ナトリウム 0.44 mM リン酸-カリウム 5.33 mM 塩化カリウムを溶解することにより (カルシウムとマグネシウム) なし H HBSS ソリューションを準備します。</li>
		<li>1 M HEPES 溶液 (15 mM の最終的な集中) 15 mL を追加します。</li>
		<li>0.2 0.3 pH 調整目的 pH 7.4 1 を使用して以下のユニット N の塩酸または水酸化ナトリウム N 1。最終的な解決の容積を構成する超純水を追加します。 ろ過中に上昇する傾向に pH に注意してください。</li>
		<li>0.22 μ m の気孔率 poly(ether sulfone) (PES) 膜を用いたろ過滅菌します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 mL を準備 H HBSS の 10% を含む熱非動化ウシ胎児血清 (hiFBS)。<ol>
<li>HiFBS H HBSS 9 mL に 1 mL を希釈します。よく混合し、使用します。未使用のソリューションは、3-4 週間の 4 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mg/mL の 5 mL のトリプシン溶液を準備します。<ol>
<li>使用前にすぐに H HBSS の 5 mL のトリプシンの 7.5 mg を溶解します。0.22 μ m の気孔率の PES 膜を用いたろ過滅菌します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>補われた媒体の 50 mL を準備します。<ol>
<li>50 mL のコニカル チューブ ミックス基礎培地の 48.5 mL (材料の表を参照)、2% (v/v) B-27 サプリメント 0.5 mM L グルタミンそして 1% ペン/連鎖球菌 (10,000 U/mL ペニシリンおよび 10,000 μ g/mL ストマイ)。補われた媒体は、3-4 週間の 4 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. マイクロ流体と MEA デバイスの準備
注: セル播種前日に 2.1 2.11 の手順に従います。
<ol><li>きれいなマイクロ流体デバイス作製とビニール テープを使用して他の残骸を削除します。デバイスのすべての領域に到達するデバイスに対してテープを軽く押します。</li>
	<li>空気プラズマ クリーニング 3 分 (0.3 mbar) の表面をきれいにし、それを親水性の MEA。</li>
	<li>簡単に 70% エタノールでマイクロ流体デバイスが水没し、層流フードの内部空気乾燥させます。</li>
	<li>滅菌 90 mm シャーレ内各 MEA を置き、15 分間の紫外線 (UV) 照射によって殺菌しなさいそれら。</li>
	<li>37 ° C で少なくとも 1 h の 0.05% (v/v) ペイ ソリューションの 500 μ L での孵化によって MEA 中央表面積をコートします。 注:17の他の人が説明したとおり、MEAs の PEI コーティングの poly(lysine) コーティングを使用してより少ないセルに結果します。</li>
	<li>MEA 表面からプリンスエド ワード島塗液を吸引させ、測定 4 x 1 ml の滅菌蒸留水します。電極が損傷することができますこの手順を洗う時に MEA の表面には触れないように注意します。</li>
	<li>層流フードの内部実体顕微鏡に導かれ、センターの MEA チップ、MEA の中央の領域に 1 mL の滅菌水を追加します。</li>
	<li>マイクロ流体デバイス MEA 表面の上に置きます。</li>
	<li>慎重に MEA の電極グリッドとマイクロ流体デバイスの溝を合わせます。</li>
	<li>正しく揃うと、慎重に MEA やマイクロ流体デバイスに触れることがなく余分な水分を吸引します。</li>
	<li>一晩乾燥し完全な付属品を許可する 37 ° C で µEFs を孵化させなさい。添付ファイルを容易にするために軽く押して、MEA に対してマイクロ流体デバイス。 注: は、細胞播種日 2.12 のステップを実行します。</li>
	<li>µEFs を完全に乾燥して、150 μ L の 5 μ g/mL ラミニン コート液とマイクロ流体井戸を読み込まれ、細胞を播種する前に少なくとも 2 時間の 37 ° C で孵化させなさい。 注: ラミニン溶液で µEF をロードするときは、ソリューションが溝を埋めることを確認します。真空を使用すると、溝の中に存在する可能性があります任意の空気の泡を削除できます。</li>
</ol>3. 前頭前皮質の解剖
<ol><li>胚が除去の郭清範囲を準備します。<ol>
<li>作業面の 70% エタノール手術器具を消毒します。 注: この解剖は無菌操作、消毒は汚染のチャンスを減らすのに役立ちます。</li>
		<li>郭清範囲を閉じ込めると、胚が除去の手術器具をレイアウト、きれいなおむつを使用します。</li>
		<li>冷たい H HBSS でいっぱい 4 90 mm シャーレを準備し、郭清範囲の近くに氷が付いている皿の上に置きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>二酸化炭素 (CO2) 吸入による E-18 時間妊娠 Wistar ラットを安楽死させます。</li>
	<li>プロシージャが完了したら、CO2チャンバーから動物を削除し、安楽死、デスメタルなどの二次的な方法で死を確認します。</li>
	<li>使い捨ておむつの上に動物の腹側を配置、下腹部を 70% エタノール スプレーし、鉗子、はさみの助けを借りて、子宮を公開する、皮膚を切って U 字型を作ります。</li>
	<li>慎重に胚を子宮から離れて任意の結合組織を切断することによって削除し、冷たい H HBSS でペトリ皿のいずれかに配置します。</li>
	<li>それぞれの胚を胚嚢から削除し、鉗子、はさみの助けを借りて、胎児の首をはねます。</li>
	<li>Embryo´s 頭を冷 H HBSS でいっぱい 2 番目ペトリ皿に転送します。</li>
	<li>それぞれの胚の 3.6 3.7 の手順を繰り返します。</li>
	<li>前頭前野を解剖します。<ol>
<li>Embryo´s 頭をペトリ皿 3 分の 1 に転送します。</li>
		<li>ピンセットのペアを使用して、脳を公開します。</li>
		<li>その空洞から脳を外し、冷たい H HBSS でそれをカバーします。</li>
		<li>存在する場合、削除し、嗅球を破棄します。前頭前野を解剖し、髄膜を削除します。</li>
		<li>冷たい H HBSS でいっぱい 4 ペトリ皿に前頭前野のフラグメントを転送します。</li>
		<li>3.9.1 3.9.5 各胚のための手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 大脳皮質ニューロンの解離と µEF の文化
注: 次の手順は、層流フードの内部実行 15 分サイクル UV 殺菌の後。ボンネット内に配置すべての材料と同様に、表面積を作業する必要があります以前の 70% エタノール消毒すること。
<ol><li>1.5 の手順で説明するよう以前加重トリプシン H HBSS の 5 mL に溶解し、ソリューションをフィルターします。</li>
	<li>以前 H HBSS の 5 mL の合計で解剖皮質部分を収集します。滅菌 15 mL の円錐管に転送します。</li>
	<li>皮質の断片を含むチューブに作りたて 1.5 mg/mL のトリプシン溶液の 2.3 mL を追加します。</li>
	<li>懸濁液を混合し、37 ° C、15 分インキュベート (簡潔に攪拌 5 分ごと)。</li>
	<li>組織の消化を停止し、トリプシンを洗い流します。<ol>
<li>トリプシンを含む上清を捨てます。残りのトリプシンを不活化する H HBSS 含む 10% hiFBS 5 mL を追加します。軽く振りま します。</li>
		<li>落ち着くし、上澄みを廃棄し、皮質の断片をしましょう。</li>
		<li>HiFBS 残基を削除する H HBSS の 5 mL を追加します。皮質フラグメント落ち着くし、上澄みを廃棄しなさい</li>
		<li>再度 H HBSS の 5 mL と皮質の断片を洗います。</li>
		<li>皮質フラグメント落ち着くし、上澄みを廃棄しなさい補われた神経細胞培地 5 mL を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>機械的に 5 mL の血清学のピペットを持つ皮質フラグメントを切り離して考えるの上下にゆっくりとピペッティングにより 10-15 回。必要な場合は、細胞懸濁液が均質になるまで小口径ピペットを使用して手順を繰り返します。</li>
	<li>残りの微量の組織を破棄するには、細胞懸濁液トラフ 40 μ m の細胞のストレーナーをフィルタ リングします。</li>
	<li>実行可能なセルをカウントし、細胞密度を決定します。<ol>
<li>マイクロ チューブ、0.4% (w/v) トリパン ブルー 20 μ L 細胞懸濁液 20 μ L を追加します。磨砕液をよく混合し、10 μ L をカウント部屋ノイバウアーに転送します。</li>
		<li>実行可能なセルをカウントし、実行可能なセルの細胞密度を決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>107セル/mL x 3.6 細胞密度を調整する (必要な場合、細胞懸濁液を遠心分離)。</li>
	<li>細胞播種の直前に、µEF のすべての井戸からラミニン コーティングを削除します。µEF 軸索コンパートメントの各ウェルに補われた媒体の 50 μ L をピペットします。</li>
	<li>µEF ヒヨコ コンパートメントに細胞懸濁液 5 μ L をシードします。基板には添付ファイルのセルに 1 h、37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>軽く埋めるそれぞれ温め補われた培地で µEF のも。37 ° c 5% CO2付属の加湿器インキュベーター、µEF に転送します。 注: クイック培養培地の蒸発を避けるためには、µEF を運ぶシャーレの中の水で満たされた開かれたチューブを配置します。</li>
	<li>文化のすべての 2-3 日培養培地の 50% を置き換えることで、必要な期間の文化を維持します。 注: 実験の後マイクロ流体は取外し可能測定から一晩水に µEF を浸すことによって。必要な場合、鉗子の助けを借りて、マイクロ流体は慎重にはがします。Mea は一晩培養 1% (v/v) 商業酵素洗剤で洗浄できます (材料の表を参照してください)。</li>
</ol>5. 自発神経活動の記録
注: MEAs の萌芽期の大脳皮質ニューロンの文化の中には 7 日体外 (DIV) を取るが、2-3 週間 (14-21 部) 成熟し、展示する安定した活動と同時に通常自発を展示します。研究の目的を用いた電気生理学的測定を開始するタイミングを決定する実験者次第です。商業記録システムを使用してこのプロトコルで µEF から神経細胞活動の記録を実証 (ハードウェア詳細については材料の表を参照)、加熱モジュールを組み込みます。自由に利用できるソフトウェアを用いて録音を行うため (詳細についてはソフトウェアの材料表を参照)。
<ol><li>記録システム ・温度コント ローラー MEA をオンにし、37 ° C に到達する前置増幅器の温水のベース プレートを許可します。 注: 長期的な録音のため (> 一度に 30 分) 1 つは CO2の大気を保持しているシステムにする必要があります。</li>
	<li>プリアンプ (パッチアンプ用アダプター) に、µEF を配置します。 注: は、MEA チップがエッジを左上の参照番号と正しく揃っていることを確認します。用いて MEA チップは回転対称形が、このアライメント電極が、ハードウェア Id のピン配置の正しい向きに一致します。</li>
	<li>プリアンプ蓋のラッチを閉じて。</li>
	<li>記録は、記録ソフトウェアを開き、記録パラメーターと (記録方式をセットアップする方法の詳細についてはソフトウェアのマニュアルを参照) の記録されたデータ ストリームのパスを定義します。 注: 20 kHz のサンプリング レートで集録は一般に十分なほとんどのアプリケーションです。高いサンプリング周波数スパイク タイミングでより高い精度が必要な場合はお勧めです。1 つはレコードのスパイクのみにしようとする、信号の低周波成分を減衰 300 Hz でハイパス フィルターを設定します。生およびフィルター処理されたデータが同時に記録されている場合データ ファイルのサイズが大きく広がります。生データのオフライン フィルタ リングを行うことは常にです。データを削減するには、ファイル サイズ 1 電極から記録 (溝内唯一電極など) を制限できます。</li>
	<li>データ集録を開始する開始 DAQをクリックします。活動と記録の開始の実行しているトレースを表示するかどうかはチェックしてください。 注: 騒音レベルは通常は溝に対応する微小電極でわずかに高いです。騒音レベルが高すぎる場合 (ピーク-ピーク振幅 > 50 μ V) または良い pin パッドの接触を妨げる汚れによる非定常複数の電極で、かもしれない。この問題は、通常 MEA 接触パッドと 70% のエタノールで湿らせた綿棒を使用してプリアンプ ピンを優しくクリーニング。</li>
	<li>解析ソフトウェアで録音したファイルを開く (参照材料表) データを迅速に探索します。</li>
</ol>6. データの分析
注: 次の手順は、µSpikeHunter ソフトウェア、µEF で記録されたデータを分析する (pauloaguiar@ineb.up.pt を求める電子メールに自由に利用できる)、aguiar 氏の研究室で開発した計算ツールを使用する方法を示します。グラフィカル ユーザー インターフェイス (図 2) を使用してデータを読み込む、スパイクに伝播する波を識別、その方向を決定する (前向性か逆行) 伝播速度を推定し、。µSpikeHunter は、60、120、および 256 電極測定と組み合わせて使用することができます MEA2100 家族システムを用いての録音から生成された HDF5 ファイルと互換性が。HDF5 ファイルを自由に利用できるソフトウェアを使用してマルチ チャネル実験者を用いて録音を簡単に変換できる (材料の表を参照してください)。
<ol><li>記録ファイルを選択する参照をクリックします。サンプリング レート、録音時間、録音データ ストリーム (例えば、生データ、フィルター処理されたデータ) の一覧を表示する [ファイル情報」ボタンをクリックします。 注: 真伝搬速度推定のため勧めします分析生データ ストリームを選択します。</li>
	<li>分析のための電極 (単一行または microgroove に関連付けられた列) を選択し、信号ノイズの標準偏差 (SD) x 6 でスパイク検出しきい値 (正または負のフェーズ) を設定します。データの読み取りイベント検出器を適用し、特定された伝搬シーケンスを取得するをクリックします。 注: 条件を満たしている場合、検出された伝播のシーケンスの一覧は [解析] パネルを設定します。ユーザーは、表示し、およびトレース、電圧、電極間の相関、単一シーケンス伝播速度、kymograph オーディオの再生ツールを含む伝搬シーケンスのいくつかの解析ツールと対話できます。伝搬速度の推定は、電極のまたはすべてのペアの見積もりの平均値として任意のペアを得ることが、この推定は最も遠いペアを選択した場合より信頼性の高い。</li>
	<li>興味の電極セットの前の手順を繰り返します。CSV ファイルにすべての識別された伝搬シーケンス (、電極のそれぞれ) に時間とスパイクの振幅を保存するすべてのイベントを保存をクリックするたびに。</li>
	<li>文化 (例えば発火、スパイク間間隔) の活動のパターンのさらなる分析のためのデータ解析環境に CSV ファイルをインポートします。</li>
</ol>

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<li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+surface+wettability+of+poly%28dimethyl%29+siloxane+%28PDMS%29+and+glass+under+oxygen-plasma+treatment+and+correlation+with+bond+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microelectromechanical+Systems%22%5BJournal%5D)">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li>
<li>Heiney, K., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeiney%2C+K+%22%CE%BCSpikeHunter%3A+An+advanced+computational+tool+for+the+analysis+of+neuronal+communication+and+action+potential+propagation+in+microfluidic+platforms%22">μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms</a>. , (2018).</li>
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ここで提示されたプロトコルは、記録されたデータを分析する方法と、µEF、マイクロ流体デバイスと標準的な市販デザイン、MEA の構成を組み立てる方法を示しています。
実験を設計するとき研究者考慮しなければならない体外モデルがマイクログルーブ手配を拘束 MEA 固定グリッドによって制限されること。特定のマイクロまたは MEA の設計の使用の実験的ニーズが異なりますが、一般的には、同じ手順を実行する必要があります異なる µEF 構成に適用されます。
µEF アセンブリは、ユーザーが将来的に組み立てられた µEF を再利用しようとするかどうかの前に重要な意思決定の実験します。MEAs20マイクロ流体デバイスの共有結合に両面に酸素プラズマを用いた治療を行うことができます。しかし、このシールは頻繁になります MEA チップ、更なる実験に使用できなくなるパッシベーション膜の損害賠償不可逆的マイクロ流体デバイスをデタッチします。この問題を回避するために研究グループを (...

神経回路における電気通信を理解することは、通常の機能を明らかにし、機能不全に対処するための治療戦略を考案する基本的なステップです。ニューロンは、統合、計算し、細い軸索に沿って伝播活動電位 (APs) を中継します。従来の電気生理学的手法 (例えば、パッチク ランプ) は神経細胞の活動を研究するための強力な技術が、細胞体や樹状突起などのより大きい細胞構造に制限が多い。イメージング技術を提供高空間分解能、軸索信号を研究する代わりに、彼らが技術的に困難な実行し、長期の測定値1を許可しません。この文脈において微小電極アレイ (Mea) とマイクロ流体の組み合わせ2 培養神経回路網内の neuron´s 活動と信号伝送の基本特性を明らかに強力な貢献が出来る,3。
MEA 技術は、神経細胞培養の細胞外記録に依存します。この電気生理学的手法の主な利点は、長期的な同時刺激と非侵襲的方法3複数のサイトでの記録をサポートする能力です。Mea は、ガラス基板に埋め込まれた生体適合性、高い導電性と耐腐食性の電極から成っています。従来の携帯文化バイオ-コーティング、大幅細胞接着を促進することによって基板とセルの3,4間シールの抵抗になると互換性があります。また、彼らはデザインで汎用性が高く、電極のサイズ、形状、密度の異なる場合があります。全体的にみて、Mea は、同時のライブ イメージング、電気生理学的刺激の録音を許可の利点と従来の細胞培養容器として働きます。
MEA 技術の使用は、ニューラル ネットワークの5の重要な機能の研究に貢献しています。しかし、コミュニケーションと神経回路における Ap 伝搬を研究するため測定のパフォーマンスを制限する固有の機能があります。Mea は、単一細胞と軸索のようなも細胞レベル下の構造からの録音を有効にするが、ヒヨコの信号と比較して、軸索の信号を持って非常に低い信号対雑音比 (SNR)6。また、すべての電極の周りのすべてのソースからの細胞外の電位を感知の特徴は、神経回路の信号伝達特性のトラッキングを妨げます。
最近の研究より良い記録条件に軸索が育てることができる狭いマイクロ流路内で配置電極を持っていることによって得られること、ただし、実証しています。この構成により、sn 比の大幅な増加など、簡単にすることができます軸索信号を伝搬する検出7,8,9,10、11,12、 13。MEA 技術とマイクロ流体デバイスを同盟の戦略は、電気的に絶縁の微小環境軸索信号11を増幅する適切なを作成します。また、microgroove に沿って複数の検出電極の存在は軸索の信号伝搬特性の検出と評価のための基礎です。
ニューロン ネットワークの非常に制御可能な地形とそのような体外プラットフォームは、多くの研究の質問14に適応できます。これらのプラットフォームは神経文化のコンテキストで使用されること適したが、エンジニアの共同文化構成、神経細胞と他の細胞型との間の通信を監視および評価することができますに拡大することができます。このセットアップは、したがって多くの神経発達、神経回路、情報コーディング、神経変性と再生に関するなど神経関連研究を探検する非常に興味深い条件を提供します。さらに、ひと誘導多能性幹細胞15,16の新たなモデルとの組み合わせでは、神経系に影響を与える人間の病気のための潜在的な治療法の開発に新たな道を開くことができます。
私たちの研究室携帯電話やネットワークのレベルとその意義の生理・病態神経系で神経プロセスを理解する電極を組み合わせてマイクロ (µEF) このプラットフォームを使用してください。基板統合測定区分神経文化を作成する方法を示しますこの議定書の目的は、神経科学の分野でこのようなプラットフォームの値を指定すると、このプラットフォームで正常に録音する方法培養ニューロンの作り方分析し、そのような実験の結果を解釈します。このプロトコルは、情報伝達における神経文化の実験のツールボックスを豊かに確かに。

<table><tbody><tr><td>B-27 サプリメント (50X)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>LTI17504-044</td><td></td></tr><tr><td>分岐ポリ(エチレンイミン) (PEI), 25 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>2.5 kDaカットオフメンブレンを用いた透析により、分岐PEIを4°Cで3日間精製します。5 mM HCl溶液に対するC溶液(毎日更新)。精製したPEIを凍結乾燥します。</td></tr><tr><td>セルストレーナー(40 &micro;m)&nbsp;</td><td>ファルコン</td><td>352340</td><td></td></tr>円<tr><td>錐形マイクロチューブ(1.5 ml)</td><td>VWR</td><td>211-0015</td><td></td></tr><tr><td>使い捨ておむつ、60x40 cm</td><td>Bastos Viegas SA</td><td>455-019</td><td></td></tr><tr><td>鉗子デュモン#5、ストレート</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>鉗子デュモン#5/45</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>鉗子デュモン#7、湾曲</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清プレミアム</td><td>バイオウエスト</td><td>S181BH-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ラミニンEngelbreth-Holm-Swarmから&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td> ラ<td>ミニンストック溶液を1 mg/mLで調製し、それぞれの容量の非添加培地に粉末を溶解します。ラミニン溶液を-20°Cで保存します。小さなアリコート(20 &micro;L)凍結/解凍サイクルの繰り返しを避けるため。</td></tr><tr><td>L-グルタミン 200mM&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>LTID25030-024</td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアー改良計数室(血球計算盤)</td><td>マリエンフェルト</td><td>630010</td><td></td></tr><tr><td>神経基礎培地 (1X)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21103-049</td><td>神経細胞培養に使用される基礎培地</td></tr><tr><td>PDMS マイクロ流体デバイス&nbsp;</td><td>該当なし</td>、<td>該当</td>なし<td>、450&muの20マイクログルーブで相互接続された2つのセル播種コンパートメントで構成されています。m 長さ & 時間。10 &mu;mの高さと時間。14 &mu;m幅の寸法と86&microで区切られています。m (総インタースペース 100 &mu;m)です。</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)溶液(100X)</td><td>Biowest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>PESシリンジフィルターユニット(&Oslash; 30 mm)、0.22 &micro;m&nbsp;</td><td>Frilabo</td><td>1730012</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン コニカル チューブ、15 ml</td><td>サーモ フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン コニカル チューブ、50 ml</td><td>サーモ フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン ディスポザベル セロジカル ピペット、10 ml&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンディスポザベル血清ピペット、5 ml&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>標準再生セルロースメンブレン (2 kDa)&nbsp;&nbsp;</td><td>スペクトラムラボ</td><td>132107</td><td></td></tr><tr><td>標準的な外科用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91401-14</td><td></td></tr><tr><td>基板一体型平面MEAs(256マイクロ電極)</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>256MEA100/30iR-ITO</td><td>252窒化チタン(TiN)記録電極と4つの内部参照電極を16×16の正方形グリッドに整理。各記録電極は30μです。直径はmで、間隔は100μ;mです。</td></tr><tr><td>シリンジルアーロックチップ、10 ml&nbsp;</td><td>テルモヨーロッパ</td><td>5100-X00V0</td><td></td></tr>シ<tr><td>リンジルアーロックチップ、50ml&nbsp;</td><td>テルモヨーロッパ</td><td>8300006682</td><td></td></tr><tr><td>テルガザイム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>Z273287&nbsp;</td><td>MEAsの洗浄に使用される酵素活性粉末洗剤</td></tr><tr><td>組織培養プレート、35 mm&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>27150</td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート、90 mm</td><td>フリラボ</td><td>900095</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液(0.4%)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン (1:250)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>Vinyl tape 471</td><td>3M</td><td>B40071909</td><td></td></tr></tbody></table>

神経細胞のコミュニケーションと軸索の信号伝搬特性を研究するためマイクロ電極アレイとのインタ フェース

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

微小電極アレイ (Mea)生体外で神経機能研究に活躍しています。これらのデバイスは、長時間同時非侵襲的な記録/電気生理学的活性化を許可します。コミュニケーションを理解し、信号を神経回路網の伝搬しようとしたとき、すべての電極の周りのすべてのソースからの信号を検出のプロパティは不利ななります。神経ネットワークのいくつかのニューロンは、同時にアクティブにできるし、差別し、信号伝搬特性を追跡しにくく、重複する活動電位を生成することができます。この制限を考慮して分離し、高分解能を持つ軸索信号を増幅することができる電気生理学的コミュニケーションの評価に焦点を当てた体外セットアップを設けています。マイクロ流体デバイスと意味のインタ フェースで我々 は軸索と電極の配置の制御された神経の文化を区分することができます。このセットアップでは、数週間のコース上高い信号対雑音比とスパイクの伝搬の録音ができます。特殊なデータ解析アルゴリズムを組み合わせると、いくつかの通信の詳細な数量を提供しています前向性スパイク発火率、伝導障害伝播速度などの関連プロパティおよびコーディングのメカニズム。
このプロトコルは、基板統合測定上区分神経文化セットアップを作成する方法、このセットアップで神経細胞を培養する方法と正常に記録、分析およびそのような実験の結果を解釈する方法を示します。ここでは、神経回路および軸索の信号伝搬特性の理解を確立されたセットアップが簡略化する方法を示す.これらのプラットフォームは、ニューロン ネットワークの設計および制御可能な地形での in vitroモデルの新しい道を開きます。彼らは、同種の神経文化または共同文化構成、たとえば、感覚ニューロンと他の細胞型との間の通信は監視は、評価のコンテキストで使用できます。このセットアップは、神経発達、神経回路、コーディング、神経変性と再生に関するアプローチの情報を勉強する非常に興味深い状態を提供します。

ここで説明されているプロトコルを使用して、µEF でシード E-18 ラット大脳皮質ニューロンが開発し、1 ヶ月以上のこれらの培養条件で健康を維持することができます。文化では、3 〜 5 日早く皮質ニューロンは µEF (図 1) の軸索のコンパートメントに向かって溝を通して成長します。15 日間培養後 µEF 上で培養した大脳皮質ニューロン活動の安定したレベルを示すことが予想が、溝に沿って活動電位の伝搬が期待されます。古い文化 (&gt; 14 DIV) 従来 MEA 録音18,19のようにアクティビティのバーストによって支配される傾向にあります。
録音およびデータ分析
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このプロトコルを目指す活動電位神経文化伝達を研究するためのマイクロ流体デバイスと体外電極アレイを結合する方法を示します。データ分析、すなわち検出と、活動電位伝搬の特性は新しい高度なを使用して実行されるまだユーザーフレンドリーおよび自由に利用できる計算ツール。

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

このプロトコルの全体的な目標は、マイクロ流体とマイクロ電極アレイを組み合わせて、神経伝達と軸索信号伝播の研究に適したプラットフォームを生成する方法を実証することです。こんにちは、私はパウロ・アギアールで、私はポルトガルのポルト大学で生物医学工学のコードを書くために使用されるINEBの神経工学と計算神経科学ラボのPIです。神経回路における情報伝達を理解することは、神経科学における最大の課題の1つです。今日は、個々のマイクロアクチュエータアレイと、当社のラボで開発されたマイクロ流体およびソフトウェアツールを組み合わせて、伝達するアクション電位を検出して特徴付ける方法を紹介します。この設定は、さまざまな研究、すなわち神経コーディングとデコード、および感覚ニューロンと他の細胞タイプ間の通信で使用します。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは非常に重要であると考えています。マイクロ流体およびマイクロ電極アレイアセンブリは管理が困難であるため、プロトコルを再現するだけで再現が困難です。市場にとって、このプラットフォームでのカルト販売は、従来のAABのように簡単ではなく、セルシッティングのもの、および培養磁石に特別な注意が必要です。この設定により、伝播速度や方向など、よく制御された環境での通信関連の特性を調べることができます。記録手順は単純ですが、データ分析には知識と適切な計算ツールの使用が必要です。セルが座る前日に、マイクロ流体デバイスを準備し、ビニールテープでクリーニングすることによって開始します。テープをデバイスにそっと押し付けて、マイクロ流体のすべての領域に到達します。空気プラズマは、表面をきれいにし、より親水性にするために3分間MEAをきれいにします。層流フードの内部で、マイクロ流体を70%エタノールに沈める。彼らが空気乾燥することを許可します。各MEAをシャーレに入れ、15分間の紫外線暴露で殺菌する。その後、500マイクロリットルのPEI溶液でMEAの中央領域に行きます。少なくとも1時間インキュベートする。層流フードの内側に、MEA表面からPEIコーティング溶液を吸引する。その後、滅菌水1ミリリットルでMEAを4回洗います。滅菌顕微鏡の助けを借りて、層流フードの内部に置かれる。MEAチップを中央に配置し、1ミリリットルの無菌水をMEAの中央領域に加えます。次に、MEA表面の上にマイクロ流体装置を配置し、MEAのマイクロアクティブグリッドのマイクロ溝を慎重に整列させます。過剰な水を吸引し、37度で一晩インキュベートし、完全な付着を可能にする。翌日、ラミニンで井戸を積み込み、再びインキュベートします。胚のサスを採取した後、前頭前野解剖に進む。鉗子のペアを使用して、慎重に脳を露出させることから始めます。その後、空洞から脳をそっと取り除きます。冷たいH-HBSSでそれをカバーしてください。存在する場合は、嗅球を取り外して捨てます。最後に、前頭前野を解剖する。髄液の完全な除去を確認します。両方の半球に対してこの手順を繰り返します。あなたの研究に必要な脳の数のために。層流フードの内部で、以前にH-HBSSの合計5ミリリットルで解剖された皮質断片を収集する。次いで、これらの断片を滅菌15ミリリットルの慢性チューブに移す。ピペット、皮質断片を含むチューブに調製したばかりのトリプシン溶液を2.3ミリリットル有する。懸濁液を混合し、37度で15分間インキュベートします。5分ごとに攪拌します。次に、トリプシンを含む上清を捨て、FBSを含むH-HBSSを添加し、残りのトリプシンを不活性化する。穏やかに攪拌します。皮質の断片を落ち着かせ、上清を捨てます。H-HBSSで2回洗浄し、FBSを取り除き、上澄み物を再度捨てます。補足された神経基底培地を追加し、ゆっくりと上下にピペットを行うことによって組織を機械的に解化する。細胞ストレーナーを通して塩懸濁液を濾過することによって残りの組織を捨てる。次に、20マイクロリットルのセル懸濁液を20マイクロリットルのトリパンブルーと混合します。10マイクロリットルをノイバウアーチャンバーに移し、生存細胞の数を数える。細胞が座る直前に、マイクロEFのすべての井戸からラミニンを取り除きます。次に、軸索コンパートメントの各ウェルに上清培地の小容量を加えます。5マイクロリットルの細胞懸濁液を体液室にゆっくりと播種する。細胞が基板に付着できるように、37度で1時間インキュベートします。1時間後、温かい補充された媒体で各井戸をそっと満たします。セルの分離を避けるために、少量を追加します。次いで、マイクロEFをインキュベーターに移します。ここでは、インビトロで5日間の培養を示す。1週間後、文化は自発的な活動を示し始めます。録音を行う前に、温度コントローラを使用してプリアンプ火災ベースプレートを食べます。次に、マイクロEFをプリアンプに置き、蓋を閉じてラッチします。記録するには、マルチチャンネル実験ソフトウェアを開きます。サンプリング レートを 20 キロヘルツに設定します。フィルタと記録されたボックスをドラッグし、それらを連続して接続して、生データとフィルタリングされたデータの両方を記録します。信号を視覚化し、迅速な記録を取得するデータ収集を開始します。記録されたデータは、マルチチャンネルアナライザを使用して迅速に探索することができます。ここで、マイクロ溝に沿った信号伝搬は既に明らかになっている。この伝播イベントを識別して特徴付けるには、マイクロスパイクハンターで録音を開きます。ファイル情報ボタンをクリックして記録設定にアクセスし、分析用のマイクロ電極のセットを選択します。イベントの伝達のしきい値を設定します。そして、データを素早く読み取ります。ソフトウェアは、検出されたすべてのシーケンスを一覧表示します。その後、伝播速度を情報として、マイクロ電極の対の間、およびそれらの距離間相関と相互相関に基づいて評価することができます。この化学グラフツールを使用すると、伝播速度を手動で推定できます。ここでは、伝播イベントを示しています。マイクロ溝内の4つのマイクロ電極に沿って検出される。これらのイベントは、ラッサープロットで表すことができます。ここでは、記録の最初の2分間の11マイクログルーブに沿った伝達活動です。高く、低い活動のマイクロ溝は、丁重に黄色と赤で着色されています。11 マイクログルーブに沿ったアクティビティの同期化に注意してください。同期は、アクティビティの速度とは関係ありません。2つのマイクロ溝の瞬間焼成速度の変動に見られるように。マイクログルーブは、箱とウィスカプロットに示すように、軸索信号増幅器としても機能します。マイクロ流体とMEAを組み合わせる方法と、ニューロンを培養する方法を示しました。また、これらの記録から意味のあるデータを記録し、抽出する方法。このデモンストレーションが、なぜ神経回路のコミュニケーションを研究したいのか、研究に役立つことを願っています。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

電気生理学的にマイクロ流体の適用

バイオMEMS：生物学者とエンジニアの間の新しいコラボレーションを鍛造

この研究では、神経細胞の軸索と小説（ASTRO）グリア共培養プラットフォームをセットアップする手順について説明します。この共培養系では、単一の軸索（と単一神経膠細胞）との間の直接的な相互作用の操作は、グリアシグナリング相互ニューロンのメカニズム解析を可能にすることが可能となる。...

マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

出典: Vanegas, M. I., et al.薬物注入と電気生理学を組み合わせたマイクロインジェクトロードシステムJ. Vis.

マイクロ流体ベースのマイクロインジェストロードシステム(薬物注入と電気生理学の複合)

生体材料コーティングのチップ内のプラズマパターニングのための単一ニューロンマイクロ流体アレイ化と水のマスキングのためのプロトコルが記載されている。高度に相互接続された共培養細胞は、最小限の入力を用いて調製することができる。...

単セルの精度で神経共培養の調製

この原稿は、空間的に閉じ込められた、機能的に相互接続された神経回路からなる生体外モジュラーネットワークで成長するプロトコルについて説明します。ポリマーマスクは、培養基材上に細胞接着を促進するために、パターンにタンパク質層が使用される。メッキニューロンは、被覆された領域自発的な接続を確立し、電気生理学的活性を示す上で成長。...

デザイン、治療、セルラーめっき、機能的に相互接続された回路で構成モジュラー神経回路網の培養表面

ここでは、腹側海馬脳波との組み合わせで、てんかんと非てんかんラットのアスパラギン酸とグルタミン酸のリリースを分析する体内マイクロダイアリシス法について述べる。アスパラギン酸とグルタミン酸の細胞外濃度は、病気のさまざまな段階と相関があります。...

自由行動ラットの脳波記録中に興奮性アミノ酸の透析

電気生理学用に設計されたマイクロインジェクストローデシステムと、オプションの薬物注入による実験プローブ(ナノセンサ、マイクロ電極)の送達を支援します。広く利用可能なマイクロ流体成分は、プローブを含むカニューレに結合される。マイクロインジェクストロード構築のためのステップバイステッププロトコルが含まれており、マカク皮質におけるムスシモール注入中の結果が含まれています。...

複合薬物注入と電気生理学のためのマイクロインジェクストローデシステム

最近の研究では、高等度の小児神経膠腫(pHGG)細胞とそれらの相互相互作用に対する神経細胞の影響を明らかにする。本研究は、イン ビトロ...

グルタミン酸ニューロンと小児の高品位グリオーマ細胞の微小流体デバイスへの共培養による電気的相互作用の評価

イン・ヴィトロ マイクロ有機電変調された電界効果トランジスタアレイによるマルチパラメトリックセルラー解析

このプロトコルは、軸索損傷後のニューロン代謝ダイナミクスをモデル化するマイクロ流体システムを記述し、内因性代謝リモデリングのイメージング、マルチオミクス分析、およびメカニズム研究を可能にします。...

軸索損傷モデル用マイクロ流体チップの構築とマルチオミクス解析の実現

学ぶマイクロ電極アレイとマイクロ流体デバイスの統合技術を用いた神経細胞コミュニケーションと軸索信号伝搬の研究方法。専用ソフトウェアで活動電位を検出・解析し、神経回路の情報伝達メカニズム解明に貢献します。

神経細胞のコミュニケーションと軸索の信号伝搬特性を研究するためマイクロ電極アレイとのインタフェース

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