デザイン、治療、セルラーめっき、機能的に相互接続された回路で構成モジュラー神経回路網の培養表面

この手順の全体的な目標は、空間的に閉じ込められた機能的な相互接続されたニューロン回路からなるin vitroモジュラーネットワークを成長させることです。これは、まず、PDMSステンシルを調製してタンパク質層をパターン化し、培養基質上の細胞接着を促進することによって達成されます。2番目のステップは、培養基質を洗浄することです。

具体的には、ペトリ皿の表面、カバースリップ、多電極アレイです。次に、PDMSステンシルを培養基材上に堆積させ、目的の接着性タンパク質層パターンを作成します。最後のステップは、ニューロングリア細胞のプレーティングです。

最終的に、マルチ電極アレイ記録とカルシウムイメージングを使用して、達成されたモジュラーニューロンネットワークのダイナミクスを示します。この方法は、ニューロンアセンブリ間のコミュニケーションのダイナミクスを調査するなど、神経科学分野の重要な未解決の質問に答えるのに役立ち、実験条件に対抗します。ポリメチルソーンまたはPDMSは、最初に硬化剤1部と塩基剤10部を混合することによって作られます。

5分間混合した後、混合物を真空チャンバーに15分間移動させます。15分後、気泡がないか確認し、溶液をさらに15分間チャンバーに戻します。次に、スピンコーダーでウェーハを準備します。

窒素ガス用のガスノブを開きます。スピナーにウエハーを置き、掃除機で所定の位置に固定します。次に、ウェーハ上にPDMSの薄層を注ぎます。

PDMSでウェーハを1000RPMで1分間回転させ、ウェーハ上に厚さ100ミクロンのPDMSコーティングを作成します。次に、ウェーハを摂氏100度のホットプレートに移します。そこで30分間焼きます。

PDMSが固まったら、ピペットを使用して、より多くのPDMSでステンシルの境界線の輪郭を描きます。次に、追加したPDMSをウェーハに焼きます。前回と同様に、PDMSの境界が硬化したら、境界に沿ってステンシルを切断し、ウェーハからシリコンステンシルをペーしてRINを開始します。

23ミリメートル四方のガラスカバーに蒸留水を入れ、次に70%エタノール、次にアセトン、次にイソプロパノール、最後に蒸留水を入れます。再度、窒素ガスの流れの下で正方形を乾燥させます。次に、1パターンのPDMSステンシルを各カバースリップにそっと押し付けます。

ステンシルと一緒にカバースリップを真空チャンバーに15分間入れます。真空にしたら、1ミリリットルのPDLをステンシルに落とし、アセンブリを真空チャンバーに20分間戻します。20分間の真空サイクルを一度繰り返し、翌日PDLを一晩乾かします。

ネットワーク細胞をサポートするシャーレを準備します。まずは。3.5センチの皿をミリリットルのPDLで2時間覆います。室温で、後でPDLを吸引して皿から取り出します。

次に、蒸留水で皿を洗い、乾かしておきます。皿が乾いたら、カバースリップの四隅に従って皿に少量のシリコーングリースを追加します。PDMSを上に向けてカバースリップを皿に置き、軽く押し下げて取り付けられていることを確認します。

次に、A-P-D-M-Sをカバースリップからそっとピンセットでつまみ出し、PDLパターンを残します。最後に、皿をUVに7分間さらして滅菌します。まず、多電極アレイを水道水で洗浄して洗浄し、次に濃縮酵素界面活性剤で超音波処理します。

これらの手順を 3 回繰り返します。次に、MEAを純粋な蒸留水で3回超音波処理し、その後フードの下で超音波処理します。前にMEAを蒸留水で洗ってください。

UVライトで30分間滅菌します。次に、まずサポートネットワークを準備します。PDMSを12ウェルプレートまたは24ウェルプレートに注ぎます。

PDMSが固まったら、針で取り外します。次に、ディスクの中央に穴を開けてリングを作り、モールドサポートとして機能します。次に、MEAの中央にモールドサポートを配置し、MEAの外部露出面を覆います。

これを部屋で2時間落ち着かせます。次に、PDL洗浄、MEAの外部露出面を蒸留水で吸引し、モールドサポートを取り外してMEAを乾燥させます。次に、準備したマイクロマニピュレーターに倒立顕微鏡でステンシルを取り付けます。

パターン化された構造を検査し、MEAの電極に一致するように位置合わせします。次に、マイクロマニピュレータを使用して、ステンシルをMEA表面に下げます。取り付けたら、マイクロマニピュレーターを持ち上げ、必要に応じてピンセットを使用して少量の圧力を加え、PDMSが外れないようにします。

次に、MEAを真空チャンバーに15分間移します。次に、1ミリリットルのPDLをステンシルに塗布し、真空チャンバーに20分間2サイクル戻ります。翌日、PDLを一晩乾かします。

ピンセットを使用して、PDMSステンシルを測定から取り外します。最後に、測定を7分間UV滅菌します。その後、調製中の細胞の準備ができ、細胞を培養し、テキストプロトコルと同様に懸濁液を調製します。

Resusが必要な数のセルを懸濁した後、MEAまたはカバースリップのパターン化された領域の中央にそれらをプレートします。MEAには、100マイクロリットルの容量とカバースリップを装填する必要があります。1000マイクロリットルを収容します。

プレートセルを40分間インキュベートし、その後、4日ごとにプレーティング培地を添加して細胞を維持します。新鮮なサプリメント成長培地を戻します。6日目または7日目以降、モジュール間のニューロン接続はその時点で形成され始めるはずです。

グリアの異常増殖を防ぐために、培地を抗有糸分裂剤で希釈します。in vitroで4日後、PD DL内に付着したニューロンが14日後に600ミクロン四方のスポットをコードしていることを観察することができます。培養では、ニューロンはモジュール内およびモジュール間で自発的に接続を確立し、アクティブな機能ネットワークを形成しました。

PDMSの特徴サイズを同じにしながら、300ミクロン四方の神経回路を観察した。カルシウムイメージングは、Forexの目的を使用して、培養ネットワークで広く活動するために実施されました。緑とピンクのモジュールの間では、接続の数が多く、青と赤のモジュールが他のモジュールに接続されていないことがわかります。

カルシウムイベントの発生の名簿プロットは、100万ピクセルの画像で30ヘルツで取得した映画について示されています。緑とピンクのモジュールは高度に同期していましたが、青と赤のモジュールはそれほど同期していませんでした。したがって、3つの異なる回路で構成される皮質モジュラーネットワークがin vitroで21日で記録されました。

MEAを使用すると、約600ミクロン離れたニューロン回路が相互接続されていることがわかりました。彼らの電気生理学的活性が再構築されました。正確なタイミング スパイク検出アルゴリズムを使用して、このデータの 5 分間の名簿プロットを色分けされたクラスター データで作成しました。

これにより、ネットワーク全体と 1 つのクラスタのアクティビティの比較が可能になり、クラスタ内の同期に関する洞察が得られます。このビデオを見た後、PDMステンシルを準備し、それらを使用して神経膠細胞の接着をパターン化し、機能的なモーダルネットワークの確立に導く方法についてよく理解できるはずです。