患者の薬剤耐性を予測するための「生きた」前臨床プラットフォームとしての患者由来腫瘍エクスプラント

患者由来の外植は、患者の転帰を正確に予測できる即時の薬物応答データを提供する短期的な方法である。PDプラットフォームは、可能な限り地域腫瘍の病理学的および構造的特徴を反映した3Dコンテキストで薬物応答を調べることを可能にする。外植は、薬物の代謝と作用機序に関する新しい洞察を提供し、新しい薬力学的バイオマーカーの同定を容易にする可能性を秘めています。

実験を開始する前に、70%の産業メチル化スピリッツ溶液を備えたすべての手術器具を洗浄してください。氷の上に新鮮な媒体の25ミリリットルで10センチメートルの文化料理を埋めます。ピンセットを使用して、試料を歯科ワックス表面に移し、2つの皮膚移植片ブレードを使用して組織を約2〜3立方ミリメートルの断片にスライスする。

10センチメートル皿に外植を移し、室温で24時間インキュベーションのために10%非緩衝ホルマリン溶液を含む1ミリリットルチューブに組織の6〜9個を入れます。6つのウェルプレートの所望の数の井戸に、井戸あたり1.5ミリリットルの新鮮な媒体を充填します。そして、それが媒体の上に浮かぶように、各井戸にオルガノンティの文化の挿入皿を置きます。

各インサートディスクに6~9個の外植を置き、回収できるように5%の二酸化炭素インキュベーターで16時間のインキュベーションを保存します。翌日、新しいプレートの各ウェルに新鮮な媒体と薬を追加します。車両制御用の井戸を含めます。

すべての薬物治療が準備されたら、ピンセットを使用して、二酸化炭素インキュベーター内の24〜48時間のインキュベーションのために新しい6つのウェルプレートの各ウェルに1つのインサートを移します。薬物治療後、10%ホルマリンを含む新しい6つのウェルプレートにディスクを移す。そして、室温でインキュベーションの24時間の固定剤と完全なカバレッジを確保するために、各外植物の上部に10%ホルマリンの数滴を追加します。

翌日、70%の工業的メチル化溶液に適切な数の小さなヒストロジースポンジを浸します。そして、スポンジを占球カセットの中に入れる。すべてのスポンジが配置されたら、挿入されたディスクに接触する各外植の薬物処理側と一緒に単一のスポンジに同じ薬物治療条件からすべての外植物を移します。

各外植の上に別のあらかじめ浸したスポンジを置き、カセットを閉じてカセットの外植を固定します。その後、カセットを70%工業用メチル化溶液に沈め、組織学的処理を進めます。スキャン後、トレーニング分析を実行し、適切な分析ソフトウェアにトレーニング用のスタンプを含むスキャンをロードします。

シングルモードビューでは、画像をナビゲートし、分析するスキャンと蛍光を含むスキャンを選択します。単一のビューでの組み込みの蛍光スキャンで、自己蛍光ピッカーをクリックして、染色されていない組織の領域にセグメントを描画します。マーカーと色を編集をクリックし、各蛍光色素に関連付けられたボックスにマーカー名を入力します。

[画像の準備] をクリックして、ソフトウェアがアップロードされたすべての画像から固有蛍光の強度を差し引くようにします。画面の上部にあるセグメント組織ステップをクリックして、組織セグメンテーショントレーニングウィンドウを開きます。組織カテゴリパネルに、セグメント化する各組織カテゴリの名前を入力します。

[描画] をクリックして、対象の組織カテゴリのセルグループの周りに領域を描画します。次に、次の組織カテゴリに切り替え、新しい領域を描画します。すべてのトレーニング領域が定義されたら、トレーニング組織セテグメンタを使用し、トレーニング精度が落ち着くのを待ちます。

100%に近い値に対して、すべてのセグメントをクリックして組織をセグメント化します。組織のセグメンテーションの品質を確認した後、細胞のセグメンテーションをクリックし、セグメントに細胞コンパートメントを選択します。核成分を設定するには、通常の強度スライダを使用して、核のピクセルを検出するために使用されるしきい値を調整します。

ライブフィードバックはプレビューウィンドウで提供されます。核のピクセルのクラスターを分割するには、核コンポーネント分割パネルで、核の染色品質を最もよく表すボタンを選択し、スライダーバーを使用して分割感度を調整します。次に、[すべてのセグメント] をクリックして、すべてのイメージをセグメント化します。

すべての画像がセグメント化されたら、フェノタイプパネルで検出するフェノタイプのリストを追加し、対応するテキストボックスにフェノタイプの名前を入力します。[表現型の編集] をクリックして特定のセルを選択し、ドロップダウン メニューで対応する表現型を選択します。トレーニングの選択が完了したら、列車の分類器をクリックして、各表現型の結果を評価します。

すべてを表現型に進み、プロジェクトを保存してエクスポートをクリックします。バッチ分析タブを選択し、バッチアルゴリズムまたはプロジェクトボックスにプロジェクトをロードします。イメージと表をエクスポートするには、エクスポート オプションのすべてのボックスを選択し、[スライドの追加] をクリックして、前に準備したバッチのスタンプを含むすべてのイメージを読み込みます。

次に、[実行] をクリックして 1 つのスタンプのバッチ分析を開始し、取得した時点で対応するデータをエクスポートします。細胞生存率のマーカーに染色されたNSCLC外植組織の多スペクトルイメージングは、個々の細胞集団の同定および表現型化、ならびに外植腫瘍マイクロ環境内の腫瘍および間質成分の同定を可能にする。細胞生存性マーカーの組織および細胞のセグメンテーションは、多スペクトル画像を示すように、目的の薬物で治療された患者由来の外植物における細胞死および増殖を定量するために使用することができる。

例えば、この分析では、ニボルマブで治療された腫瘍からの組織サンプルにおいて、より多くの死細胞が、治療された腫瘍サンプルの対照と比較して同定された。また、図示したように、染色解剖から空間情報を抽出する機能により、セル間距離の計算が可能となる。また、エクスプラントは、サンプルの3D構造を維持しながら、何百ものバイオマーカーを補助解像度で同時にプロファイリングできる広範な空間プロファイリングまたは質量サイトメトリーにも使用できます。

PDは免疫療法の有効性を予測できる。例えば、免疫チェックポイント阻害剤に対して敏感または耐性のケースを区別し、この区別を支えるメカニズムを調査することが可能である可能性があります。