化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析
May 24th, 2019
我々は、細胞および多細胞オルガノイドを用いて3D 培養および実験のためのデバイスを構築する方法について述べる。この装置は定義された化学誘引物質の勾配の3D 微小環境の可溶性信号への細胞応答の分析を可能にする。オルガノイドは、弱いノイズの入力の検出で単一のセルよりも優れています。
単純な2Dインビトロ培養と3D組織のような環境の違いは、生きている組織の空間的および化学的複雑さを表す3Dシステムへの関心を高めています。製造プロセスは、施設やフォトリソグラフィ技術を必要としません。しかし、3D PDMS装置は、3D生理学的環境用途に必要なベクトルを含む。
中流体デバイスの準備のために、適切な三次元コンピュータ支援設計ソフトウェアプログラムを使用して、ポリジメチルシロキサンまたはPDMSデバイス用の金型のマスクを設計し、耐熱性樹脂を備えたステレオリソグラフィー装置を使用して金型を印刷します。金型の準備ができたら、10対1の比率で硬化剤を用いて金型あたり3ミリリットルのPDMSモノマー溶液を約混合し、真空乾燥剤で混合物を1時間脱気します。乾燥の終わりには、粘着テープを使用して金型表面からほこりを取り除き、鋳型を脱気PDMS溶液で丁寧に充填します。
次に、PDMSを摂氏80度で2時間硬化させてから、金型を室温で冷却します。金型をタッチに冷却する場合は、ブレードを使用して金型とPDMSの境界を切断し、PDMSを金型から丁寧に剥離します。PDMSを22 x 22ミリのカバースリップに収めるためにトリミングし、入口に穴を開けます。
低い糸くず組織と70%エタノールを使用して、デバイスを拭き取り、カバースリップし、大きなほこり粒子を除去するために新しい粘着テープでデバイスをダブ。その後、PDMSデバイスをオートクレーブし、8分間濡れ、15分間乾燥して121°Cでカバースリップし、PDMS部分の底面を治療し、コロナ放電ガンで覆い物を組織培養フードで5分間処理してから、ピースを一緒に接着します。デバイスをロードするには、まず1%ペニシリンとストレプトマイシンと1%インスリントランスフェリンセレン-xを補充増殖培地の適切な量で目的の細胞を再中断します。
次に、乳腺細胞懸濁液の50マイクロリットルを425マイクロリットルの作製した中和コラーゲン溶液と混合し、200マイクロリットルのピペットにコラーゲン細胞懸濁液を充填する。チャンバー全体が満杯になるまでPDMSデバイスに懸濁液を注入し、デバイスを摂氏37度で5%の二酸化炭素で1時間インキュベーターに入れ、両側のリザーバーに成長培地を充填し、共焦点イメージングまでインキュベーターに戻します。3Dイメージングと定量化の場合は、共焦点顕微鏡に生きた細胞イメージング培養チャンバーを設置し、温度と二酸化炭素をそれぞれ摂氏37度と5%に事前に設定します。
イメージングチャンバーに水を加え、チャンバーに湿った拭き取りを加え、必要に応じてチャンバーに入れ、PDMSデバイスをチャンバーに入れます。傾斜形成の要因の源として、一方の貯水池に表皮成長因子を加え、他の貯水池を残して、空間的に等級表皮成長因子分布の開発のためのシンクとして機能する。次に、目的のオルガノイドの体積をカバーするZスタックの範囲を設定し、イメージングを開始します。
実験の最後に、適切な画像解析プログラムを使用して、オルガノイドから伸びる枝の長さと角度、または個々の細胞の移動を測定します。インシリコとインビトロの両方のテストでは、ソースまたはシンクリザーバの補充なしに約2日間持続する細胞培養領域全体に安定した線形上皮成長因子勾配の形成が明らかになっており、表皮成長因子である6.4キロダルトンタンパク質は、比較的短期間に実証されたコラーゲンゲル内に安定な拡散ベースの勾配を形成できることを示唆した。乳腺オルガノイドは、1ミリリットル当たり0.5ナノモルを有する線形勾配に表皮成長因子を添加した場合、3日間にわたって方向性バイアスのない空間的に均一な2.5ナノモル表皮成長因子の存在下で複数の枝を形成する。
ただし、分岐形成は有意な方向バイアスを表示します。注意すべきは、ギャップ接合抑制剤の添加は、オルガノイドが勾配に応答する能力を抑制する。コラーゲン溶液のpHは、ゲル化および細胞生存率にとって重要である。
混合する前にコラーゲンを中和しないと、細胞の生存率が低くなります。この方法は、より現実的な組織モデリングに対応するために拡張することができ、ゲル内の個々の細胞からの血管ネットワーク形成に対応することができます。
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概要
この記事では、細胞や多細胞オルガノイドの3D培養と実験を促進するデバイスの構築方法について説明します。このデバイスは、定義されたケモアトラクタント勾配を特徴とする3Dマイクロ環境における細胞の溶解性シグナルへの応答の分析を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 3D細胞培養
背景
- 2Dのin vitro培養は、生体組織の空間的および化学的複雑さを欠いています。
- 3Dシステムは、in vivo環境をより良く模倣する能力により注目を集めています。
- 3Dデバイスの製作プロセスには特殊な施設は必要ありません。
- PDMSデバイスは生理的環境の応用に適しています。
研究の目的
- 3D培養デバイスを作成する手法を開発すること。
- 制御された3D環境における細胞応答を分析すること。
- 弱いシグナルを検出する際のオルガノイドの単一細胞に対する利点を実証すること。
使用された方法
- 型の設計に3D CADソフトウェアの利用。
- 耐熱性樹脂を使用したステレオリソグラフィーによる型の印刷。
- PDMSモノマー溶液と硬化剤の混合。
- 真空乾燥機での混合物の脱気。
主要な結果
- 3D PDMSデバイスは細胞応答の効果的な分析を可能にします。
- 定義されたケモアトラクタント勾配は細胞挙動の研究を強化します。
- オルガノイドは単一細胞と比較して優れた検出能力を示します。
結論
- 開発された手法は3D細胞培養のための堅牢なプラットフォームを提供します。
- このアプローチは環境シグナルに対する細胞応答の研究を進展させることができます。
- 3Dオルガノイドは複雑な生物学的相互作用を研究するための有望なツールです。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables 3D analysis of cellular responses to chemoattractant gradients, addressing a key limitation of 2D models in capturing tissue-level complexity. By supporting stable gradient formation and collective cell sensing, it improves predictive confidence in early target validation and mechanistic de-risking. The platform supports scalable, reproducible assays for screening and translational research in oncology and developmental biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through collective gradient sensing in multicellular systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking by demonstrating enhanced sensitivity of organoids vs. single cells in detecting weak chemotactic signals.
- Predictive Value: Improves target confidence by modeling microenvironmental cues relevant to tumor invasion and branching morphogenesis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized 3D microenvironment for quantitative assessment of cellular responses to soluble factors like EGF.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through stable, diffusion-based gradients lasting up to two days without replenishment.
- Scalability: Facilitates platform reuse across cell types and organoid models for consistent compound or ligand screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models disease-relevant 3D cellular behaviors, including directed branch formation in breast organoids, relevant to cancer invasion.
- Preclinical Model Relevance: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking chemotactic response to multicellular coordination and gap junction-dependent signaling.
- Biomarker Alignment: Enables study of emergent tissue-level phenotypes that may serve as translational biomarkers of collective cell responsiveness.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical modeling, particularly for pathways involving chemotaxis and collective cell migration.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled exposure to defined chemoattractant gradients in 3D.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs such as branch length and angle, enabling comparison of cellular responses across conditions.
- Analytics: Generates measurable, spatially resolved readouts (e.g., migration angle, branch formation) that support statistical comparison and hit selection.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation by modeling 3D tissue-like responses to growth factors in organoid systems.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for studying 3D cellular behaviors across multiple projects in development and pathology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by revealing collective gradient sensing mechanisms obscured in 2D culture.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fabrication and stable gradient formation without specialized lithography.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in chemotaxis-dependent pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated 3D phenotypic responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D CAD design, stereolithography, and PDMS handling for device fabrication.
- Depends on access to confocal microscopy and image analysis tools for 3D quantification of branching and migration.
- Necessitates standardization of collagen neutralization and gelation protocols to ensure consistency and cell viability.
- Involves adaptation considerations when extending the method to different cell types, organoid models, or soluble factors beyond EGF.
- Includes practical limitations such as the need for environmental control (37°C, 5% CO₂) and careful reservoir management to maintain gradient stability.
