収穫と分解:バイオフィルム法研究における見過ごされたステップ

これらの手順の全体的な目標は、再現性を高めるために、最適な方法でバイオフィルムを収穫および分解することです。このビデオでは、3つのテクニックが実証され、それぞれが異なる表面タイプからの収穫と分解に焦点を当てています。このビデオは、CDCバイオフィルム反応器からのポリカーボネートクーポンなどの硬い非多孔質表面からバイオフィルムをボルテックスおよび超音波処理するための適切な技術を実証します。

第二に、ドリップフローリアクターで一般的に見られる硬質非多孔質ホウケイ酸ガラス表面のバイオフィルムの掻き取りおよび均質化である。そして3つは、カテーテルモデルに一般的に見られる多孔質シリコーンチューブ表面からのバイオフィルムの掻き取り、ボルテックス、および超音波処理である。こんにちは、私の名前はケリーバッキンガムマイヤーここで標準化されたバイオフィルムメソッドラボです。

私たちの研究室では、バイオフィルム法を成長、治療、サンプリング、分析の4つの要素に分けています。査読済みの文献では、バイオフィルムがどのようにサンプリングまたは採取され、表面から分解されるかの詳細は、典型的にはまばらである。これがこのビデオの理由です。

私たちの研究室では標準化されたバイオフィルム法を開発および試験しているため、最も一般的な3つのバイオフィルム採取および分解方法が同定された広範な文献レビューを実施しました。これらの方法は、ポリカーボネートクーポンからのバイオフィルムのボルテックスおよび超音波処理、ホウケイ酸ガラスクーポンからのバイオフィルムの掻き取りおよび均質化、ならびにシリコーンチューブからのバイオフィルムの掻き取り、ボルテックスおよび超音波処理である。紙に書かれた方法は強力ですが、同僚のLindsey Millerと私が提示した技術的な詳細を含むビデオが役立つことを願っています。

開始するには、ASTM標準E2562に従って成熟緑膿菌15442バイオフィルムを成長させ、CDCバイオフィルムリアクターを用いて高剪断および連続流で成長させた緑膿菌バイオフィルムの定量のための標準試験方法。48時間の成長期間の終わりに、ASTM標準E2871に従ってクーポンを処置し、サンプルクーポンを準備し、CDCバイオフィルムリアクターで成長したバイオフィルムに対する消毒剤の有効性を決定するための標準試験方法をシングルチューブ法を用いて行う。次に、オートクレーブ処理されたスプラッシュガードを、火炎滅菌された鉗子を使用して滅菌された50ミリリットルの円錐形チューブに無菌的に挿入します。

治療を受けるすべてのチューブについて繰り返します。コントロールクーポン用のチューブにはスプラッシュガードは必要ありません。CDCバイオフィルム反応器からロッドを無菌的に取り出し、30ミリリットルの滅菌希釈水ですすいでください。

これにより、バイオフィルムから緩く付着した細胞が除去されます。ロッドをベンチトップと平行に、スプラッシュガード付きのサンプルチューブの上に保持します。火炎滅菌されたアレンレンチを使用して、止めネジを緩め、バイオフィルムコーティングされたクーポンをチューブに落とします。

希望数のクーポンについて繰り返します。スプラッシュガードを取り外し、スプラッシュガードを別の容器に入れて滅菌します。5ミリリットルの血清学的ピペットを用いて、液体がチューブの壁の内側を流れ落ちるようにチューブに4ミリリットルの処理または制御をゆっくりとピペットする。

クーポンの下の気泡が変位するようにチューブの底を静かに旋回させます。各追加の間に 30 ~ 60 秒かかります。指定された接触時間の終わりに、処置または対照が適用されたのと同じ順序で36ミリリットルの中和剤をチューブにピペットで入れた。

各チューブを最高設定で30プラスマイナス5秒間渦巻き、完全な渦が達成されることを確認します。浴中の水位がチューブ内の水位に等しくなるように、脱気超音波装置に懸濁されたチューブラックにチューブを置きます。45キロヘルツ、100%パワー、および30プラスマイナス5秒間の通常の機能でサンプルを超音波処理します。

渦と超音波処理サイクルを繰り返し、5サイクルの合計のために、最終的な渦で終了します。最後に、サンプルを連続希釈し、希釈液をR2A寒天培地にプレートし、プレートを摂氏36度で24時間インキュベートする。めっき方法に合わせてコロニーをカウントし、データを記録します。

この次のバイオフィルム採取および分解技術は、ドリップフローリアクターの標準である硬質非多孔質クーポンに有用である。低剪断および連続流を有するドリップフローバイオフィルム反応器を用いて成長させた緑膿菌バイオフィルムの定量のための標準試験方法をASTM標準E2647に従って成熟緑膿菌15442バイオフィルムを増殖させる。サンプリングボード、ビーカー内の95%エタノール、アルコールバーナー、止血剤、クーポン除去ツール、滅菌希釈水を含むビーカー、クーポンをすすぐための希釈チューブを含むようにサンプリングステーションを設定します。

ポンプの電源を切り、チャンネルカバーを取り外し、滅菌クーポン取り外しツールと止血剤を使用してクーポンを取り出し、バイオフィルムを乱さないように注意してください。50ミリリットルの遠沈管に含まれる45ミリリットルの滅菌希釈水に液体の動きで静かに浸漬してクーポンをすすぎます。すぐにモーションを逆にしてクーポンを削除します。

クーポンを45ミリリットルの滅菌希釈水を入れたビーカーに入れます。バイオフィルムで覆われたクーポン表面を下方向に滅菌ヘラまたはスクレーパーを用いて約15秒間こすります。ヘラまたはスクレーパーをビーカーでかき混ぜてすすいでください。

掻き取りとすすぎのプロセスを3〜4回繰り返して、クーポン表面を完全に覆うようにします。クーポンを滅菌ビーカーの上に60度の角度で保持し、クーポンの表面に1ミリリットルの滅菌希釈水をピペッティングして、クーポンをすすぎます。合計5回のすすぎを繰り返します。

ビーカーの最終容量は現在50ミリリットルです。バイオセーフティキャビネットで作業し、掻き取ったバイオフィルムサンプルを均質化します。滅菌ホモジナイザープローブをホモジナイザーに取り付けます。

プローブチップを液体に入れ、ホモジナイザーをオンにして、最大20,500RPMまでランプします。サンプルを30秒間均質化します。RPMを下げ、ホモジナイザーの電源を切ります。

上記のように9ミリリットルの滅菌希釈ブランクを20、500RPMで30秒間ホモジナイズすることによって、バイオフィルムサンプル間のプローブを消毒する。70%エタノールの9ミリリットルのチューブを30秒間ホモジナイズし、プローブを取り外してエタノールチューブに1分間放置します。2つの追加の希釈ブランクを均質化する。

また、滅菌使い捨てホモジナイザープローブを各試料に用いてもよい。均質化したサンプルを段階的に希釈し、適切なめっき方法を使用して希釈液をR2A上にプレートし、プレートを摂氏36度で24時間インキュベートする。コロニーをカウントし、データを記録します。

この最終的なバイオフィルム採取および脱凝集技術は、カテーテルモデルで使用されるシリコーンチューブのような多孔質チューブでバイオフィルム成長に有用である。この手順を開始するには、シリコーンカテーテルチューブで成熟した大腸菌53498バイオフィルムを成長させます。すすぎ管、滅菌遠心管、空の滅菌ペトリ皿、火炎滅菌されたステンレス鋼止血剤、はさみ、タイマー、定規などのサンプリング材料を準備します。

ポンプを一時停止した状態で、70%エタノールを使用してチューブの外側を清掃します。コネクタに取り付けられた領域を避けて端から 2 cm を測定し、チューブにマークを付けて切断位置を決定します。火炎滅菌されたはさみで、2センチメートルのマークでチューブを切断します。

チューブセグメントをすすぎ、プランクトン細胞を除去します。火炎滅菌鉗子を使用して、チューブセグメントを20ミリリットルの滅菌希釈水に静かに浸漬し、直ちに除去する。セグメントを10ミリリットルの中和剤に入れます。

火炎滅菌された鉗子では、チューブセグメントを保持し、チューブの内側のすべての領域がこすり落とされるまで、滅菌された木製のアプリケータースティックでこすります。時折、スティックを10ミリリットルの中和剤ですすぎ、セグメントをサンプルチューブに戻します。削り取られたチューブセグメントは、10 から 0 またはゼロの希釈になります。

各チューブを最高設定で30プラスマイナス5秒間渦巻きます。浴中の水位がチューブ内の液体レベルに等しくなるように、超音波処理器浴中に懸濁されたチューブラックにチューブを置く。45キロヘルツ、100%パワー、および30プラスマイナス5秒間の通常の機能で超音波処理します。

この渦と超音波処理サイクルを繰り返し、最終的な渦で終わります。サンプルを緩衝水で段階的に希釈する。適切なプレーティング方法を用いてトリプシン大豆寒天上にプレートし、次いでチューブを摂氏36プラスまたはマイナス2°Cで24時間インキュベートする。

使用しためっき方法に合わせてコロニーを適宜カウントし、データを記録して算術平均を計算します。ダニエル・オアとブレイン・フリッツが撮影したこれら4つの画像はすべて、この収穫と分解の手順の重要性を説明するのに役立ちます。これらの4つのクーポンはすべてクリスタルバイオレットで染色され、渦および超音波処理プロセスの前後にクーポン上に存在する緑膿菌バイオフィルムの量を視覚化するのを助けた。

クーポンAはバイオフィルムで完全に覆われていますが、クーポンB、C、Dはすべて表面にバイオフィルムがかなり少ないです。クーポンB、C、およびDはすべて、前述のボルテックスおよび超音波処理プロセスに供された。Lindsey Millerが共焦点顕微鏡で撮影したこれら2つの画像は、12.5倍の倍率で、バックライトのライブ/デッドステインで処理された緑膿菌バイオフィルムを描いています。

左側の画像は45キロヘルツと10%パワーで超音波処理され、右側の画像は45キロヘルツと100%パワーで超音波処理されました。明らかに、左側のクーポンは、右側のクーポンと比較して、表面にはるかに多くのバイオフィルムが残っています。この最終図は、異なる超音波処理パラメータの操作がクーポン表面から除去された緑膿菌バイオフィルムの量にどのように影響するかを示しています。

これらのクーポンはすべて、45キロヘルツ、100%パワーで超音波処理され、通常の設定で30プラスマイナス5秒間超音波処理されました。これらの画像は、リンジー・ミラーによって12.5倍の倍率で撮影されました。行1のクーポンは希釈水中で超音波処理され、列2のクーポンはDE中和ブロスで超音波処理されました。

希釈水と比較して界面活性剤を含むDEブロスで超音波処理されたクーポンに残っているバイオフィルムが少ないようです。クーポンA、B、E、およびFはすべて10ミリリットルの体積で超音波処理され、クーポンC、D、GおよびHは40ミリリットルの溶液中で超音波処理された。より小さなボリュームで超音波処理されたクーポンには明らかに少ないバイオフィルムがあります。

クーポンA、C、E、およびGは、一度に3本のチューブで浴中で超音波処理され、クーポンB、D、F、およびHは、一度に12本のチューブを有する浴中で超音波処理された。より少ないチューブで超音波処理されたサンプルは、優れたバイオフィルム収穫を示したようである。最終的に、チューブ内の体積を最小限に抑え、一度に超音波処理されたチューブの数を減らし、DE中和ブロスを使用することはすべて、バイオフィルムハーベスティングの強化に寄与するようです。

バイオフィルムを収穫して分解する完璧な方法はありませんが、いくつかのアプローチは異なる表面および/または用途に適しています。このビデオで紹介されているテクニックは、文献レビューによると最も一般的な3つの方法です。これら3つの手法は、研究者の出発点となります。

選択した収穫方法と分解方法を検証するために時間をかけることが重要です。すべての機器が微妙に異なるため、方法が標準化されていても、使用する機器のプロセスを確認することは賢明です。研究は、不適切な選択が偏ったテスト結果につながる可能性があることを示しています。

このビデオを見た後、この情報は、研究者がどの方法を使用するかについてより多くの情報に基づいた決定を下し、3つの表面タイプの再現性の向上と補完的な収穫および分解技術に関するガイダンスを提供するのに役立つことを願っています。