Name: 反復性びまん性外傷性脳損傷のマウスモデルにおける心的外傷後てんかんの誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学ぶ反復性びまん性外傷性脳損傷マウスモデルにおける心的外傷後てんかんの誘導法。ウェイトドロップ法と脳波記録を用いて、軽度外傷後の発作メカニズムと治療標的を探索する。

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この研究は、賞No.の下で心理的健康と外傷性脳損傷研究プログラムを通じて、米国陸軍医学研究とマテリエル司令部(DoD)から受け取った助成金CUREに基づいて、R01 NS105807/ NS /NINDS NIH HHS / 米国とCUREによってサポートされました。W81XWH-15-2-0069.イワン・ザイトフックは、原稿を校正するために非常に高く評価されています。

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著者たちは開示するものは何もない。

焦点と拡散傷害のどちらを誘発するCCIおよびFPIモデルとは対照的に、このプロトコルで説明されている反復的な拡散TBIのモデルは、焦点脳損傷の不在時にびまん性傷害の誘発を可能にし、頭皮または頭蓋の開口部および関連する炎症を必要としない。このモデルにおける難解切除がないことの付加的な利点は、慢性的な連続脳波記録のための電極を埋め込むだけでなく、ShandraとRobel 20191に記載されているように、動物のビボ内2光子イメージングの慢性の間引き頭蓋骨頭蓋窓の作成を可能にすることである。
どの動物モデルが選択されているかに関わらず、採用されるデータ収集アプローチは、成功した包括的な研究の重要な要素です。心的外傷後てんかんのげっ歯類モデルでは、発作の頻度は14、9日あたり0.3〜0.4の発作の範囲で低く、最初の発作の前の潜伏期間は、最初のTBI処置の後に数日または数週間から...

TBIは毎年、世界中で推定6,000万人に影響を与えています。影響を受けた個人はてんかんを発症するリスクが高く、最初の怪我の数年後に現れる可能性があります。重篤なTBIはてんかんのリスクが高いと関連していますが、軽度のTBIでさえ、てんかん1、2、3、4を発症する可能性が高くなります。すべての TBE は、フォーカル、ディフューズ、またはその両方の組み合わせに分類できます。びまん性脳損傷は、多くのTbIではないにしても多くの中に存在し、加速減速および回転力のために互いに異なる密度の脳組織の結果である。定義上、びまん性傷害は軽度/脳震盪性非貫通性脳損傷において孤立してしか起こらず、コンピュータ断層撮影スキャン5では脳病変は見えない。
現在、心的外傷後てんかん(PTE)を発症している患者の管理には2つの重大な問題があります。1つ目は、PTEが現れると、発作は利用可能な抗てんかん薬(AED)6に耐性があることです。第二に、AEはてんかんの予防に等しく効果がなく、効果的な代替治療アプローチはありません。この赤字に対処し、より良い治療標的と治療の候補を見つけるためには、PTE6の根本にある新しい細胞および分子メカニズムを探求する必要があります。
心的外傷後てんかんの顕著な特徴の1つは、最初の外傷性事象と自発的で挑発的な再発発作の発症との間の潜伏期間である。この時間枠はPTEの治療と予防を完全に可能にする可能性があるため、この時間ウィンドウ内で発生するイベントは、研究者にとって自然な焦点です。動物モデルは、いくつかの明確な利点を提供するため、この研究に最も一般的に使用されています, 少なくとも、人間の患者の継続的な監視は、このような潜在的に長い時間をかけて非現実的かつ高価であろうということです.さらに、てんかんの根本にある細胞および分子のメカニズムは、動物モデルでのみ探索することができます。
自発的な心的外傷後発作およびてんかんを有する動物モデルは、ケモコンブチル剤または電気刺激などによってTBIの後に発作が誘発されるモデルよりも好ましい。例えば、ケモコンブルサンスまたは電気刺激によって、急性、慢性、または親切によって。自発的な心的外傷後発作モデルは、TBIがてんかんを引き起こす健康な脳ネットワークをどのように変更するかをテストする。TBI後の追加刺激を用いた研究は、TBIへの暴露が発作閾値を減少させ、発作に対する感受性に影響を与える方法を評価する。化学的または電気刺激によって誘発された発作を伴う動物モデルの利点は、AEDに対する屈折性の特定のメカニズムと既存および新規のAEDの有効性をテストすることである。しかし、これらのデータのヒトへの関連性および翻訳の程度は、以下の理由で7があいまいであり得る:1)発作機構はTBI単独で誘発されるものとは異なり得る。2)これらのモデルのすべてが自発的な発作につながるわけではありません7;3)痙攣剤自体によって生じる病変は、その送達に必要なカニューレを有する、または深層構造(例えば、海馬または扁桃体)での電極配置を刺激することによって、すでに発作感受性の増加を引き起こし得る可能性があり、さらには海馬てんかん場電位7。さらに、いくつかの痙攣剤(すなわち、カイエン酸)は、直接海馬病変および硬化性を産生し、これは拡散TBI後に典型的ではない。
最近まで、心的外傷後てんかんの2つの動物モデルのみが存在していた:制御された皮質衝撃(CCI、焦点)または流体打楽器損傷(FPI、焦点およびびまん性)8。両方のモデルは、げっ歯類8の組織損失、出血、およびグリオシスと並んで大きな焦点病変をもたらす。これらのモデルは、大きな焦点病変によって誘発される心的外傷後てんかんを模倣する。最近の研究では、繰り返し(3x)びまん性TBIが、マウスに対する自発的発作およびてんかんの発症に十分であることを示した9は、自発再発性発作が確認された第3のげっ歯類PTEモデルを加える。この新しいモデルは、拡散TBIによって引き起こされる細胞および分子の変化を模倣し、軽度の脳震盪性TBIを有するヒト集団をよりよく表す。このモデルでは、発作発症前3週間以上の潜伏期間と後期の自発的な再発発作の出現は、心的外傷後てんかん発生の根本的な原因を調査し、発作発症後の予防アプローチおよび新しい治療候補の有効性をテストすることを可能にし、約半数の動物が心的外傷後てんかんを発症するため、心的外傷後てんかんのバイオマーカーの発症の可能性を有する。
心的外傷後てんかんの研究のための動物モデルの選択は、科学的な質問、調査された脳損傷の種類、および基礎となる細胞および分子メカニズムを決定するためにどのようなツールを使用するかに依存する。最終的には、心的外傷後てんかんのモデルは、TBI後の自発的発作の出現とTBI動物のサブセットにおける初期遅延期間の両方を実証しなければならない。これを行うために、このプロトコルでは、同時ビデオ集録を伴う脳波(EEG)が使用されます。データ収集ハードウェアとアプローチの背後にある技術的側面を理解することは、正確なデータ解釈のために重要です。重要なハードウェアの側面には、記録システムの種類、電極の種類(ねじまたはワイヤリード)と材料、同期ビデオ集録(EEGシステムまたはサードパーティの一部として)、およびコンピュータシステムの特性が含まれます。研究目標、対象のEEGイベント、さらなる分析方法、データストレージの持続可能性に応じて、あらゆるタイプのシステムに適切な取得パラメータを設定することが不可欠です。最後に、電極構成(モンタージュ)の方法は、それぞれ長所と短所があり、データ解釈に影響を与えるので、考慮する必要があります。
このプロトコルは、変更されたMarmarou重量降下モデル10、11を使用して、マウスにおける自発的、挑発されない再発性発作をもたらすびまん性傷害を誘発する方法を詳述し、単一および多チャンネル連続、および単一級、バイポーラ、または混合モンタージュを使用してビデオEEGを同期させる外科的アプローチを記述する。

<table><tbody><tr><td>0.10インチネジ</td><td>Pinnacle Technology Inc., KS, USA</td><td>8209</td><td>0.10インチ長ステンレス鋼</td></tr><tr><td>0.10インチネジ</td><td>Pinnacle Technology Inc., KS, USA</td><td>8403</td><td>0.10インチ長、はんだ付け済みリード線付き</td></tr><tr><td>0.12インチネジ</td><td>Pinnacle Technology Inc., KS, USA</td><td>8212</td><td>0.12インチ長ステンレス鋼</td></tr><tr><td>1EEGヘッドマウント</td><td>Invitro1 (Plastics Oneの子会社), VA,米国</td><td>MS333/8-A/SPC</td><td>3 個々にテフロン絶縁されたプラチナ イリジウム ワイヤー電極 (ねじれているかねじれていないか、直径 0.005 インチ) ねじ付きプラスチック台座の下に伸び</td></tr>る <tr><td>2EEG/1EMG ヘッドマウント</td><td>Pinnacle Technology Inc., KS, USA</td><td>8201</td><td>2EEG/1EMG チャネル</td></tr><tr><td>3% 過酸化</td><td></td><td></td>水素 <td>薬局</td></tr><tr><td>3EEG ヘッドマウント</td><td>Pinnacle Technology Inc., KS, USA</td><td>8235-SM-C</td><td>3EEGチャネル用カスタム6ピンコネクタ</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA</td><td>060969</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA</td><td>060969</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 マウス</td><td>Harlan/Envigo Laboratories Inc</td><td></td><td>オス, 12-16週齢</td></tr><tr><td>C57BL/6 マウス</td><td>The Jackson Laboratory,</td><td></td><td>オス, 12-16 週古い</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Zoetis Services LLC、パーシッパニー、ニュージャージー州、米国</td><td>026357</td><td>注:この薬は、定位電極の移植が同じ日に行われる場合にのみ、体重減少中に追加されます</td></tr><tr><td>クロルヘキシジン消毒薬</td><td></td><td></td><td>学</td></tr><tr><td>歯科用セメントと溶剤キット</td><td>Stoelting Co.、米国</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>ドリル</td><td>Foredom</td><td>HP4-917</td><td></td></tr><tr><td>ドリルビット</td><td>Meisinger USA, LLC, USA</td><td>HM1-005-HP</td><td>0.5 mm, 丸型, 1/4, スチール製</td></tr><tr><td>乾燥滅菌器</td><td>Cellpoint Scientific, USA</td><td></td><td>Germinator 500</td></tr><tr><td>EEG System 1</td><td>Biopac Systems, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EEG System 2</td><td>Pinnacle Technology Inc., KS, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール &ge;70%</td><td>VWR、米国</td><td>71001-652</td><td>KOPTEC USP、バイオテクノロジーグレード(140プルーフ)</td></tr><tr><td>眼軟膏</td><td>プロラボ株式会社、米国</td><td></td><td>Puralube Vet 軟膏滅菌眼潤滑剤一般オンラインストアや薬局で利用可能</td></tr> 吸入<tr><td>麻酔用フルリソ液体</td><td>MWI獣医供給株式会社、米国</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>脱毛製品</td><td>教会&Dwight Co., Inc., USA</td><td></td><td>Nair cream</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>MWI Veterinary Supply Co., USA</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-iodine Surgical solution</td><td>Purdue Products, USA</td><td>004677</td><td>Betadine</td></tr><tr><td>Rimadyl/Carprofen</td><td>Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA</td><td>026357</td><td></td></tr><tr><td>はんだ</td><td></td><td></td><td>Harware store</td></tr><tr><td>はんだごて</td><td>ウェラー、米国</td><td>WP35</td><td>ST7 チップ、0.8mm</td></tr><tr><td>ステンレス鋼ディスク</td><td></td><td></td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>滅菌綿棒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌ガーゼパッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、米国</td><td>22362178</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ポリライニング吸収性タオルパッド</td><td>カーディナルヘルス、米国</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュ接着剤</td><td>3M アニマルケア製品、米国</td><td>1469SBの</td><td></td></tr></tbody></table>

反復性びまん性外傷性脳損傷のマウスモデルにおける心的外傷後てんかんの誘導

Inducing Post-Traumatic Epilepsy in a Mouse Model of Repetitive Diffuse Traumatic Brain Injury

外傷性脳損傷(TBI)は、後天性てんかんの主な原因である。TBI は、焦点またはびまん性脳損傷を引き起こす可能性があります。焦点損傷は、時には頭蓋骨を貫通する直接的な機械的力の結果であり、脳組織に直接病変を引き起こした。これらは、脳イメージング中に、連続、裂傷、出血を伴う領域として見られます。焦点病変は神経死およびグリア瘢痕形成を誘発し、TBIを発生させる全ての人々の20%−25%に存在する。しかし、TBIの大部分の場合、傷害は加速減速力とその後の組織剪断によって引き起こされ、非焦点的、拡散性損傷をもたらす。TBI患者の亜集団は、数ヶ月または数年の待ち時間の後に心的外傷後てんかん(PTE)を発症し続けている。現在、どの患者がPTEを発症するかを予測することは不可能であり、PTE患者の発作は制御に困難であり、さらなる研究が必要です。最近まで、この分野は、検証された自発的な心的外傷後発作を有する2つの動物/げっ歯類モデルに限定され、両方とも皮質および時には皮質下構造における大規模な組織喪失を有する大きな焦点病変を呈した。これらのアプローチとは対照的に、変性体重減少モデルを用いて誘導されたびまん性TBIは、焦点性病変または組織喪失がない場合でも、自発的痙攣性および非けいれん発作の発症を開始するのに十分であると判断された。後天性心的外傷後てんかんを有するヒト患者と同様に、このモデルは発作発症前の傷害後の待ち時間を呈する。このプロトコルでは、コミュニティに心的外傷後てんかんの新しいモデルが提供され、数ヶ月の間に拡散性非病変TBIを誘導し、続いて数ヶ月にわたって継続的な長期的なビデオ脳波動物モニタリングを誘導する方法を詳述する。このプロトコルは、動物の取り扱い、重量低下手順、2つの集録システムの電極配置、および手術、術後モニタリング、およびデータ取得の各ステップで頻繁に遭遇する課題について詳述します。

ここで概説するプロトコルは、反復拡散TBIのマウスモデルを用いて、単独で拡散傷害を誘導する方法(例えば、焦点病変がない場合)を説明する(図1)。図 1Aは、このモデルで TBI の誘導に使用されるウェイト ドロップ デバイスとそのコンポーネント (図 1A、 a1-a5)と、手順中の重要なステップ (図 1B、b1-b5)を示しています。
このモデルの特徴は、TBIの結果としての脳への焦点病変の欠如、意識喪失、高生存率、後期発作発症の出現(TBIの1週間)、およびのサブセットにおける自発的な、いわれのない再発発作を含む。TBIマウスは、TBIの後に少なくとも3週間の待ち時間の後に.
このプロ...

この体系的なプロトコルは、反復的な軽度の外傷性脳損傷後の心的外傷後てんかんの新しい動物モデルを記述する。最初の部分は、変更された体重減少モデルを使用して外傷性脳損傷誘導のためのステップを詳述する。第2部では、単一および多チャンネルの脳波データ集録システムの外科的アプローチについて説明します。

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of acquired epilepsy. TBI can result in a focal or diffuse brain injury. Focal injury is a result of ...

我々のプロトコルは、軽度の外傷性脳損傷によって誘発される心的外傷後てんかんのマウスモデルを詳述する最初のプロトコルである。軽度の拡散性外傷性脳損傷モデルの使用は、ほとんど常に拡散成分を有するヒト外傷性脳損傷の病理の重要な側面を模倣する。バイオマーカーや治療法を開発するためには、ヒト病理の側面を適切に再現するモデルを用いた研究が必要です。私たちの外傷性脳損傷モデルはまた、軽度の外傷性脳損傷または脳震盪後に脳機能の障害を引き起こすメカニズムに関する洞察を提供する可能性を有する。痛みの反射に対する応答の欠如を確認した後、フォームパッドにマウスを置き、体重低下管の下にマウスの頭部を置きます。目と耳の間の動物の頭の中央に平らな1.3センチメートルの直径1.3センチメートルの厚さ880ミリグラムの厚さのステンレス鋼ディスクを置きます。重量ドロップチューブのピンを取り外し、50センチメートルの高さから100グラムの重量ロッドを解放します。コントロールマウスで偽の傷害を誘発するには、重量降下中にピンが偶発的に放出されるのを防ぐために、チューブから重量棒を取り除きます。重量降下誘導後、動物を背中に置き、完全な債務まで監視する無菌ポリ裏地吸収性タオルで覆われた加熱パッドに置きます。その後、回復ゲルといくつかの湿らせたチャウピースと加熱パッドに温めたきれいなケージにマウスを45分間置きます。脳電解電極注入のための外科分野を準備するには、温度センサーをパッドに置き、再麻酔された脳傷ついたマウスを立体性装置の加熱パッドの上に無菌ドレープに置きます。耳の棒で頭を固定した後、動物の目に潤滑軟膏を塗布し、脱毛クリームを使用して頭皮から髪を取り除きます。露出した皮膚を、ポビトンヨウ素外科用消毒液の3つの20秒交互スワブと70%エタノールを円形運動で消毒する。頭皮を取り除いた後、開いた皮膚の境界に小さな止止まりを適用して、露出した領域を拡大します。次に、メスを使って骨膜を静かに取り除き、過酸化水素で頭蓋骨を綿棒にします。頭蓋骨が組織から取り除かれ、白っぽい外観を示すとき、滅菌ガーゼまたは綿棒で骨を乾燥させる。電極注入の場合、5,000~6,000回転/分の円形0.5ミリメートルの鋼ビットを用いた高速ドリルを使用して、ネジ電極用の6つのバリ穴を作成します。すべての穴が開けられたら、6本のネジ電極をバリ穴に入れ、歯科用セメントパウダーの半分のスクープと数滴の溶剤を混ぜます。歯科セメント混合物が粘着性があるが可鍛性で硬くなるまでかき混ぜるためにヘラを使用して、動物の頭蓋骨に置かれたときに適切に凝縮されるほど硬い。頭蓋骨と各ねじ電極の露出面全体にセメントを塗布します。1~2分後、はんだ付けアイロンをオンにし、3つのEEGヘッドマウントを立体性ホルダーアームに入れます。ヘッドマウントをスカルの上に置き、6本のワイヤリード位置が各ネジ電極のワイヤリードの位置と一致するようにします。その腹側部分が歯科用セメントの上に置かるように装置を下げなさい。各ねじ電極から各リードのワイヤをヘッドマウントの対応するワイヤリードでねじり、適切な信号伝導のために各ねじれたワイヤーをはんだ、ハサミを使用して余分なワイヤをトリミングします。ヘッドマウントの周りにはんだ付きのワイヤーリードの各ペアを曲げてください。すべてのペアが曲がったら、ヘッドマウントの黒い部分だけを露出させたまま、新鮮な歯科用セメントでワイヤーのすべてを覆います。皮膚のフラップを保持する止血体を解放し、感染を避けるためにインプラントの周りの領域にクロルヘキシジン消毒剤を適用します。次に、動物を装置からバランスに移し、動物を将来の監視用の基準として測定し、監視、回収ゲル、およびいくつかの湿らせたチャウピースを備えた暖かい加熱パッドの清潔なケージに動物を入れます。この図では、このビデオプロトコルで示されるように構成された3つの脳台座を用いて記録された体重低下外傷性脳損傷を繰り返した97日後にマウスでの自発的発作が示されている。ここで、反復重み低下外傷性脳損傷の65日後にマウスに記録された自発的な非痙攣電解発作が示されている。この図では、体重低下外傷性脳損傷を繰り返した23日後にマウスでの自発的発作を1台の脳台に用いて記録した。典型的な発作のスペクトルパワーは、15ヘルツのピークを有する10〜40ヘルツの範囲内にある最高密度を示す。このプロトコルは、一部の動物における発作クラスタリングの発生を示し、断続的な記録ではなく連続的に取得することの重要性を強調する反復的な体重低下外傷性脳損傷後の動物における発作発症のタイムラインを示す。スチールディスクの適切な配置、ネジ電極の慎重な注入、ワイヤリードの慎重なはんだ付けはすべて、長期的な実験を成功させるために不可欠です。脳科学モニタリングの後、発作を発症する脳損傷を有する動物は、その細胞、分子、および生理学的な違いをその後の分析のためにそうでない動物から階層化することができる。外傷性脳損傷を引き起こすが発作を発症しない動物から外傷後てんかんを持つ動物を階層化することは、介入およびバイオマーカーの開発にとって重要である。

inducing-post-traumatic-epilepsy-mouse-model-repetitive-diffuse

Research

JoVE Journal

Behavior

行動

このビデオは、マウスモデルで外傷性脳損傷(TBI)を誘発する手順を示しています。頭蓋骨が露出した麻酔マウスを採取して頭蓋骨に開口部を作り、その後、衝撃装置を使用して制御された皮質損傷を誘発します。損傷は脳組織に損傷を与え、認知機能や運動協調性に障害を引き起こします。...

インパクターデバイスを用いた外傷性脳損傷のマウスモデルの生成

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マウスモデルにおけるウェイトドロップによる外傷後発作を誘発する技術

出典: Yang, Z., et.al. マウスにおける反復脳震盪性頭部外傷モデル。J. Vis. Exp.

マウスモデルにおける反復性脳震盪性頭部外傷のモデル化

出典:Macheda, T., et.al.マウスの軽度外傷性脳損傷の電磁制御クローズドヘッドモデル。J. Vis. Exp.

マウスモデルにおける軽度外傷性脳損傷の誘発

脳震盪は、最も一般的なタイプの外傷性脳損傷を示します。したがって、患者の損傷の重要な特徴を再現する反復脳震盪動物モデルは、厳密で制御された効率的な方法で脳震盪を研究する手段を提供する可能性があります。...

マウスにおける反復震とう頭部損傷モデル

アスリートは毎年数百の軽度の外傷性脳傷害（mTBI）/脳震盪を吸収する。しかし、これらの脳への帰結はあまり理解されていません。したがって、臨床的に関連する症状を一貫して複製する単一および反復mTBIの動物モデルは、mTBIおよび脳震盪の研究を進める手段を提供する。...

片性および反復性軽度外傷性脳損傷のマウスモデル

神経伝達物質の変化は、脳震盪後に発生し、時には壊滅的な長期的な結果に貢献する神経機能障害のメカニズムです。このラットモデルは、微小透析を組み合わせ、生体内神経伝達物質の定量を可能にし、ヒト頭蓋脳外傷の重要な要因である頭部および胴体の急速な加速および減速を行う重量降下技術を用いる。...

生体内脳微小透析における力と回転を組み合わせた脳震盪の新規および翻訳ラットモデル

ここでは、成人、オスのウィスターラットにおける横液パーカッション傷害(FPI)モデルを有する重篤なTBIを誘導するプロトコルを提示する。また、ワイヤレステレメトリシステムを使用して、連続的なビデオEEG記録を収集し、外傷後てんかん形成と一致するてんかんの排出を監視する方法も示しています。...

横液打楽器誘発性外傷性脳損傷後のてんかん形成放出を監視するワイヤレスビデオEEGシステムの使用

このプロトコルは、反復性軽度外傷性脳損傷 (rmTBI) の修正マウス モデルを示しています 閉鎖性頭部損傷 (CHI)...

間伐頭蓋窓と流体パーカッションを組み込んだ反復性軽度外傷性脳損傷の改良マウスモデル

マウスモデルは、行動神経科学の研究においてますます人気が高まっています。 モデルが進歩するにつれて、マウスに特有の感度の高い行動手段を開発することが重要です。...

代償四肢使用および虚血性脳卒中のマウスモデルにおける感覚皮質損傷後の運動技能の学習の行動評価

学ぶ反復性びまん性外傷性脳損傷マウスモデルにおける心的外傷後てんかんの誘導法。ウェイトドロップ法と脳波記録を用いて、軽度外傷後の発作メカニズムと治療標的を探索する。

反復性びまん性外傷性脳損傷のマウスモデルにおける心的外傷後てんかんの誘導

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