χCRACを用いたin vivoでのタンパク質-RNA相互作用ダイナミクスの高時間分解能モニタリング

Kinetic CRACは、RNAとRNA結合タンパク質との間の時間的関連を前例のない短い時間スケールで研究するために使用できます。当社のクロスリンカーと組み合わせることで、Kinetic CRACは数秒で生細胞を架橋することができます。これにより、UV損傷応答が低減され、微細なスケール分解能での応力応答の研究が容易になります。

Kinetic CRACは非常に長いプロトコルであり、新規ユーザーにとっては難しい場合があります。さらに、RNAを扱うこと自体に課題があります。RNAの分解を防ぐためには、すべての溶液をろ過滅菌し、ピペットと実験台が清潔に保たれていることを確認する必要があります。

この方法を視覚的に示せるのは、一部の手順があまり直感的ではないため、非常に重要です。これには、細胞のUV架橋と回収、およびゲルからの架橋RNAの抽出が含まれます。溶液中の微生物に対してUV架橋を行うには、所望の培地3.5リットルに酵母を接種し、開始OD600が0.05になるまで、180rpmで連続振とうしながら摂氏30度で一晩培養します。

細胞が目的のODに達したら、500ミリリットルの培養物を直接Vari-X-linker架橋剤に注ぎ、254ナノメートルのUVを250ミリジュールで照射します。架橋後、真空ろ過装置を使用して細胞をろ過します。ろ過した細胞でメンブレンを巻き上げ、T0とラベル付けされた50ミリリットルの円錐管に入れます。残りの細胞を6つの異なるフィルターでろ過し、メンブレンを3リットルの予熱したストレス誘発培地に落とし、ピペットで50秒間激しく混合します。目的の時点で500ミリリットルの容量で細胞を架橋し続け、サンプルを摂氏マイナス80度で保存します。

接着細胞を架橋するには、細胞と一緒に石英培養皿を専用のトレイに移し、254ナノメートルのUVを300ミリジュール照射します。すぐに皿を氷の上に置きます。皿から成長培地を取り出し、10ミリリットルの氷冷PBSを追加します。細胞をこすり落として収集し、15ミリリットルの円錐管に移します。

次に、細胞を300 Gで遠心分離し、摂氏4度で5分間ペレット化します。PBSで細胞を洗浄した後、PBSを取り出し、細胞ペレットをドライアイスで急速冷凍します。必要に応じて、サンプルを摂氏マイナス80度で保存します。

遠心分離機を摂氏4度に設定し、溶出のためにサンプルごとに1.5ミリリットルのチューブを2列に準備します。ニッケルビーズでカラムをすばやく回転させて、ボイドボリュームを取り除きます。次に、溶出チューブの1列目にカラムを置き、200マイクロリットルの溶出バッファーを充填します。

2分後、カラムをすばやく回転させ、2列目のチューブに移します。次に、前に示したように溶出を繰り返します。終了したら、すべての溶出液を5ミリリットルのチューブに混ぜ合わせ、20ミリグラム/ミリリットルのグリコーゲンを2マイクロリットル加えます。

次に、100マイクロリットルのトリクロロ酢酸をサンプルに加え、30秒間ボルテックスします。サンプルをアセトンで洗浄した後、30マイクロリットルのタンパク質ローディングバッファーに再懸濁します。次に、ガイガーカウンターを使用して放射能を確認します。

サンプルを摂氏65度で10分間加熱し、1ミリメートルの4〜12%プレキャストBis-Trisゲルにロードします。MOPSバッファーで125ボルトでゲルを90分間泳動します。終了したら、ゲルをラップフィルムで包み、軽く密閉されたカセットの内側にテープで固定します。

ゲルを自動X線フィルムに露光した後、ゲルを覆っているラップを切り取り、ゲルを動かして画像をオフセットしないようにしてフィルムを現像します。フィルムをゲルの上に置き、目的のバンドを切り取ります。ゲルスライスを2ミリリットルのチューブに入れ、P1000ピペットチップで粉砕します。

次に、プロテイナーゼKバッファーとプロテイナーゼKを加え、激しく振とうしながら55°Cでサンプルをインキュベートします。プレキャスト6%TBEゲル上で、短いDNA断片の定量に適したラダーを使用して、100ボルトで1時間cDNAを泳動します。終了したら、ゲルを覆うのに十分なTBEを入れた液密容器に入れ、適量のSYBRセーフ色素を加えます。

ゲルを室温で15分間染色します。次に、SYBRを含むバッファーを新しいTBEと交換します。ジェルを静かに振って10分間洗います。

TBEを水気を切り、ゲルを透明なフォルダーに入れます。フォルダを適切なサイズにカットし、画像クオンツでゲルを画像化します。175〜400塩基対のDNA断片を切り取り、ゲル片を1.5ミリリットルのチューブに入れます。

P1000ピペットチップでゲルを粉砕し、400マイクロリットルの水を加えます。その後、振とうしながら摂氏37度で1時間インキュベートします。サンプルをドライアイスで10分間凍結します。

その後、摂氏37度でインキュベーションを繰り返します。チューブに入れたフィルターカラム内に2つのガラスマイクロファイバーフィルターを挿入します。次に、カットしたP1000ピペットチップを使用してTBEゲル懸濁液をフィルターユニットに移し、17, 000Gで30秒間スピンダウンします。

このプロトコルは、グルコース飢餓環境にさらされた酵母細胞におけるNrd1-RNA相互作用をモニターするために使用されました。サンプルは、グルコースを含まない培地に移行する前、および1分後、2分後、4分後、8分後、14分後、および20分後に架橋されました。実験のオートラジオグラフは、Nrd1の予想される分子量で強いシグナルを示し、シーケンシングに適さない短いラジオ標識RNAに結合したタンパク質を表しています。

このバンドより上のシグナルは、より長いRNAフラグメントに架橋されたタンパク質であり、単離されました。哺乳類細胞に対するキネティックCRACプロトコルを修正するために、接着細胞を皿にUV照射できる特別なステージが開発されました。このセットアップの効率は、安定してタグ付けされたGFP RBM7の架橋とキャプチャによって測定されました。

この架橋剤は、254ナノメートルのUV照射により、広く使用されているUV照射装置に匹敵する効率で、哺乳類細胞からタンパク質RNA複合体を回収することができました。架橋中の紫外線透過性石英ペトリ皿の開発により、タンパク質RNA複合体の回収がさらに促進されました。Nrd1のデータは、このタンパク質が多くの非コードRNA転写産物に結合することを示しており、これらの転写産物の分解に関与していることを示しています。

また、HXT6およびHXT7をコードする転写産物への結合も示されました。これらはどちらもグルコース飢餓時にアップレギュレーションされます。キネティックCRACは、細胞発生、ストレス応答、およびリボソームやスプライソソームなどの高分子複合体の集合におけるタンパク質RNA間の動的相互作用を測定することを可能にします。