デザイン、治療、セルラーめっき、機能的に相互接続された回路で構成モジュラー神経回路網の培養表面
2015年4月15日
この原稿は、空間的に閉じ込められた、機能的に相互接続された神経回路からなる生体外モジュラーネットワークで成長するプロトコルについて説明します。ポリマーマスクは、培養基材上に細胞接着を促進するために、パターンにタンパク質層が使用される。メッキニューロンは、被覆された領域自発的な接続を確立し、電気生理学的活性を示す上で成長。
この手順の全体的な目標は、空間的に閉じ込められた機能的な相互接続されたニューロン回路からなるin vitroモジュラーネットワークを成長させることです。これは、まず、PDMSステンシルを調製してタンパク質層をパターン化し、培養基質上の細胞接着を促進することによって達成されます。2番目のステップは、培養基質を洗浄することです。
具体的には、ペトリ皿の表面、カバースリップ、多電極アレイです。次に、PDMSステンシルを培養基材上に堆積させ、目的の接着性タンパク質層パターンを作成します。最後のステップは、ニューロングリア細胞のプレーティングです。
最終的に、マルチ電極アレイ記録とカルシウムイメージングを使用して、達成されたモジュラーニューロンネットワークのダイナミクスを示します。この方法は、ニューロンアセンブリ間のコミュニケーションのダイナミクスを調査するなど、神経科学分野の重要な未解決の質問に答えるのに役立ち、実験条件に対抗します。ポリメチルソーンまたはPDMSは、最初に硬化剤1部と塩基剤10部を混合することによって作られます。
5分間混合した後、混合物を真空チャンバーに15分間移動させます。15分後、気泡がないか確認し、溶液をさらに15分間チャンバーに戻します。次に、スピンコーダーでウェーハを準備します。
窒素ガス用のガスノブを開きます。スピナーにウエハーを置き、掃除機で所定の位置に固定します。次に、ウェーハ上にPDMSの薄層を注ぎます。
PDMSでウェーハを1000RPMで1分間回転させ、ウェーハ上に厚さ100ミクロンのPDMSコーティングを作成します。次に、ウェーハを摂氏100度のホットプレートに移します。そこで30分間焼きます。
PDMSが固まったら、ピペットを使用して、より多くのPDMSでステンシルの境界線の輪郭を描きます。次に、追加したPDMSをウェーハに焼きます。前回と同様に、PDMSの境界が硬化したら、境界に沿ってステンシルを切断し、ウェーハからシリコンステンシルをペーしてRINを開始します。
23ミリメートル四方のガラスカバーに蒸留水を入れ、次に70%エタノール、次にアセトン、次にイソプロパノール、最後に蒸留水を入れます。再度、窒素ガスの流れの下で正方形を乾燥させます。次に、1パターンのPDMSステンシルを各カバースリップにそっと押し付けます。
ステンシルと一緒にカバースリップを真空チャンバーに15分間入れます。真空にしたら、1ミリリットルのPDLをステンシルに落とし、アセンブリを真空チャンバーに20分間戻します。20分間の真空サイクルを一度繰り返し、翌日PDLを一晩乾かします。
ネットワーク細胞をサポートするシャーレを準備します。まずは。3.5センチの皿をミリリットルのPDLで2時間覆います。室温で、後でPDLを吸引して皿から取り出します。
次に、蒸留水で皿を洗い、乾かしておきます。皿が乾いたら、カバースリップの四隅に従って皿に少量のシリコーングリースを追加します。PDMSを上に向けてカバースリップを皿に置き、軽く押し下げて取り付けられていることを確認します。
次に、A-P-D-M-Sをカバースリップからそっとピンセットでつまみ出し、PDLパターンを残します。最後に、皿をUVに7分間さらして滅菌します。まず、多電極アレイを水道水で洗浄して洗浄し、次に濃縮酵素界面活性剤で超音波処理します。
これらの手順を 3 回繰り返します。次に、MEAを純粋な蒸留水で3回超音波処理し、その後フードの下で超音波処理します。前にMEAを蒸留水で洗ってください。
UVライトで30分間滅菌します。次に、まずサポートネットワークを準備します。PDMSを12ウェルプレートまたは24ウェルプレートに注ぎます。
PDMSが固まったら、針で取り外します。次に、ディスクの中央に穴を開けてリングを作り、モールドサポートとして機能します。次に、MEAの中央にモールドサポートを配置し、MEAの外部露出面を覆います。
これを部屋で2時間落ち着かせます。次に、PDL洗浄、MEAの外部露出面を蒸留水で吸引し、モールドサポートを取り外してMEAを乾燥させます。次に、準備したマイクロマニピュレーターに倒立顕微鏡でステンシルを取り付けます。
パターン化された構造を検査し、MEAの電極に一致するように位置合わせします。次に、マイクロマニピュレータを使用して、ステンシルをMEA表面に下げます。取り付けたら、マイクロマニピュレーターを持ち上げ、必要に応じてピンセットを使用して少量の圧力を加え、PDMSが外れないようにします。
次に、MEAを真空チャンバーに15分間移します。次に、1ミリリットルのPDLをステンシルに塗布し、真空チャンバーに20分間2サイクル戻ります。翌日、PDLを一晩乾かします。
ピンセットを使用して、PDMSステンシルを測定から取り外します。最後に、測定を7分間UV滅菌します。その後、調製中の細胞の準備ができ、細胞を培養し、テキストプロトコルと同様に懸濁液を調製します。
Resusが必要な数のセルを懸濁した後、MEAまたはカバースリップのパターン化された領域の中央にそれらをプレートします。MEAには、100マイクロリットルの容量とカバースリップを装填する必要があります。1000マイクロリットルを収容します。
プレートセルを40分間インキュベートし、その後、4日ごとにプレーティング培地を添加して細胞を維持します。新鮮なサプリメント成長培地を戻します。6日目または7日目以降、モジュール間のニューロン接続はその時点で形成され始めるはずです。
グリアの異常増殖を防ぐために、培地を抗有糸分裂剤で希釈します。in vitroで4日後、PD DL内に付着したニューロンが14日後に600ミクロン四方のスポットをコードしていることを観察することができます。培養では、ニューロンはモジュール内およびモジュール間で自発的に接続を確立し、アクティブな機能ネットワークを形成しました。
PDMSの特徴サイズを同じにしながら、300ミクロン四方の神経回路を観察した。カルシウムイメージングは、Forexの目的を使用して、培養ネットワークで広く活動するために実施されました。緑とピンクのモジュールの間では、接続の数が多く、青と赤のモジュールが他のモジュールに接続されていないことがわかります。
カルシウムイベントの発生の名簿プロットは、100万ピクセルの画像で30ヘルツで取得した映画について示されています。緑とピンクのモジュールは高度に同期していましたが、青と赤のモジュールはそれほど同期していませんでした。したがって、3つの異なる回路で構成される皮質モジュラーネットワークがin vitroで21日で記録されました。
MEAを使用すると、約600ミクロン離れたニューロン回路が相互接続されていることがわかりました。彼らの電気生理学的活性が再構築されました。正確なタイミング スパイク検出アルゴリズムを使用して、このデータの 5 分間の名簿プロットを色分けされたクラスター データで作成しました。
これにより、ネットワーク全体と 1 つのクラスタのアクティビティの比較が可能になり、クラスタ内の同期に関する洞察が得られます。このビデオを見た後、PDMステンシルを準備し、それらを使用して神経膠細胞の接着をパターン化し、機能的なモーダルネットワークの確立に導く方法についてよく理解できるはずです。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本稿では、空間的に限定され、機能的に相互接続された神経回路からなるモジュラーネットワークをin vitroで構築するためのプロトコルについて記述します。これは、培養基板上に細胞接着を促進するタンパク質層をパターニングするためのPDMSステンシルを作製することで達成されます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 電気生理学
背景
- in vitroの神経ネットワークは、神経接続を研究するために不可欠です。
- 神経回路を空間的に制限することで、機能的な相互接続性を高めることができます。
- 細胞接着は、神経細胞が正常に成長するために極めて重要です。
- 細胞培養のパターニングには、一般的にPDMSステンシルが使用されます。
研究目的
- in vitroでモジュール式ニューロンネットワークを構築する方法を開発すること。
- これらのネットワークの電気生理学的特性を調査すること。
- 播種したニューロン間に自発的な接続を確立すること。
使用した手法
- タンパク質パターニング用PDMSステンシルの作製。
- ペトリ皿やカバーガラスなどの培養基材の洗浄。
- 基材へのPDMSステンシルの配置による接着パターンの形成。
- パターニング済み基材への神経グリア細胞の播種。
主な結果
- 空間的に限定された神経回路の構築に成功。
- ニューロン間の自発的な接続を確認。
- 培養ネットワークにおける電気生理学的活性を観察。
- 神経接続に関する今後の研究に向けたプロトコルの妥当性を検証。
結論
- このプロトコルにより、in vitroでモジュール状の神経ネットワークを効果的に構築できます。
- 空間的制限により、機能的な相互接続性が向上します。
- この手法は、今後の電気生理学的研究に活用可能です。
よくある質問
産業界への適用性と重要性
このin vitroモジュール式神経ネットワーク手法により、神経細胞アセンブリの精密な空間制御が可能となり、神経科学の創薬におけるターゲットバリデーションにおけるメカニズム的なリスク低減がサポートされます。定量可能な電気生理学的およびカルシウムイメージングのリードアウトを備えた機能的に相互接続された回路を構築することで、本アプローチは神経接続性アッセイにおいて予測的な信頼性を提供します。これにより、ネットワークの同期性と通信に対する化合物の影響を評価するための脳回路ダイナミクスのモデル化という、探索段階における主要な課題が解決されます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲット検証
- 科学的価値：コンパートメント間の距離を調節することでモジュール間の同期を制御し、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：自発的な神経回路の形成および機能的ネットワークの構築を通じて、ターゲットエンゲージメントを評価するための疾患関連システムを提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：マルチ電極アレイ記録とカルシウムイメージングを用いて定量的依存変数の測定を行い、ネットワーク活動のダイナミクスを評価する。
- 運用的価値：再現性のあるPDMSステンシルパターニングとタンパク質層の堆積により、一貫した細胞接着を実現し、アッセイの標準化を支援する。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- 科学的価値：結合密度と同期発生を相関させることで、トランスレーショナルなバイオマーカーの整合性を提供し、リスクを調整した進展上の意思決定を可能にします。
- 運用の価値：in vitroで6～7日後に形成される神経接続の観察と、14日目までの安定化を可能にすることで、前臨床モデルの連続性を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ニューロン間通信ダイナミクスの仮説検証を可能にすることで初期の創薬ワークフローに統合され、ネットワーク活性プロファイリングを通じて得られた結果からリード化合物の同定に直接的な知見を提供します。
- 探索生物学： モジュール状ネットワークにおける接続密度がモジュール間の同期をどのように制御するかを制御下で調査することを可能にし、パスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 標準化された表面処理および細胞播種プロトコルを通じて、PDLパターニング領域への再現性のあるニューロン付着を保証し、アッセイの準備を整えます。
- 分析： 電気生理学的なスパイク検出およびカルシウムイベントの開始測定を提供し、異なる実験条件下でのクラスター内およびクラスター間の同期性の定量的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 生体内の回路通信原理を反映した自発的な機能的ネットワーク形成を実証することで、前臨床検証へとつなげます。
- エンタープライズ再利用： 基材（カバーガラス、MEA）をまたいでニューロンネットワークをパターニングする再利用可能な能力を確立し、反復的なスクリーニングキャンペーンおよびターゲット検証研究を支援します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：構造的トポロジーが機能的結合にどのように影響するかを研究するための制御可能なシステムを提供することで、神経標的のバリデーションにおけるメカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用の価値：真空補助PDLコーティングとUV滅菌ステップにより、実験全体で一貫した表面調製を保証し、再現性を向上させます。
- 戦略的価値：ネットワーク同期に対する化合物の用量反応試験を可能にし、CNS創薬における後期段階の生物学的リスクを低減することで、Go/No-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：結合依存的な同期閾値を定量化し、神経標的のメカニズム的なリスク低減に情報を与えることで、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の留意点
- マイクロ流体ステンシルの作製、神経細胞培養、および電気生理学的・光学的な記録技術に関する専門知識が必要です。
- スピンコーター、真空チャンバー、UV滅菌器、マルチ電極アレイ（MEA）、およびカルシウムイメージングシステムの利用が必須となります。
- 研究室間での再現性を確保するため、ステンシル設計、タンパク質コーティングプロトコル、および播種密度に関するチーム間での標準化が必要です。
- ネットワークの安定性を維持し過剰成長を防ぐため、異なる神経細胞サブタイプやグリア細胞との共培養比率に応じた適応上の検討が含まれます。
- MEA電極に対する正確なステンシルのアライメントの必要性や、回路寸法（例：300 micron 四方のモジュール）を決定するPDMSの構造サイズへの依存など、実用上の制限があります。
