Name: 患者の薬剤耐性を予測するための「生きた」前臨床プラットフォームとしての患者由来腫瘍エクスプラント (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学ぶ患者由来腫瘍エクスプラントを用いた前臨床プラットフォームの構築法。3次元構造を保持したまま薬剤応答を評価し、がん治療における個別化医療とバイオマーカー発見に貢献する革新的アプローチです。

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私たちは、外科的切除腫瘍組織を提供してくれたレスターNHSトラスト大学病院の外科医と病理学者に感謝します。我々はまた、Vectra Polarisを使用したサポートのためのFFPE組織ブロックとキース・ストラートマンの組織処理および切除に関する支援をコアバイオテクノロジーサービス内の組織学施設に感謝します。この研究は、レスター大学、MRC毒物学ユニット、がん研究英国治療発見研究所、LifeArcの4つのパートナーで構成されるExplantコンソーシアムによって支援され、資金提供されました。CRUK-NIHRレスター実験がん医学センター(C10604/A25151)による追加サポートが提供されました。GM、CD、NAの資金は、ファイザーからの資金提供によって支援されている乳がんナウの触媒プログラム(2017NOVPCC1066)によって提供されました。

開示するものは何もない

本論文では、PEの生成、薬物治療、分析の方法を説明し、前臨床モデルシステムとしてのプラットフォームの利点を強調する。その脱構築を伴わない切除された腫瘍のex vivo培養は、腫瘍アーキテクチャ13、24、したがって、TMEにおける細胞成分の空間的相互作用ならびに腫瘍内不均一性の保持を可能にする。この方法は、腫瘍特異的マーカーを用いて、腫瘍組織の領域と間質の領域を識別し、したがってこれらのコンパートメント内で薬物応答を分離する方法を示す(図3)。さらに、複数のバイオマーカーを同時にプロファイリングして、例えばTME内の免疫細胞のオンターゲットの動きを評価することができる(図4)。
以前の出版物は、このPDEプラットフォームの適用を、治療化学療法の標準のためのNSCLC PEの階層化に、シスプラチン、化学感受性集団2...

効果的で安全な抗癌剤の開発には、予測および薬力学的バイオマーカーの同定を促進できる作用機序に関する洞察を提供できる適切な前臨床モデルが必要です。腫瘍間ヘテロジニティー1、2、3、4、5、TME 6、7、8、9、10、11、12は抗癌剤反応に影響を与える知られており、細胞株、オルガノイド、マウスモデルなどの多くの既存の前臨床癌モデルは、これらの重要な重要な特性を十分に収容できない顔立ち。「理想的な」モデルは、腫瘍内の非悪性細胞との悪性細胞の複雑な空間相互作用を再現し、腫瘍内の地域差を反映することができるモデルです。この記事では、これらの要件の多くを満たすことができる新しいプラットフォームとして、PE に焦点を当てています13.
ヒトPDEの使用の最初の例は、組織培養とも呼ばれ、ホフマンらが切除したばかりのヒト腫瘍のスライスを生成し、コラーゲンマトリックス14、15で培養した1980年代後半にさかのぼる。これには、組織アーキテクチャを保存する3D培養システムを確立し、TME内の間質成分および細胞相互作用の維持を保証する。元の腫瘍を分解することなく、Hoffman et al.16は翻訳研究の新しいアプローチを告げ、この時以来、多くのグループは、組織の完全性を維持し、正確な薬物応答データ17、18、19、20、21、22、23、24を生成することを目的として、異なる外植法を最適化してきましたプロトコル間の違いは明らかですが、試験体らはゼラチンスポンジの外植を培養し、標本20、21、25を通して栄養素や薬物の拡散を助けるのに対し、Majumderらは同じ患者由来の自家血清の存在下で腫瘍および間質タンパク質で構成されるマトリックスの上に外植物を培養することによって腫瘍生態系を作り出した。 23.
さらに最近では、我々のグループは、2〜3mm3サイズの部分に腫瘍の断片化によって外植物を生成するプロトコルを設定し、培養システム24の空気液体界面で透過性膜に追加の成分を置かずに配置する。これらの多数の研究を組み合わせることで、PEは、元の腫瘍の空間的アーキテクチャと地域の不均一性を保持するヒト腫瘍の無傷の生きた断片の培養を可能にすることが実証されている。オリジナルの実験では、 外植または組織培養は、通常、薬物治療に従ってホモジナイゼーションを行い、その後、組織培養薬応答アッセイ20、21、MTT(3-(6)-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)アッセイ、乳酸デヒドロゲン酵素アッセイ、またはレサズラジン-27ベースのサンプルに様々な生存率アッセイを適用した。.エンドポイント解析技術、特にデジタル病理の最近の進歩は、現在、外植29、30で行うことができるエンドポイントテストとアッセイのレパートリーを拡大しています。これらの新しい技術を応用するために、外植はホルマリンに固定され、パラフィン(FFPE)に埋め込まれ、免疫染色技術を用いて分析され、空間プロファイリングが可能になります。このアプローチの例は、非小細胞肺癌(NSCLC)、乳癌、大腸癌、および中皮腫外植物について文書化されており、それによって増殖マーカー、Ki67、およびアポトーシスマーカー、切断ポリADPリボーゼポリメラーゼ(cPARP)は、細胞増殖および死の変化を監視するために使用された。
多重化された免疫蛍光は、エンドポイント35での外植における薬物応答の空間プロファイリングに特に適している。例えば、薬物治療13、36、37、38のTME内で、マクロファージやT細胞などの特定のクラスの免疫細胞の再局在化と空間分布を測定し、治療剤が「冷たい腫瘍」から「ホット腫瘍」39への移行を支持できるかどうかを調べることができます。 .近年、このグループは、異なる腫瘍タイプ(NSCLC、腎癌、乳癌、大腸癌、黒色腫)からのPEの誘導と、化学療法、低分子阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)を含む様々な抗癌剤の試験に焦点を当てています。エンドポイント分析方法は、TMEの異なる構成要素のバイオマーカーと同様に、生存可能性のためのバイオマーカーの空間プロファイリングを可能にする多重化された免疫蛍光を含むように最適化されています。

<table><tbody><tr><td><強>酢酸</強></td><td>シグマ</td><td>320099</td><td>染色試薬</td></tr><tr><td><強>抗体希釈液/ブロック、1x</強></td><td>パーキンエルマー</td><td>ARD1001EA</td><td>抗体希釈液/ブロッキングバッファー</td></tr><tr><td><強>Barnstead NANOpure Diamond</td><td>Barnstead</td><td></td><td>Ultra Pure (UP) H2O machine</td></tr><tr><td>クエン酸一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7129</td><td>クエン酸バッファー用試薬</td></tr><tr><td>Costar Multiple Well Cell Culture Plates</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td>6 マルチウェルプレート</td></tr><tr><td>DAPI Dilactate</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>150350</td><td>組織培養用直径100 mmディッシュ</td></tr><tr><td>DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle 培地 + 4.5 g/L D-グルコース + 110 mg/mL ピルビン酸ナトリウム</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10569-010</td><td>組織培養培地 (500 mL)</td></tr><tr><td>DPX 封入剤</td><td>VWR</td><td>360294H</td><td>封入剤</td></tr><tr><td>DPX 封入剤</td><td>Merck</td><td>6522</td><td>封入剤</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>TEバッファー</td></tr><tr><td>用試薬Eosin</td><td>CellPath</td><td>RBC-0100-00A</td><td>Staining reagent</td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>組織培養用中</td></tr><tr><td><強>37% ホルムアルデヒド</強></td><td>フィッシャー (アクロス)</td><td>119690010</td><td>10% ホルマリン</td></tr><tr><td><強>iGenix、電子レンジ IG2095</td><td>iGenix</td><td>IG2095</td><td>抗原回収に使用されるマイクロ波</td></tr><tr><td><ストロング>インダストリアルメチル化スピリット (IMS)</ストロング</td><td>>ジェンタメディカル</td><td>199050</td><td>99% 工業変性アルコール (IDA)</td></tr><tr><td>InForm Advanced Image Analysis Software</td><td>アコヤバイオサイエンス</td><td>InForm</td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP3000 Tissue Processor</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Automated Vacuum Tissue Processor</td></tr><tr><td>Leica Arcadia H and C</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Embedding wax bath</td></tr><tr><td>Leica RM2125RT</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td></td><td>ロータリーミクロトーム</td></tr><tr><td><ストロング>ライカST4040 リニアステイナー</ストロング></td><td>ライカバイオシステムズ</td><td></td><td>H&E stainer</td></tr><tr><td>Mayer's ヘマトキシリン</ストロング>シ</td><td>グマ</td><td>GHS132-1L</td><td>染色試薬</td></tr><tr><td><ストロング>ミリセル細胞培養インサート、30 mm、親水性 PTFE、0.4 & micro;m</td><td>Merck Milipore</td><td>PICMORG50</td><td>Organotypic culture insert disc</td></tr><tr><td>Novolink Polymer Detection System</td><td>Leica Biosystems</td><td>RE7150-K</td><td>DAB staining kit</td></tr><tr><td>OPAL 480</td><td>アコヤバイオサイエンス</td><td>FP1500001KT</td><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)希釈剤</td></tr><tr><td><ストロング>オパール 520</ストロング></td><td>アコヤバイオサイエンス</td><td>FP1487001KT</td><td>ジメチルスルホキシド (DMSO) 希釈剤</td></tr> <tr><td><ストロング>オパール 570</ストロング></td><td>アコヤバイオサイエンス</td><td>FP1488001KT ジ</td><td>メチルスルホキシド (DMSO) ジメチルスルホキシド (DMSO) 希釈剤</td></tr><tr><td><ストロング>オパール 620</ストロング></td><td>アコヤバイオサイエンス</td><td>FP1495001KT</td><td>ジメチルスルホキシド (DMSO) 希釈剤</td></tr> <tr><td><ストロング>オパール 650</ストロング></td><td>アコヤバイオサイエンス</td><td>FP1496001KT</td><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)希釈剤</td></tr><tr><td><ストロング>オパール690</ストロング></td><td>アコヤバイオサイエンス</td><td>FP1497001KT</td><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)希釈液</td></tr><tr><td><ストロング>オパール780/オパールTSA-DIG試薬</ストロング></td><td>アコヤバイオサイエンス</td><td>FP1501001KT</td><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)希釈剤およびTSA-DIG試薬を含むフルオロフォア</td></tr><tr><td>Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x</td><td>Perkin Elmer</td><td>ARH1001EA</td><td>HRP polymer</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>11548876</td><td>組織培養培地での使用</td></tr><tr><td>PhenoChart ホールスライド Contextual Viewer</td><td>Akoya Biosciences</td> スキャン画像用<td>PhenoChart</td><td>Viewerソフトウェア</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>PBS</td></tr><tr><td>1x Plus Amplification Diluent</td><td>Perkin Elmer</td><td>FP1498</td><td>Fluorophore diluent</td></tr><tr><td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36961</td><td>封入剤</td></tr><tr><td>Slide キャリア</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>スライドをスライドキャリアホテルにロードして、Vectra Polaris</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3160/63</td><td>10% ホルマリン</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウムペレット</strong</td><td>>Fisher Scientific</td><td>S/4920/53</td><td>クエン酸バッファー用試薬</td></tr><tr><td>Tenatex Toughened Wax - ピンク (500 g)</ストロング></td><td>ケンデント</td><td>1-601</td><td>デンタルワックス表面</td></tr><tr><td><ストロング>サーモサイエンティフィック&nbsp;Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center</td><td>Fisher Scientific</td><td>10098889</td><td>Holder for slides and slide clips</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates</td><td>Fisher Scientific</td><td>11927774</td><td>スライドクリップ</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td>Reagent for TE buffer</td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vecta Laboratories</td><td>H-1000-10</td><td>埋込媒体</td></tr><tr><td>Vectra Polaris スライドスキャナー</td><td>Perkin Elmer</td><td>Vectra Polaris</td><td>スライドスキャナー</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>Genta Medical</td><td>XYL050</td><td>脱ワックス剤</td></tr></tbody></table>

患者の薬剤耐性を予測するための「生きた」前臨床プラットフォームとしての患者由来腫瘍エクスプラント

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

薬剤耐性の理解と高耐性癌を感作するための新しい戦略の開発は、患者の応答を正確に予測できる適切な前臨床モデルの入手可能性に依存しています。既存の前臨床モデルの欠点の1つは、ヒト腫瘍微小環境(TME)を文脈的に保存し、腫瘍内不均一性を正確に表す能力ができないことであり、したがって、データの臨床翻訳を制限する。対照的に、ヒト腫瘍の生きた断片の培養を表すことによって、患者由来の外植(PDE)プラットフォームは、元の腫瘍の病理学的および構造的特徴を可能な限り密接に反映する3次元(3D)コンテキストで薬物応答を検査することを可能にする。PdEsを用いた以前の報告では、化学抵抗性腫瘍と化学感受性を区別するプラットフォームの能力が文書化されており、この分離は同じ化学療法に対する患者の応答を予測することが示されている。同時に、PEは、薬物応答を予測する腫瘍の分子、遺伝的、および組織学的特徴を問い合う機会を可能にし、それによって患者の階層化のためのバイオマーカーおよび耐性腫瘍を感作するための新しい介入アプローチを同定する。本論文では、患者サンプルの収集からエンドポイント分析まで、PDEの方法論を詳細に報告する。それは、必要に応じて、特定の腫瘍のオーダーメイド条件を強調し、外植派生と培養方法の詳細な説明を提供します。エンドポイント解析では、腫瘍領域と間質領域の両方で主要なバイオマーカーの空間プロファイリングを行う多重化免疫蛍光とマルチスペクトルイメージングに焦点を当てています。これらの方法を組み合わせることで、様々な臨床病理学的パラメータに関連し、バイオマーカー同定に使用される可能性のある定量的および定性的な薬物応答データを生成することができる。

mIF染色された組織学的切片のマルチスペクトルイメージングにより、個々の細胞集団の同定とフェノタイピング、および外植TMEにおける腫瘍および間質成分の同定が可能である(図2)。マルチスペクトルイメージングは、自己蛍光シグナルを他のシグナルからデコンボルテージし、その後の分析から除外することができるため、コラーゲン含有量の高い組織など、高い内在性自己蛍光を有する組織の分析に特に有用である。その後のシリコ組織および細胞セグメンテーションでは、生細胞数(例えば、陽性率のパーセント)、シグナル強度、細胞サイズ、組織面積、および個々の細胞の空間位置を含むが、これらに限定されない多数の出力を有する薬物応答の定量化を可能にする。
従って組織および細胞のセグメンテーションは、薬物治療結果の定量的分析および腫瘍および間質特異的応答の同定に極めて有用である。例えば、Ki67とcPARPの染色は、腫瘍マーカーと一緒に、それぞれ外植で増殖および細胞死レベルの定量を可能にする(図3)。与え...

本論文では、患者に関連する生きた前臨床モデルシステムにおける腫瘍薬物反応を評価するための患者由来外植物の生成、薬物治療、分析の方法について説明する。

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

患者由来の外植は、患者の転帰を正確に予測できる即時の薬物応答データを提供する短期的な方法である。PDプラットフォームは、可能な限り地域腫瘍の病理学的および構造的特徴を反映した3Dコンテキストで薬物応答を調べることを可能にする。外植は、薬物の代謝と作用機序に関する新しい洞察を提供し、新しい薬力学的バイオマーカーの同定を容易にする可能性を秘めています。実験を開始する前に、70%の産業メチル化スピリッツ溶液を備えたすべての手術器具を洗浄してください。氷の上に新鮮な媒体の25ミリリットルで10センチメートルの文化料理を埋めます。ピンセットを使用して、試料を歯科ワックス表面に移し、2つの皮膚移植片ブレードを使用して組織を約2〜3立方ミリメートルの断片にスライスする。10センチメートル皿に外植を移し、室温で24時間インキュベーションのために10%非緩衝ホルマリン溶液を含む1ミリリットルチューブに組織の6〜9個を入れます。6つのウェルプレートの所望の数の井戸に、井戸あたり1.5ミリリットルの新鮮な媒体を充填します。そして、それが媒体の上に浮かぶように、各井戸にオルガノンティの文化の挿入皿を置きます。各インサートディスクに6~9個の外植を置き、回収できるように5%の二酸化炭素インキュベーターで16時間のインキュベーションを保存します。翌日、新しいプレートの各ウェルに新鮮な媒体と薬を追加します。車両制御用の井戸を含めます。すべての薬物治療が準備されたら、ピンセットを使用して、二酸化炭素インキュベーター内の24〜48時間のインキュベーションのために新しい6つのウェルプレートの各ウェルに1つのインサートを移します。薬物治療後、10%ホルマリンを含む新しい6つのウェルプレートにディスクを移す。そして、室温でインキュベーションの24時間の固定剤と完全なカバレッジを確保するために、各外植物の上部に10%ホルマリンの数滴を追加します。翌日、70%の工業的メチル化溶液に適切な数の小さなヒストロジースポンジを浸します。そして、スポンジを占球カセットの中に入れる。すべてのスポンジが配置されたら、挿入されたディスクに接触する各外植の薬物処理側と一緒に単一のスポンジに同じ薬物治療条件からすべての外植物を移します。各外植の上に別のあらかじめ浸したスポンジを置き、カセットを閉じてカセットの外植を固定します。その後、カセットを70%工業用メチル化溶液に沈め、組織学的処理を進めます。スキャン後、トレーニング分析を実行し、適切な分析ソフトウェアにトレーニング用のスタンプを含むスキャンをロードします。シングルモードビューでは、画像をナビゲートし、分析するスキャンと蛍光を含むスキャンを選択します。単一のビューでの組み込みの蛍光スキャンで、自己蛍光ピッカーをクリックして、染色されていない組織の領域にセグメントを描画します。マーカーと色を編集をクリックし、各蛍光色素に関連付けられたボックスにマーカー名を入力します。[画像の準備] をクリックして、ソフトウェアがアップロードされたすべての画像から固有蛍光の強度を差し引くようにします。画面の上部にあるセグメント組織ステップをクリックして、組織セグメンテーショントレーニングウィンドウを開きます。組織カテゴリパネルに、セグメント化する各組織カテゴリの名前を入力します。[描画] をクリックして、対象の組織カテゴリのセルグループの周りに領域を描画します。次に、次の組織カテゴリに切り替え、新しい領域を描画します。すべてのトレーニング領域が定義されたら、トレーニング組織セテグメンタを使用し、トレーニング精度が落ち着くのを待ちます。100%に近い値に対して、すべてのセグメントをクリックして組織をセグメント化します。組織のセグメンテーションの品質を確認した後、細胞のセグメンテーションをクリックし、セグメントに細胞コンパートメントを選択します。核成分を設定するには、通常の強度スライダを使用して、核のピクセルを検出するために使用されるしきい値を調整します。ライブフィードバックはプレビューウィンドウで提供されます。核のピクセルのクラスターを分割するには、核コンポーネント分割パネルで、核の染色品質を最もよく表すボタンを選択し、スライダーバーを使用して分割感度を調整します。次に、[すべてのセグメント] をクリックして、すべてのイメージをセグメント化します。すべての画像がセグメント化されたら、フェノタイプパネルで検出するフェノタイプのリストを追加し、対応するテキストボックスにフェノタイプの名前を入力します。[表現型の編集] をクリックして特定のセルを選択し、ドロップダウン メニューで対応する表現型を選択します。トレーニングの選択が完了したら、列車の分類器をクリックして、各表現型の結果を評価します。すべてを表現型に進み、プロジェクトを保存してエクスポートをクリックします。バッチ分析タブを選択し、バッチアルゴリズムまたはプロジェクトボックスにプロジェクトをロードします。イメージと表をエクスポートするには、エクスポート オプションのすべてのボックスを選択し、[スライドの追加] をクリックして、前に準備したバッチのスタンプを含むすべてのイメージを読み込みます。次に、[実行] をクリックして 1 つのスタンプのバッチ分析を開始し、取得した時点で対応するデータをエクスポートします。細胞生存率のマーカーに染色されたNSCLC外植組織の多スペクトルイメージングは、個々の細胞集団の同定および表現型化、ならびに外植腫瘍マイクロ環境内の腫瘍および間質成分の同定を可能にする。細胞生存性マーカーの組織および細胞のセグメンテーションは、多スペクトル画像を示すように、目的の薬物で治療された患者由来の外植物における細胞死および増殖を定量するために使用することができる。例えば、この分析では、ニボルマブで治療された腫瘍からの組織サンプルにおいて、より多くの死細胞が、治療された腫瘍サンプルの対照と比較して同定された。また、図示したように、染色解剖から空間情報を抽出する機能により、セル間距離の計算が可能となる。また、エクスプラントは、サンプルの3D構造を維持しながら、何百ものバイオマーカーを補助解像度で同時にプロファイリングできる広範な空間プロファイリングまたは質量サイトメトリーにも使用できます。PDは免疫療法の有効性を予測できる。例えば、免疫チェックポイント阻害剤に対して敏感または耐性のケースを区別し、この区別を支えるメカニズムを調査することが可能である可能性があります。

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