Name: 大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶ ラベルフリー質量分析を用いた核タンパク質の免疫沈降法による、内因性タンパク質間相互作用の網羅的マッピング手法。この計算的手法は低発現タンパク質の相互作用解析に有用です。

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この作品は、リンダ・クニック・インスティテュート・オブ・ダウン症候群のW.M.O.に対するグランドチャレンジ補助金と、DARPA協力協定13-34-RTA-FP-007によって支援されました。ジェシー・カーランドとキラ・コッツォリーノの原稿の読み取りとコメントに貢献してくれたことに感謝します。

<ol><li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+interaction+landscape+of+the+human+CMGC+kinase+group%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group.</a> Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).</li>
<li>Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+Affinity+Tags+for+Protein+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Overview of Affinity Tags for Protein Purification.</a> Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).</li>
<li>Mahmood, N., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endogenous+%27nonspecific%27+protein+detected+by+a+His-tag+antibody+is+human+transcription+regulator+YY1%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1.</a> Data in Brief. 2, 52(2015).</li>
<li>Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+the+ends%3A+internal+epitope+tagging+of+proteins+using+transposon+Tn7%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7.</a> Genetics. 200, 47-59 (2015).</li>
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<li>Fotaki, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyrk1A+haploinsufficiency+affects+viability+and+causes+developmental+delay+and+abnormal+brain+morphology+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).</li>
<li>Hämmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatio-temporal+and+subcellular+expression+of+the+candidate+Down+syndrome+gene+Mnb%2FDyrk1A+in+the+developing+mouse+brain+suggests+distinct+sequential+roles+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development.</a> European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).</li>
<li>Funakoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+human+MNB%2FDYRK1A+gene+induces+formation+of+multinucleate+cells+through+overduplication+of+the+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12(2003).</li>
<li>Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+between+DYRK1A+and+DCAF7+phosphorylates+the+C-terminal+domain+of+RNA+polymerase+II+to+promote+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li>
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<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13, 731-740 (2016).</li>
<li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAPome%3A+A+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10, 730-736 (2013).</li>
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<li>Shannon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoscape%3A+a+software+environment+for+integrated+models+of+biomolecular+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.</a> Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).</li>
<li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STRING+database+in+2017%3A+quality-controlled+protein-protein+association+networks%2C+made+broadly+accessible%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).</li>
<li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClueGO%3A+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).</li>
<li>Guard, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+interactome+of+DYRK1A+reveals+a+functional+role+in+DNA+damage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair.</a> Scientific Reports. 9, 6539(2019).</li>
<li>Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iRefIndex%3A+A+consolidated+protein+interaction+database+with+provenance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance.</a> BMC Bioinformatics. 9, 405(2008).</li>
<li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal%2C+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11, 319-324 (2014).</li>
<li>Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Dependency+of+Cellular+Protein+Levels+on+mRNA+Abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance.</a> Cell. 165, 535-550 (2016).</li>
<li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10, 757(2014).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

ここで概説するプロテオミクスワークフローは、目的のタンパク質に対する高信頼タンパク質インターアクターを同定するための効果的な方法を提供します。このアプローチは、細胞内分数を通じてサンプルの複雑さを軽減し、堅牢なサンプル調製、オフラインサンプルのクリーンアップ、LC-MSシステムの厳格な品質管理を通じて、識別相互作用パートナーを増やすことに焦点を当てています。ここで説明する下流データ分析は、餌と共に凝固として同定されたタンパク質の簡単な統計的評価を可能にする。しかし、実験変数の数が多いため(スケール、細胞株、抗体の選択)、各実験では、データの可視化と濃縮に関する異なるカットオフと考慮事項が必要です。
IP-MS実験における最初の設計上の考慮事項は、相互作用するパートナーと共に目的のタンパク質の凝化に使用される抗体の選択である。市販の抗体の入手可能性は、過去数十年にわたってヒトプロテオームのより大きな部分をカバーするように拡大しましたが、試薬が制限されているタンパク質はまだ多くあります。さらに、ウェスタンブロット検出などの用途について検証された抗体は、免疫沈降実験において標的タンパク質の選択的濃縮が不可能な場合がある。大規模な相互作用プロテオミクス実験を行う前に、90%コンフルエント10cm皿、または同等の細胞数からIPを完了し、ウェスタンブロッティングによって目的の標的タンパク質をプローブすることが示唆される。免疫沈降のために複数の抗体が利用可能な場合は、さらに、タンパク質の異なる部分内のエピトープを認識する複数の抗体を選択することが示唆される。ベイトタンパク質への抗体の結合は、推定相互作用パートナーに必要な結合界面を閉塞させることができる。ベイトタンパク質の二次エピトープを選択すると、質量分析ベースの実験によって同定された相互作用プロファイルのカバレッジが増加します。
第二の主要な考慮事項は、高信頼度の相互作用と低信頼または非特異的相互作用を区別するための適切な制御の選択と、餌と共に凝固していると識別されるものとの間にある。IP-MS実験のための最も厳しい制御は、餌のCRISPR KO細胞株からの免疫沈降を完了することです。このような制御は、餌タンパク質ではなく抗体に直接結合する非特異的タンパク質の同定と除外を可能にする。各ベイトタンパク質のCRISPR KO細胞株を生成することが不可能な場合には、餌抗体の同一アイソタイプのIgGビーズコントロールを使用することができます。複数の種を表す抗体のパネルを用いた実験では、ビーズのみのコントロールの使用は適切ですが、高信頼インターアクターとして同定された偽陽性の速度を増加させます。
IP-MS実験で使用される細胞株の選択は、いくつかの重要な要因に依存する。タンパク質発現および局在化は、細胞の種類に大きく依存する。RNA発現の推定値は、多くの一般的に使用される細胞株のほとんどの遺伝子に対して見つけることができるが、タンパク質発現はRNA発現との相関が悪く、実験的に25を決定しなければならない。ベイトタンパク質が非常に低いコピー数で発現する細胞株は、必要とされる可能性のある細胞培養スケールの急激な増加に関連する問題を回避すべきである。ただし、サンプル調製は、非常に低い存在量タンパク質の検出に最適化できることに留意すべきである。フィルターエイドサンプル準備(FASP)法は、堅牢でありながら、試料中のペプチドの50%以上の損失を引き起こす可能性がある。シングルポット固相増強サンプル調製(SP3)は、サンプル損失26を最小限に抑える質量分析用サンプルを生成する効率的な方法です。サンプル調製のSP3法によって可能になる回復の増加は、検出限界に近いタンパク質を定量するためのこのワークフローで有用な代替手段であり得る。
このプロテオミクスワークフローは、キナーゼ、E3ユビキチンリガーゼ、マルチサブユニット複合体の足場メンバーを含む多くの核餌に適用されています。抗体試薬の適切な検証を前提として、このワークフローを正常に実行すると、目的のタンパク質に対する高信頼タンパク質核相互作用パートナーの検出が得られます。

ヒトプロテオームは、安定したマルチサブユニット複合体および一過性タンパク質間相互作用の形成を通じて、広大な構造的および生化学的多様性を示す。したがって、目的のタンパク質の相互作用パートナーの同定は、分子機構を解明するための調査において一般的に必要とされる。アフィニティー精製プロトコルの最近の進歩と高分解能高速走査質量分析装置の出現により、単一の偏りのない実験でタンパク質相互作用の風景を容易にマッピングできるようになっています。
タンパク質相互作用プロトコルは、一般に、アフィニティータグ付き融合構築物を有する異所性発現系を採用し、目的のタンパク質を認識する高品質の抗体を必要とせずにタンパク質相互作用を同定する。ただし、エピトープタグベースの方法にはいくつかの欠点があります。エピトープとの物理的相互作用は、非特異的コプリン化タンパク質3の検出につながる可能性がある。さらに、タンパク質のN−またはC末端へのこれらのエピトープタグの融合は、天然タンパク質間相互作用を遮断し、または非生理学的立体構造を促進するためにタンパク質の折り畳みを破壊し得る。さらに、エクトピック発現系は、典型的には、超生理学的濃度で餌タンパク質を過剰発現し、特に投与量感受性遺伝子5に対する関節実性タンパク質相互作用の同定をもたらし得る。これらの問題を回避するために、内因性餌タンパク質は、天然タンパク質を認識する高品質の抗体の入手可能性を仮定して、関連する相互作用獲物タンパク質と共に免疫沈降することができる。
ここでは、CMGCプロテインキナーゼDYRK1Aを例に用いて内因性タンパク質の核相互作用体を検出するための相互作用プロテオミクスワークフローを提供する。DYRK1Aコピー数、活性レベル、または発現の破壊は、ヒトにおいて重度の知的障害を引き起こす可能性があり、マウス6、7、8、9における胚致死性を引き起こす可能性がある。DYRK1Aは、動的時空間調節10、および区画化タンパク質相互作用11、12を示し、異なる細胞内コンパートメントに特異的な低存在性相互作用パートナーを検出することができるアプローチを必要とする。
このプロトコルは、ヒトHeLa細胞の細胞画分を細胞質および核視分画に用い、免疫沈降、質量分析のためのサンプル調製、およびデータ品質を評価し、結果を可視化するためのバイオインフォマティクスパイプラインの概要を、分析および可視化のために提供されるRスクリプトを用いる( 図1)。このワークフローで使用されるProteomicsソフトウェアパッケージは、すべて自由にダウンロード可能であるか、Webインターフェイスを介してアクセスすることができます。ソフトウェアと計算方法の詳細については、提供されているリンクの詳細なチュートリアルと指示を参照してください。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン、0.1% EDTA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 低レンタルマイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>4-20% ミニプロティアン TGX プレキャストプロテインゲル</td><td>バイオ・ラッド</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>アセトン (HPLC)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A949SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 ml 30k フィルターカラム</td><td>ミリポアシグ</td><td>マUFC503096</td><td></td></tr><tr><td>ベンザミジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>12072</td><td></td></tr><tr><td>ベンゾナーゼ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>クロロアセトアミド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C0267</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ閉鎖</td>キャ<td>ロラインバイオロジカルサプライカンパニー</td><td>684239</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-47724</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>887845</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HeLa QC トリプシン消化</td>物 <td>Pierce</td><td>88329</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>フィッシャー サイエンティフィック AAJ1692630</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>KONTESドンス ホモジナイザー 7ml</td><td>VWR</td><td>KT885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>ラージクリアランス乳棒 7ml</td><td>VWR</td><td>KT885301-0007</td><td></td></tr><tr><td>リシルエンドペプチダーゼC</td><td>VWR</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>塩化</td><td>マグネシウムSigma-Aldrich</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>Microcystin</td><td>enzo life sciences</td><td>ALX-350-012-C100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Substitute solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>p84 antibody</td><td>GeneTex</td><td>GTX70220</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BSA Protein Digest, MS grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88341</td><td>LCMS QC</td></tr><tr><td>Pierce C18 スピンカラム</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-89873</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90057</td><td>質量分析サンプル調製用</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>塩化</td><td>カリウムSigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Protein A Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-0780-01</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>シリカエミッタチップ</td><td>Pico TIP</td><td>FS360-20-10</td><td></td></tr><tr><td>スモールクリアランス乳棒 7ml</td><td>VWR</td><td>KT885302-0007</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>フッ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>メタ重亜硫酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31448</td><td></td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>スペクトル/ Por 8 kDa 24 mm 透析チューブ</td><td>Thomas Scientific</td><td>3787K17</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 150, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903</td><td>接着細胞用組織培養ディッシュ</td></tr><tr><td>TCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>PG82080</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Waters ACQUITY M-Class UPLC</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class カラム 逆相 1.7&micro;m 球面ハイブリッド (1.7 & マイクロ;メートル、75&マイクロ;m x 250 mm)</td><td>Waters</td><td>186007484</td><td>nanoflow C18 カラム</td></tr></tbody></table>

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

免疫親和性精製質量分析法(IP-MS)は、タンパク質間相互作用を同定する堅牢な定量方法として浮上している。本書は、他の細胞内コンパートメントにも適用できる核からの低存在量タンパク質間相互作用を同定するために設計された完全な相互作用プロテオミクスワークフローを提示する。このワークフローには、細胞内分画、免疫沈降、サンプル調製、オフラインクリーンアップ、シングルショットラベルフリー質量分析、下流の計算およびデータ可視化が含まれます。当社のプロトコルは、内因性タンパク質の免疫沈降によって、全細胞のリザース(例えば、核内の転写因子相互作用)から識別することが困難なコンパートメント化された低存在量相互作用を検出するために最適化されています。分画された細胞下コンパートメント。ここで概説するサンプル調製パイプラインは、HeLa細胞核抽出物の調製、内因性ベイトタンパク質の免疫親和性精製、定量的質量分析に関する詳細な指示を提供する。また、質量分析ベースの相互作用プロファイリング実験で大規模な免疫沈降を行う方法論的考慮事項について議論し、真陽性タンパク質を区別するためのデータ品質を評価するためのガイドラインを提供する。非特異的相互作用からの相互作用。このアプローチは、CMGCキナーゼの核相互作用体を調べるため、核内の相互作用が不十分に定義された低存在量のタンパク質キナーゼであるDYRK1Aを調べる。

IP-MS実験で同定されたタンパク質量の大部分は、非特異的タンパク質から構成されています。したがって、IP-MS実験の重要な課題の1つは、どのタンパク質が高信頼インターアクター対非特異的インターアクターであるかの解釈です。データ品質の評価に使用される重要なパラメータを実証するために、研究はビーズのみの制御を利用してHeLa核抽出物の5mgからの三重免疫沈降を分析しました。IP-MS実験が確実に信頼できることを確認する最初の内部チェックは、ベイトタンパク質が、制御のフォールドチェンジとSAINT確率の両方によって同定される最も高い濃縮タンパク質の1つとしてランク付けされるかどうかです。この場合、餌DYRK1Aは、対照上の上位3つの濃縮タンパク質の中でランク付けされた(図2A、B)。4つの独立した抗体を利用したDYRK1Aの核相互作用研究では、FC-Aカットオフ&gt;3.00とSAINT確率カットオフ&gt;0.7は、新規および以前に検証されたインターアクター22の両方を同定するための厳格なカットオフを提供した。この実験に適用すると、高信頼インターアクターと&gt;95%の非特異的として同定されたコプログラタンパク質との間に明確な分離が見られた(図2A、B)。折り変えの濃縮と確率しきい値の両方を適用すると、生物学的複製間で一貫して高いタンパク質 ID の濃縮が必要になるため、ストリンジェンシーが増加します。
統計的スコアリングに加えて、CRAPome解析ワークフローは、以前に報告された相互作用をベイト獲物データ23にマップします。このマッピングは、高信頼度と低信頼度の相互作用をしきい値付けする場合に役立ちますが、以前に報告された相互作用はFC-AとSAINT確率によってスコアが低く、特定の細胞タイプ、コンテキスト、またはオルガネラにのみ存在する可能性があることを示す可能性があります。DYRK1A データセットの例では、iREF インターアクティバ FC-A 値は 0.45 と低く、制御に対する非常に低いエンリッチメント (図 2C)を表します。誤検知のインフレを避けるために、統計的閾値は、偽陰性の減少よりもストリンジェンシーを優先する方法で実行されるべきである。なお、これらの相互作用の検出はタンパク質の存在量(図2C)とは無関係であった。HeLa細胞内の各iREF相互作用の計算された絶対コピー数は、IP-MS24による相互作用パートナーの検出レベルとの相関を示さなかった。
Cytoscapeは、相互作用データ19の複数の層を可視化するための効果的なツールとして機能する。ここで説明するDYRK1A免疫沈降実験では、FC-A&gt;3.0とSAINT&gt;0.9を併用して、高信頼インターアクターのリストを6つのタンパク質に還元した(図2D)。ただし、3.0 の FC-A カットオフを単独で適用すると、8 個のタンパク質がネットワークに追加されました。これらの追加のタンパク質インターアクターは、すでにネットワーク内のインターアクターとの接続性が高く、類似した複合体または機能的役割に関連していることを示唆しています。この用に、タンパク質間相互作用のSTRING-DBからの証拠は、青い破線20としてこのネットワークに統合された。このシングルベイト、三重実験は、完全なDYRK1A相互作用ネットワークの限られたサンプルを提供しますが、追加の餌の使用、複製、および大規模なパブリックデータセットの統合を使用して、高信頼インタラクションのネットワークを拡張することができます。したがって、統計的カットオフは個々の実験に固有であり、徹底的に評価する必要があります。
<img alt="核抽出物の生成;免疫沈降;質量分析;データ分析;研究図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:細胞内IP-MSの代表的なプロテオミクスワークフロー細胞は、4 L丸底フラスコまたは15cmの組織培養皿のいずれかで成長し、細胞内分画のために同時に収穫される。細胞は細胞質、核、核ペレットに分画され、免疫沈降は同じ餌を認識する1つまたは複数の抗体を使用して1〜10mgの核リサートから行われます。フィルター支援サンプル準備(FASP)とオフラインサンプルクリーンアップは、シングルショット質量分析の前に実行されます。ダウンストリームの計算パイプラインは、データを解釈可能な相互作用データに処理するために使用されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="DYRK1Aタンパク質相互作用分析;A、B、C:データプロット。D:相互作用ネットワーク図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:シングルベイト単抗体IP-MS実験の代表データ。(A)球体分析ワークフローからのFC-AおよびSAINT確率出力は、キナーゼDYRK1Aに対する単一抗体を用いた最適な実験を行う(n=3)。比較にはビーズのみのコントロールが使用されました。赤い実線は、FC-A &gt; 3.00 および SAINT &gt; 0.7 に設定されたカットオフを表します。(B)MaxQuantタンパク質の存在量推定(iBAQ)出力対DYRK1A IPにおけるタンパク質の存在率を制御し、ラベルフリー強度の経験的ベイズ分析から調整されたp値の範囲で着色する。(C)FC-AおよびiRefデータベース23、24内の相互作用タンパク質としてリストされるタンパク質の推定コピー数。(D) DYRK1Aインターアクターのサイトスケープネットワーク可視化青色のノード = FC-A &gt; 3.00、セイント &gt; 0.7。オレンジ色のノード = FC-A &gt; 3.00黒いエッジ=IPMS実験でインターアクターとして同定されたタンパク質。青い破線エッジ = 獲物タンパク質間の SAINT 相互作用 (信頼度 &gt; .150)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">プロテアーゼ阻害剤(PI)混合物</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>メタビスルファイトナトリウム</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>ベンザミジン</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>ジチオスレイトール (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>フッ化フェニルメタンスルホニル(PMSF)</td>
			<td>0.25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ホスファターゼ阻害剤(PhI)混合物</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>ミクロシスチンLR</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>オルソバナ酸ナトリウム</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>フッ化ナトリウム</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">細胞内分画バッファー:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">バッファA pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">バッファB pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化 ナトリウム</td>
			<td>420 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)</td>
			<td>0.4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>グリセロール</td>
			<td>25% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">バッファー C pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)</td>
			<td>0.4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>グリセロール</td>
			<td>20% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">免疫沈降バッファー:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP バッファ 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0.1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>グリセロール</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP バッファ 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0.1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>グリセロール</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">SDS アルキル化バッファー pH 8.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sds</td>
			<td>4% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>クロロアセトアミド</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>TCEP</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>トリス</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">UA pH 8.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>尿素</td>
			<td>8 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>トリス</td>
			<td>0.1メートル</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">*HPLCグレードH2Oを使用</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: バッファー構成
補足的なコーディング ファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

記載されているプロテオミクスワークフローは、目的とするタンパク質の免疫親和性濃縮と標識フリー質量分析法を用いて核細胞内分画からタンパク質相互作用パートナーを同定するためのプロテオミクスワークフローである。このワークフローには、細胞内分画、免疫沈降、フィルター支援サンプル調製、オフラインクリーンアップ、質量分析、下流バイオインフォマティクスパイプラインが含まれます。

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

このプロテオミクスワークフローは、内因性タンパク質とタンパク質の細胞内分解能との相互作用を公平に同定し、マッピングすることを可能にします。この手法は、用量感受性、低存在量、または複数の細胞内局在性を有するベイトタンパク質を調査する場合に特に有利である。この方法は、適切な親和性試薬があると仮定して、内因性タンパク質相互作用のマッピングに適用することができる。これは、未知の機能を持つ何千ものタンパク質の多くにとって特に重要であり、その多くはヒト疾患と結びついています。この方法は、細胞内分画に適した任意の細胞株または組織に適合させることができる。適切な親和性試薬を有する任意のタンパク質を標的とすることができる。アフィニティー精製実験の一般的な結果は、多くの場合、結果ではありません。本当に良い試薬、全体のQCデータを収集し、サンプルの取り扱いを制限することは、すべて本当に重要です。サンプルがあることを知っています。まず、調製した細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤またはホスファターゼ阻害剤を用いたコールドバッファーAの1Xペレット体積で15分間解凍する。細胞ペレットを含むチューブを摂氏4度のヌテレーターに置き、30分間再懸濁するのを助けます。その後、チューブを遠心分離機に2,000 g、摂氏4度でペレットに10分間置きます。上清をデカントし、5倍のパックされた細胞体積を20分間氷上のバッファーA.Incubateで再懸濁させる。次に、2,000回gと摂氏4度で再びペレットを10分間ペレット化する。バッファーをデカントし、プロテアーゼ阻害剤またはホスファターゼ阻害剤を用いた2Xのパックされた細胞容積バッファーAで再懸濁する。緩い害虫A.遠心分離機で約7回、2,000倍gと摂氏4度で10分間、ライセートを捨てます。上清を慎重に新しいチューブに移し、液体窒素でフラッシュフリーズします。ライセートをマイナス80度で保存します。プロテアーゼ阻害剤またはホスファターゼ阻害剤を用いて0.9Xペレット量のバッファーBでペレットを再懸濁し、摂氏4度で5分間ヌケーターに混ぜます。核をライスするには、価価害虫で20回ダウンスB.ヌケーターの核ライセートを4°Cで30分間混ぜて均質になるようにします。その後、核ライセートを摂氏4度で21,000倍gで30分間遠心分離する。上清を取り除き、可溶性核タンパク質抽出物として保存します。可溶性核抽出物を透析するには、まず8キロダルトンの分子量カットオフで24ミリメートル幅の透析チューブの適切な長さを切断する。チューブの片側をクランプし、チューブに核内をロードします。ライセートをロードした後、もう一方の端をクランプし、プロテアーゼ阻害剤とバッファーCを含むきれいなガラス容器に沈めます。摂氏4度で3時間透析する。その後、透析した核状抽出物をチューブに移し、遠心分離機を摂氏4度で21,000倍に30分間移動します。ウェスタンブロットによる分画検証のために、核抽出物の3つの20マイクロリットルアリコートを新しいマイクロ遠心分離管に移す。先端で切断されたピペットチップを使用して、プロテインAセファローズの12.5マイクロリットルビーズボリュームとマイクロ遠心チューブ内のプロテインGセファローズ12.5マイクロリットルを組み合わせることで、複製ごとにタンパク質A/Gビーズ混合物を調製します。プロテインA/Gビーズ混合物を300マイクロリットルのIPバッファI.で2回洗浄し、ビーズを1、500倍のgを摂氏4度で1分間回転させ、バッファをデカントします。次に、抗体タンパク質A/Gビーズを調製する。抗体をビーズに結合させるために、所望の抗体のIPバッファIおよび10マイクログラムの300マイクロリットルのチューブに加える。ビーズ抗体混合物を一晩摂氏4度でヌテレーターで揺らします。現在、核ライセートの適切な量は、反復ごとに1ミリグラムのタンパク質入力のための低保持マイクロ遠心チューブにアリコートする。16,000回gで30分間にライセートを回転させ、上清を新しいチューブに移します。ベンゾナーゼを1マイクロリットル当たり250単位で1マイクロリットルで加え、核ライセートのミリグラム1ミリグラム、10~15分間、摂氏4度のヌケーターに岩石を加えます。ライセートを事前にクリアするためのビーズを調製するには、各タンパク質AとプロテインGビーズの12.5マイクロリットルを1.5ミリリットルの低保持チューブに加えます。プロテアーゼ阻害剤を用いてIP洗浄緩衝液Iで2回洗浄する。バッファーをデカントし、ビーズに調製された核ライゼートの1ミリグラムを追加します。摂氏4度で1時間、ヌテーターで揺れながらインキュベートします。1分間、1、500倍g、摂氏4度で予めクリアされたライセートを遠心分離する。次に、プロテアーゼ阻害剤で抗体プロテインAまたはGビーズをIPバッファーIで2回洗浄します。1、500倍g、摂氏4度で1分間遠心した後、バッファーをデカントします。今、抗体タンパク質AまたはGビーズに予めクリアされた核ライゼートを移す。摂氏4度で4時間揺れながらインキュベートします。インキュベーションに続いて、遠心分離機は1、500倍g、摂氏4度で1分間行う。上清を各複製の流れとしてラベル付けされた管に移します。プロテアーゼ阻害剤を用いて、抗体プロテインAまたはGビーズを1ミリリットルのIPバッファIIで4回洗浄します。次に、プロテアーゼ阻害剤で1ミリリットルのIPバッファーIでビーズを2回洗浄します。最後の洗浄後にすべてのバッファーが取り除かれていることを確認します。20マイクロリットルの0.1モルグリシンをpH2.75でヌテーターで30分間インキュベートすることにより、ビーズから溶出したタンパク質を溶出させる。その後、750倍gと摂氏4度で1分間回転し、上清からピペットを取り除きます。溶出バッファーをもう一度使用して、このインキュベーションを繰り返します。タンパク質ペレットを調製した後、30マイクロリットルのSDSアルキル化バッファーで再懸濁する。95°Cの熱ブロックでサンプルを5分間インキュベートします。その後、室温で15分間冷却します。各サンプルに300ミリリットルのUA溶液と30マイクロリットルの100ミリモルTCEPを加えます。30K遠心フィルターに溶液をロードします。遠心フィルターを室温で21,000回gで10分間回転させた後、フィルターに問題がある場合に流れを通し続ける。原稿に従ってフィルターを洗浄した後、0.1モルトリスpH 8.5に再懸濁したマイクロリットル1マイクログラムあたり1マイクログラムの3マイクロリットルを加える。フィルターを0.1モルトリスpH 8.5で100マイクロリットルのマークまで充填します。ヌテットを揺らしながら摂氏37度で1時間消化させます。次に、マイクロリットルMSグレードのトリプシンあたり1マイクログラムの1マイクロリットルを追加します。やさしく混ぜて、トリプシンがヌテーターで揺れながら摂氏37度で一晩サンプルとインキュベートできるようにします。午前中、21,000回gで複数回、20分間、フィルターからペプチドをクリーンな低保持マイクロ遠心チューブに溶出させた。C18スピンカラムを用いてペプチドを脱塩した後、凍結乾燥したペプチドを0.1%TFAの7マイクロリットルで5%アセトニトリルで再懸濁する。サンプルを3分間超音波処理してペプチドが再懸濁されたことを確認し、14,000倍gで10分間スピンダウンします。分析のために、サンプルの15~30%を液体クロマトグラフィー質量分析システムに負荷を加えます。本研究では、ビーズのみのコントロールを利用したHeLa核抽出物の5ミリグラムから三重免疫沈降を分析した。餌DYRK1Aは、実行されたIP-MS実験が信頼性の高い対照上の上位3つの濃縮タンパク質の中でランク付けされました。高信頼性インターアクターと95%以上の共精製タンパク質との間に明確な分離が示され、非特異的であると同定された。DYRK1A データセットの例では、IREF インタラクション パートナーは、制御に対する非常に低いエンリッチメントを表す 0.45 の低い FC-A 値を提示しました。したがって、これらの以前に報告されたインタラクションの多くは、FC-Aしきい値3を下回ることによって、このデータセット内の偽陰性です。各IREF相互作用の計算された絶対コピー数は、IP-MSによる相互作用パートナーの検出レベルとの相関関係を示さなかった。FC-Aを3より大きく、聖人を0.9より大きく組み合わせることで、高信頼インターアクターのリストが6つのタンパク質に減少しました。しかし、3つを超えるFC-Aカットオフを単独で適用すると、8つのタンパク質がネットワークに追加されました。このプロトコルの最も重要な部分は、免疫沈降のための抗体試薬の選択です。このワークフローを完了する前に、選択性のウェスタンブロットまたはクーマシーの検証をお勧めします。タンパク質とタンパク質相互作用の裏付けとなる証拠は、同定されたインターアクターのco-IPウェスタンブロッティングから得ることができる。タンパク質化学架橋は、より複雑であるが、インターアクターの相互作用ドメインを明らかにすることができる。この方法を用いて、私の研究グループは、哺乳類の脳の発達に必要なタンパク質キナーゼであるDYRK1Aの新しい機能を発見し、アルツハイマー病の神経病理学と結びついています。

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疾患における機能不全タンパク質間相互作用のマッピング

学ぶ ラベルフリー質量分析を用いた核タンパク質の免疫沈降法による、内因性タンパク質間相互作用の網羅的マッピング手法。この計算的手法は低発現タンパク質の相互作用解析に有用です。

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

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