Name: 化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 学ぶ3D PDMSデバイスを用いた化学誘引物質勾配におけるマルチセル応答解析法。オルガノイドを使用して弱いシグナルを検出し、細胞応答を定量的に評価する手法を解説します。

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この作業は、AJE (NSF PD-11-7246、乳癌研究財団 (BCRF-17-048)、および NCI U54 CA210173) および AL (U54CA209992) への補助金によって支持された。

すべての動物の仕事は、機関の動物のケアと使用委員会、ジョンズ・ホプキンス大学、医学部によって見直され、承認議定書に従って実施しました。
1. mesofluidic 装置の製作
<ol><li>3D CAD ソフトウェアを使用して PDMS デバイス用の金型のマスクを設計します。</li>
	<li>耐熱樹脂の立体造形装置を使用して金型を印刷します。 注: ここで説明する手順は、市販の3D 印刷サービスによって実行されました。</li>
	<li>10:1 の比率で硬化剤と PDMS モノマー溶液を徹底的に混合します。3 mL の PDMS 混合物は、装置の製造のために必要とされた。総容積は製造されるべき型の数によって決まる。</li>
	<li>社内の実験室の真空または真空ポンプを真空デシケーターで1時間使用して真空をかけることで、混合物を脱気する。</li>
	<li>粘着テープでモールドの表面を軽くし、ほこりを取り除き、PDMS 混合物を鋳型に注ぎます。プロセス中に気泡が導入された場合、真空デシケーター内で脱気を繰り返す。金型の柱の間に閉じ込められた気泡は、鋭い針でそれらを刺すことによって除去することができます。 注: 室温での脱気プロセスは、1時間以内に行う必要があります。</li>
	<li>2時間80° c で加熱して PDMS を硬化させる。金型を室温で冷却できるようにします。</li>
	<li>刃で金型と PDMS の境界を切り、型から PDMS を注意深く剥がします。</li>
	<li>22 mm x 22 mm のカバースリップにフィットし、インレットに穴を開けるように PDMS 部品をトリムします。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	<li>カバースリップの低い組織と 70% のエタノールで表面を拭くことにより、PDMS 部品と 22 mm x 22 mm のクリーニングを行います。その後、粘着テープで dabbing して大きなダスト粒子を除去します。</li>
	<li>カバースリップを滅菌し、オートクレーブ (121 ° c、濡れた8分間、15分間乾燥) または1時間の UV 光への曝露によって、PDMS 部品を殺菌します。</li>
	<li>PDMS 部品の底面とカバースリップをコロナ放電ガンで、ティッシュカルチャーフードで5分間処理し、それらを一緒に結合します。 注意: 底にポリスチレンフォームなどの非導電材を置き、このプロセス中にすべての導電材を除去します。コラーゲンを、5分以内に、コラーゲンゲルとガラスカバースリップ間の結合を増加させる処置の後、すぐに装置に注入してください。</li>
</ol>2. 細胞の準備: 第一次乳腺オルガノイドの分離
注: 乳腺オルガノイド分離の詳細は、前の作業11で見つけることができます。任意の種類の単一の細胞またはオルガノイドは、独自の分離/剥離プロトコルに従って調製することができます。
<ol><li>マウスの乳腺組織をメスでミンチさせると、組織が弛緩して、37° c で30分、50 mL のコラゲナーゼ/トリプシン溶液 (マウスあたり 10ml) にデメ/F12 で 0.1 g のトリプシンを添加し、0.1 g のコラゲナーゼ、5 mL の FBS、250μ l の1μ g/mL インスリン、50μ l の50μ g/mL ゲンタマイシンを投与します。</li>
	<li>コラゲナーゼ/トリプシン溶液を10分間 1250 x gで遠心分離する。吸引によって上澄みを取り除く。10 mL の DMEM/F12 に細胞を分散させ、10分間 1250 x gで遠心分離する。吸引によって DMEM/F12 を除去した後、4 mL の DMEM/F12 で細胞を再懸濁し、40μ l の DNase (2 単位/μ l) を補充した。</li>
	<li>2-5 分の手で DNase 溶液を振り、その後10分間 1250 x gで遠心分離します。</li>
	<li>1つの細胞から4つの差動 centrifugations (1250 x gにパルスし、それが意図された速度に達した後に遠心分離機 3-4 s を停止する) を通してオルガノイドを分離します。各パルス間で、上清を吸引し、10ml の DMEM/F12 でペレットを再懸濁する。</li>
	<li>1% のペニシリン/ストレプトマイシン、およびコラーゲン調製のための 1% インスリン-トランスフェリン-セレン-X を用いて、所望の量の DMEM/F12 の成長培地中で最終ペレットを再懸濁させる。</li>
</ol>3. コラーゲンの調製と注入
注: 他のタイプの ECM ゲルは、独自のゲル化プロトコルに従って調製することができます。
<ol><li>コラーゲンタイプ I 溶液 (3.78 mg/mL)、10倍 DMEM、1 N NaOH 溶液、氷上の正常成長培地を調製する。 注: 手順が完了するまで氷の上に保管してください。</li>
	<li>6μ l の 1 N NaOH 溶液、200μ l の成長培地および50μ l の 2, マイクロ遠心をあらかじめ冷却されたチューブに加え、溶液を完全に混合する。</li>
	<li>425μ l のコラーゲンをあらかじめ混合した溶液に添加し、ピペットでよく混ぜる。</li>
	<li>コラーゲン混合物を短時間 (5 秒未満) 遠心分離し、混合物から気泡を除去します。</li>
	<li>中和したコラーゲン溶液を氷上で1時間保持し、繊維形成を誘導します。</li>
	<li>コラーゲン混合物に50μ l の細胞懸濁液を加え、よく混ぜる。 注: 最終的なコラーゲン濃度は 2mg/mL です。</li>
	<li>全体のチャンバが充填されるまで、PDMS 装置の入口を介して200μ l pipet を使用して溶液を注入する。コラーゲンの混合物が柱の隙間をオーバーフローした場合、過剰なコラーゲンゲルをゲル化後に鋭い外科用ブレードで切り出します。</li>
	<li>5% の CO2 で37° c のインキュベーター内のデバイスを1時間、ゲル化を誘発させます。</li>
	<li>成長培地で両側の貯水池を満たし、共焦点イメージングが実行されるまで、5% の CO2 で37° c のインキュベーター内のデバイスを維持します。</li>
</ol>4. 3D イメージングと定量化
<ol><li>生細胞イメージング培養室を共焦点顕微鏡に設置し、温度と CO2 をそれぞれ37° c、5% に事前設定します。湿度を上げるには、チャンバの貯留部に水を加え、必要に応じて濡れたワイプをチャンバ内に置きます。</li>
	<li>PDMS 装置をチャンバ内に置き、グラジエント形成中の EGF の「ソース」として EGF を1つのリザーバに加える。もう1つのリザーバは、空間的にグレーディングされた EGF 分布の開発に必要な「シンク」を提供します。この研究では 0.5 nM/mm の勾配を作るために、シンクに 2.5 nM の EGF を添加しました。</li>
	<li>目的のオルガノイドのボリュームをカバーする Z スタックの範囲を設定し、イメージングを開始します。 注意: 光毒性を避けるために、共焦点イメージングではより低いレーザー強度を試すか、マルチフォトンイメージング技術を使用してください。</li>
	<li>商用ソフトウェアまたはカスタムメイドのプログラムを使用して、2D イメージスタックから3D イメージを再構築します。オルガノイドから伸びる枝の長さと角度、および個々の細胞の移動を測定します。ここでは、ImageJ を使ってオルガノイドボディの周りにフリーハンドで輪郭を描くことで定量化を行います。</li>
</ol>

<ol><li>Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+extracellular+matrix+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).</li>
<li>Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+emerging+paradigms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins: emerging paradigms of signal transduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Stem+Cell+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering Stem Cell Organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li>
<li>Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+3D+matrix+microenvironment+regulates+cell+migration+through+spatiotemporal+dynamics+of+contractility-dependent+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions.</a> Nature Communications. 6, 8720(2015).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry+%28Palo+Alto%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li>
<li>Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluidic+device+to+study+directional+angiogenesis+in+complex+tissue+and+organ+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models.</a> Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+lapse+investigation+of+antibiotic+susceptibility+using+a+microfluidic+linear+gradient+3D+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).</li>
<li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li>
</ol>

作者は何も開示することはありません。

PDMS 金型の製作は、市販の3D プリンティングサービスを使用して行われましたが、自社内のハイエンド3D プリンタでも実現できます。様々な3D 加工方法の中で、高解像度のモールド生成には立体造形が推奨されます。PDMS 硬化は、高温 (80 ° c) で発生するため、材料は、印刷が外部委託されている場合は、明示的に指定する必要があり、十分に熱耐性でなければなりません。サーマルポストキュアは、印刷サービス会社と話し合い、部品の熱抵抗を高めることができます。印刷サービスおよび材料の詳細は、資料の表に記載されています。
硬化 PDMS の機械的性質は、硬化温度に依存します。PDMS 混合物がオーブンで硬化する前に長い時間室温で保たれている場合、それは完全な硬化後にも弾性になります。したがって、室温での脱気プロセスは、1時間以内に行われるべきである。脱気は PDMS 内の任意のマイクロバブルを除去することができます真空の環状アプリケーションを指します。
コラーゲン溶液の pH は、ゲル化だけでなく、...

生理的環境においては、細胞はセル外マトリックス (ECM) に埋め込まれ、大量の生体分子に曝露される。細胞と周囲の微小環境との相互作用は、遊走、成長、分化および生存を含む多様な表現型を制御する細胞内プロセスを調節する1,2.従来の2D 細胞培養において細胞の挙動について多くのことが学ばれてきた。しかしながら、3D ヒドロゲルに埋め込まれた細胞を用いた生体画像化および実験の出現により、細胞挙動における重要な相違は、3D 組織様環境と比較して単純化された 2D in vitro 培養で認められるようになった。細胞は ECM 繊維と相互作用し、3D マトリックス内でその機械的特性を感知しますが、ゲルの材料剛性は、2D in vitro システムでは完全に独立した変数ではありません。次元は焦点の付着の形成を変え、異なった細胞形態および行動をもたらす。さらに、2D サーフェス上のセルは、3D のすべての方向に開いているセルよりも少ないシグナリングキューにさらされます。
これらの制限は、生体組織の空間的および化学的複雑性を表す3D システムの関心を高め、インビボ組織機能をよりよく予測する。彼らは、ECM3,4にランダムに散在する細胞への自己組織化細胞微細構造として、オルガノイドから多くの形で開発されています。微細加工技術の最近の進歩は、表現型の変化を研究するための様々なタイプの3d 培養システム5、6、7、8、9の出現を促進し、可溶性信号への細胞応答;しかし、技術的な障壁は、研究室での普及を制限します。多くの場合、製造プロセスは、軟リソグラフィのためのフォトリソグラフィー技術と背景知識を必要とします。さらに、デバイスを正常に構築し、デバイスの最適な機能を長期間にわたって実現するには、さまざまな要因を制御する必要があります。
我々の方法は、定義された化学誘引物質勾配を有する3D 微小環境に細胞および多細胞オルガノイドを組み込み、その後、EGF10に対する上皮応答を分析するための 3d PDMS 装置を構築する方法を記述する。我々のデータは、浅い EGF 勾配に応答するオルガノイドの能力が、ギャップ結合を介した細胞間化学的カップリングから生じることを明らかにしている。それは弱く、騒々しい空間的に等級付けられた入力のより精密な検出のためのオルガノイドの潜在性を示す。製造工程はクリーンルーム設備やフォトリソグラフィー技術を必要としません。しかし、3D PDMS デバイスには、3D 生理学的環境の必要な要素が含まれています。この方法は、3D 細胞の挙動を研究するのに役立ち、異なる細胞タイプ、chemoattractants、および ECM の組み合わせによる優れた研究の可能性を秘めています。

<table><tbody><tr><td>22mm x 22mmカバースリップ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン I、ラット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>CB-40236</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL マルチフィジックス 4.2</td><td>COMSOL Inc</td><td></td><td>拡散ダイナミクスのシミュレーションに使用</td></tr><tr><td>10x DMEM</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>DEME/F12</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4623</td><td></td></tr><tr><td>EGF 組換えマウスタンパク質</td><td>サーモフィッシャー</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td></td><td></td><td>分岐の長さと角度の測定に使用</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>5750-060</td><td></td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>ビットプレーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン-X</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>低糸くずの組織</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>Kimtech ワイプ</td><td></td></tr><tr><td>金型材料</td><td>Proto labs</td><td>Accura SL5530&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>金型印刷装置</td><td>Proto labs</td><td>Stereolithogrphy</td><td>最大寸法:127mm x 127mm x 63.5mm、層のスニックネス:0.0254mm</td></tr><tr><td>金型印刷サービス</td><td>Proto labs</td><td>カスタム</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.protolabs.com/ NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>VWR</td><td>16777-164P</td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスク共焦点顕微鏡</td><td>Solamere Technology Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>184 SIL ELAST KIT&nbsp;</td><td>PDMSキット</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935</td><td></td></tr></tbody></table>

化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3d 解析

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

2D 細胞培養システムの様々な制限は、3D 細胞培養および分析プラットフォームに対する関心を呼び起こし、生体組織の空間的および化学的複雑性を模倣し、インビボ組織機能を模倣する。微細加工技術の最近の進歩は、細胞が十分に定義された細胞外マトリックス (ECM) および可溶性またはマトリックス関連の生体分子の定義されたセットに統合することができるインビトロ環境における3D の開発を促進した。しかし、技術の壁は、研究室での普及を制限している。ここでは、化学誘引物質勾配を定義した3D 微小環境において、細胞や多細胞オルガノイドを用いて3D 培養や実験のための簡単な装置を構築する方法について述べる。我々は、上皮細胞の応答の分析のためのこのプラットフォームの使用を説明し、上皮増殖因子 (EGF) などの成長因子の勾配にオルガノイドします。EGF の勾配は、乳房オルガノイドにおける分岐形成を誘導する数日間の装置において安定であった。この分析により、セルのグループによる集合的な勾配検出は、単一のセルよりも敏感であると結論づけることができました。また、リソグラフィー設備や高度なソフトリソグラフィ技術を必要としない製造方法についても述べる。この方法は、癌を含む開発と病理学的状態の分析の文脈で3D 細胞の挙動を研究するのに役立ちます。

EGF は、乳腺の形態形成を分岐させ、浸潤性の癌増殖における乳房上皮細胞の遊走を誘導する重要な化学誘引物質である。我々は、上述したメゾスコピック流体デバイスを用いて、EGF の勾配を定義した細胞の応答を研究した (図 1a、B)10。このデバイスは、幅 5 mm、長さ 10 mm、高さ 1 mm の培養エリアを生成します。培養領域の側面は、表面張力を介して細胞培養領域内の液体 ECM および細胞混合物を捕捉するために使用される六角形の柱によって開井戸から分離される。我々は、この3D 培養のサイズを考えると、非常に困難であり、高価であり、フォトリソグラフィー10によって適切なサイズの金型を構築するのに時間がかかることに留意する。標準的な技術の新しい適用を使用することによって、光造形、我々は迅速かつ安価に金型を生産します。さらに、設計を修正することによって、指数の勾配 (<strong c...

我々は、細胞および多細胞オルガノイドを用いて3D 培養および実験のためのデバイスを構築する方法について述べる。この装置は定義された化学誘引物質の勾配の3D 微小環境の可溶性信号への細胞応答の分析を可能にする。オルガノイドは、弱いノイズの入力の検出で単一のセルよりも優れています。

化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

単純な2Dインビトロ培養と3D組織のような環境の違いは、生きている組織の空間的および化学的複雑さを表す3Dシステムへの関心を高めています。製造プロセスは、施設やフォトリソグラフィ技術を必要としません。しかし、3D PDMS装置は、3D生理学的環境用途に必要なベクトルを含む。中流体デバイスの準備のために、適切な三次元コンピュータ支援設計ソフトウェアプログラムを使用して、ポリジメチルシロキサンまたはPDMSデバイス用の金型のマスクを設計し、耐熱性樹脂を備えたステレオリソグラフィー装置を使用して金型を印刷します。金型の準備ができたら、10対1の比率で硬化剤を用いて金型あたり3ミリリットルのPDMSモノマー溶液を約混合し、真空乾燥剤で混合物を1時間脱気します。乾燥の終わりには、粘着テープを使用して金型表面からほこりを取り除き、鋳型を脱気PDMS溶液で丁寧に充填します。次に、PDMSを摂氏80度で2時間硬化させてから、金型を室温で冷却します。金型をタッチに冷却する場合は、ブレードを使用して金型とPDMSの境界を切断し、PDMSを金型から丁寧に剥離します。PDMSを22 x 22ミリのカバースリップに収めるためにトリミングし、入口に穴を開けます。低い糸くず組織と70%エタノールを使用して、デバイスを拭き取り、カバースリップし、大きなほこり粒子を除去するために新しい粘着テープでデバイスをダブ。その後、PDMSデバイスをオートクレーブし、8分間濡れ、15分間乾燥して121°Cでカバースリップし、PDMS部分の底面を治療し、コロナ放電ガンで覆い物を組織培養フードで5分間処理してから、ピースを一緒に接着します。デバイスをロードするには、まず1%ペニシリンとストレプトマイシンと1%インスリントランスフェリンセレン-xを補充増殖培地の適切な量で目的の細胞を再中断します。次に、乳腺細胞懸濁液の50マイクロリットルを425マイクロリットルの作製した中和コラーゲン溶液と混合し、200マイクロリットルのピペットにコラーゲン細胞懸濁液を充填する。チャンバー全体が満杯になるまでPDMSデバイスに懸濁液を注入し、デバイスを摂氏37度で5%の二酸化炭素で1時間インキュベーターに入れ、両側のリザーバーに成長培地を充填し、共焦点イメージングまでインキュベーターに戻します。3Dイメージングと定量化の場合は、共焦点顕微鏡に生きた細胞イメージング培養チャンバーを設置し、温度と二酸化炭素をそれぞれ摂氏37度と5%に事前に設定します。イメージングチャンバーに水を加え、チャンバーに湿った拭き取りを加え、必要に応じてチャンバーに入れ、PDMSデバイスをチャンバーに入れます。傾斜形成の要因の源として、一方の貯水池に表皮成長因子を加え、他の貯水池を残して、空間的に等級表皮成長因子分布の開発のためのシンクとして機能する。次に、目的のオルガノイドの体積をカバーするZスタックの範囲を設定し、イメージングを開始します。実験の最後に、適切な画像解析プログラムを使用して、オルガノイドから伸びる枝の長さと角度、または個々の細胞の移動を測定します。インシリコとインビトロの両方のテストでは、ソースまたはシンクリザーバの補充なしに約2日間持続する細胞培養領域全体に安定した線形上皮成長因子勾配の形成が明らかになっており、表皮成長因子である6.4キロダルトンタンパク質は、比較的短期間に実証されたコラーゲンゲル内に安定な拡散ベースの勾配を形成できることを示唆した。乳腺オルガノイドは、1ミリリットル当たり0.5ナノモルを有する線形勾配に表皮成長因子を添加した場合、3日間にわたって方向性バイアスのない空間的に均一な2.5ナノモル表皮成長因子の存在下で複数の枝を形成する。ただし、分岐形成は有意な方向バイアスを表示します。注意すべきは、ギャップ接合抑制剤の添加は、オルガノイドが勾配に応答する能力を抑制する。コラーゲン溶液のpHは、ゲル化および細胞生存率にとって重要である。混合する前にコラーゲンを中和しないと、細胞の生存率が低くなります。この方法は、より現実的な組織モデリングに対応するために拡張することができ、ゲル内の個々の細胞からの血管ネットワーク形成に対応することができます。

3d-analysis-of-multi-cellular-responses-to-chemoattractant-gradients

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ここで我々 は急性の機械的刺激に対する細胞応答を評価するための方法を説明します。顕微鏡ベースのアッセイでは、蛍光標識したバイオ センサー シアー流を含む簡単な刺激の局在を調べる。我々 はまた、生化学的急性の機械的刺激に対する応答の興味の様々...

キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

発達における集団細胞移動、創傷治癒、癌転移は、多くの場合、成長因子またはシグナル伝達分子の勾配によって導かれる。ここでは、トラクション顕微鏡とマイクロ流体システムを組み合わせた実験システムと、生化学的勾配下での集団移動の仕組みを定量化する方法のデモンストレーションを行います。...

化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡

学ぶ3D PDMSデバイスを用いた化学誘引物質勾配におけるマルチセル応答解析法。オルガノイドを使用して弱いシグナルを検出し、細胞応答を定量的に評価する手法を解説します。

化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

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