Name: 虚血再灌流後のデジタルマクロ写真のためのげっ歯類の心臓および脳組織の準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 学ぶ虚血再灌流後のげっ歯類心臓・脳組織の標準的なスライス作成と染色法。メチレンブルーとトリフェニルテトラゾリウム塩化物を用いた高解像度デジタルマクロ写真撮影技術を確立し、梗塞サイズの平面計測分析を正確に行う方法を解説します。

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著者らは、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムによって、助成金契約No 857394、Project FAT4BRAINの支援を受けました。

実験手順は、欧州共同体のガイドラインおよび現地の法律および方針(指令2010/63/EU)に従って実施され、すべての手順はラトビアのリガの食品獣医局によって承認されました。
1.心臓の染色とスライス
注:このプロトコールに記載される技術は、ランゲンドルフ灌流単離ラットまたはマウス心臓6,7およびin vivoラット心臓IR傷害アッセイ8,9,10,11の両方の後に使用することができる。in vivo IR傷害アッセイ後の染色のために、心臓を切除し、カニューレに装着し、ランゲンドルフ灌流モードで短時間灌流すると仮定される。
<ol><li>クレブス・ヘンゼライト溶液で満たされたシリンジから心臓カニューレを取り外し、クレブス・ヘンゼライト溶液中の0.1%メチレンブルーの温かい(37°C)溶液で満たされたシリンジに接続する。ラットの心臓には5 mLのシリンジを使用し、マウスの心臓には1〜2 mLのシリンジを使用してください。 注:代替案は、圧力制御または流量制御(例えば、ランゲンドルフ)装置を青色染料含有溶液で充填することである。剥離および装着手順の間、カニューレに気泡を残さず、冠状動脈再閉塞に使用される縫合糸を緩めないことが不可欠である。</li>
	<li>さらに、ラットの心臓に4mLのメチレンブルー溶液を〜4mL/分の速度で灌流し、マウスの心臓に1mLのメチレンブルー溶液を〜0.5〜1mL/分の速度で灌流する。 注:経験に基づいて、両方の技術は安全で、適切な染色を提供します。しかし、圧力制御ポンプ/静水圧システムを使用することは、初心者の科学者にとって、より時間がかかりますが、過汚染に対するより安全な選択肢です。</li>
	<li>カニューレをシリンジから外し、カニューレから心臓を取り外します。</li>
	<li>ティッシュペーパー上の心臓の穏やかな転がりによって余分なメチレンブルーを除去する。止血鉗子を開き、余分なメチレンブルーを除去した後にのみ外科用縫合糸からプラスチックチューブを取り外すことによって、冠状動脈の周りの結紮を緩める。 注:この段階では、マウス心臓を小さなビニール袋または冷凍庫(-20°C)内の5mL遠心分離機マイクロチューブに最大5〜10分間入れることができます。最大凍結時間は、各実験室で実験的に決定する必要があります。マウスの心臓を短期間凍結すると、初心者の実験者がそれを厚さ1mmのスライスに切るのに役立ちます。ラットの心臓の凍結はお勧めできません。-20°Cで10分以上過凍結することは避けなければなりません。</li>
	<li>染色されたラット心臓をステンレス鋼マトリックス( 材料表を参照)に置き、心臓スライスを行います(図1A)。次に、心臓の心室を厚さ2mmのスライスに切断する(成体ラット心臓の6〜7スライスを目指す)。マウスの心臓の場合は、心臓の心室を厚さ1.5mmのスライスに切断します(大人のマウスの心臓の少なくとも4つのスライスを目指してください)。 メモ:スライスマトリックス互換のカミソリの刃を使用する必要があります。一般に、互換性のある片縁カミソリの刃(例えば、最大0.01インチ(0.254mm)の厚さ)は、ラット心臓をスライスするために使用することができる。両刃のカミソリの刃は一般的にマウスの心臓に使用され、通常、厚さは最大0.004インチ(0.1mm)です。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig01.jpg"> 図1:ラット心臓および脳スライスのための行列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<ol start="6"><li>切断後、スライスを15mLのプラスチックチューブに移す。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解した5mLの1%トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)を心臓切片とともにチューブに加え、37°Cのウォーターバス中で10分間インキュベートした。</li>
	<li>TTC溶液中でインキュベートした後、心臓スライスをPBSで少なくとも2〜3回洗浄し、画像キャプチャの準備をする。</li>
</ol>2. 脳の染色とスライス
<ol><li>中大脳動脈閉塞実験3,12の後、頭蓋骨から脳幹を含む脳を取り出し、氷冷PBSで洗浄する。</li>
	<li>動物の体重に応じて、脳ステンレス鋼マトリックスの正しいサイズ( 材料表を参照)を選択します(図1B)。腹側を上にして脳を脳マトリックスに置きます。 注:マトリックスに座るとき、脳の腹面はカビの上面に平行でなければなりません。</li>
	<li>刃物を使用して、脳の前頭部と尾部(両側から2枚の刃)を制限します。 メモ:スライスマトリックス互換のカミソリの刃を使用する必要があります。一般に、互換性のあるシングルエッジカミソリブレード(最大0.01インチ(0.254mm)の厚さ)をラット脳スライスに使用することができます。</li>
	<li>刃を部分的に(脳を完全に切断するのではなく)最初と最後の刃の間のチャネルに入れます。すべての刃を挿入して平行に配置したら、すべての刃を同時に手のひらで押し下げて、脳を2mmの冠状スライスに切断します。</li>
	<li>2本の指で側面に沿ってしっかりと刃をつかみ、スライスした脳と一緒にマトリックスから取り除きます。</li>
	<li>脳スライスをトレイ(70mL、72 x 72 mm)に1つずつ配置します。スライスを配置するときは、各スライスの前面が常に上を向いていることを確認してください。</li>
	<li>PBS中の温かい(+37°C)1%TTC溶液を脳スライスに注ぎ、暗所で37°Cで8分間インキュベートする。 注:脳スライスは、インキュベーション中にTTC溶液に完全に浸漬する必要があります。</li>
	<li>1%TTC溶液中でインキュベーションした後、脳スライスを青色のプラスチックトレイに移して画像をキャプチャする。脳のスライスを前頭部から尾部まで順に並べ、メスを使って矢状面の半球を分離します。 メモ:トレイの表面は、洗濯可能で、マットで、脳のスライスと対照的な色(赤、白、淡いピンクではない)にする必要があります。</li>
</ol>3. マクロ写真
<ol><li>染色直後の組織スライスを写真撮影する。 注:心臓スライスは、冷たいPBS(+ 4°C)またはホルマリン溶液に最大30分間保存することができます。脳スライスは、長期間(1〜2週間)ホルマリンで保存することができる。</li>
	<li>充電済みのバッテリ、メモリカード、および取り付けられたレンズをスタンドに取り付けて、選択したカメラをセットアップします(図2)。 メモ:画像取得の少なくとも5〜10分前にライトをオンにして、機器をウォームアップしてください。LEDライトはマイクロ秒で完全な明るさに達します。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig02.jpg"> 図2:マクロ撮影用にセットアップされたカメラとライト カメラは、カメラの焦点面がサンプルに対して平行であることを確認するために、撮像面に対して垂直である。略称:LED =発光ダイオード。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<ol start="3"><li>使用可能な光源に応じて、カメラのマニュアルの指示に従って、適切なホワイトバランス設定を選択するか、色温度のキャリブレーションを実行します。 注:白色LEDライト(色温度6,500 K)は、蛍光灯による光のちらつきを避けるために好ましい光源です。</li>
	<li>カメラをフルマニュアルモードに切り替え、ISO 100と絞りをf / 10に設定し、最適な画像露出のためにシャッタースピードを調整します。カメラの焦点面がサンプルを配置する面に平行であることを確認します。 メモ:ヒストグラム機能は、組織スライスが露出しすぎないようにするのに役立ちます。</li>
	<li>有線または無線のリモートトリガーを接続または有効にして、シャッターを切ったときの手ぶれを防ぎます。 メモ:別の方法として、トリガーボタンを押した後にトリガーを2秒または10秒遅らせる遅延シャッター機能を有効にすることもできます。</li>
	<li>心臓のスライスをPBSの入った容器に完全に浸します。 メモ: 浸漬スライドは、その位置から離れて浮かぶ傾向があります。スライスの浮きを最小限に抑えるには、すべてのスライスが収まる最小のトレイと最小限の浸漬溶液を使用して、試料が完全に浸漬されるようにします。代替の方法は、スライスをスライドガラスの間に配置すること、またはレンズ上の偏光フィルターを使用することを含む。レンズに円偏光フィルターを取り付け、カメラのライブビューディスプレイの反射が消えるまで回転させます。</li>
	<li>脳のスライスをPBSまたは他の液体を含まない乾燥トレイに並べる。 注:偏光フィルターは、脳スライスの画像をキャプチャするのに非常に便利です。</li>
	<li>スライスの入ったコンテナをマクロレンズでカメラの下に置き、すべてのスライスが視野に完全に収まるようにします。スライスが同じ平面上にあること、つまり湾曲したり転がったりしていないことを確認します。</li>
	<li>露出を確認し、必要に応じてカメラの設定を調整します。 注: 一度設定したら、実験中は露出やその他の設定を変更しないでください。</li>
	<li>サンプルの数(または他の識別)をキャプチャし、リモートトリガーを使用して組織スライスを画像化します。 注: mm 定規などのサイズマーカーは、試料サイズの絶対定量化が必要な場合は、視野に含める必要があります。</li>
	<li>スライスを回転させ、反対側から画像をキャプチャします。</li>
</ol>

<ol><li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+the+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li>
<li>Botker, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+rigor+and+reproducibility+in+preclinical+and+clinical+studies+on+cardioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection.</a> Basic Research in Cardiology. 113 (5), 39(2018).</li>
<li>Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischemia+model+by+endovascular+suture+occlusion+of+the+middle+cerebral+artery+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e1978(2011).</li>
<li>Zvejniece, L., Svalbe, B., Liepinsh, E., Pulks, E., Dambrova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensorimotor+and+cognitive+deficits+in+rats+following+90-+and+120-min+transient+occlusion+of+the+middle+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The sensorimotor and cognitive deficits in rats following 90- and 120-min transient occlusion of the middle cerebral artery.</a> Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 197-204 (2012).</li>
<li>Liepinsh, E., Kuka, J., Dambrova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+digital+macro+photography+for+image+acquisition+and+the+analysis+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting digital macro photography for image acquisition and the analysis of biological samples.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 98-106 (2013).</li>
<li>Kolwicz, S. C., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiac+function+and+energetics+in+isolated+mouse+hearts+using+31P+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069(2010).</li>
<li>Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+assessment+of+ischemia-reperfusion+injury+in+Langendorff-perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52908(2015).</li>
<li>Liepinsh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+L-carnitine+biosynthesis+and+transport+by+methyl-gamma-butyrobetaine+decreases+fatty+acid+oxidation+and+protects+against+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of L-carnitine biosynthesis and transport by methyl-gamma-butyrobetaine decreases fatty acid oxidation and protects against myocardial infarction.</a> British Journal of Pharmacology. 172 (5), 1319-1332 (2015).</li>
<li>Nakamura, K., Al-Ruzzeh, S., Ilsley, C., Yacoub, M. H., Amrani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+effect+of+cerivastatin+on+cardiac+regional+ischemia+in+a+rat+model+mimicking+off-pump+coronary+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Surgery%22%5BJournal%5D)">Acute effect of cerivastatin on cardiac regional ischemia in a rat model mimicking off-pump coronary surgery.</a> Journal of Cardiac Surgery. 20 (6), 507-511 (2005).</li>
<li>Li, Q., Morrison, M. S., Lim, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+cardiac+anchor+to+refine+myocardial+infarction+surgery+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Using a cardiac anchor to refine myocardial infarction surgery in the rat.</a> Lab Animal. 39 (10), 313-317 (2010).</li>
<li>Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction in rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2464(2011).</li>
<li>Vavers, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroprotective+effects+of+R-phenibut+after+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The neuroprotective effects of R-phenibut after focal cerebral ischemia.</a> Pharmacological Research. 113, Pt B 796-801 (2016).</li>
<li>Acin-Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+measure+mitochondrial+respiration+in+frozen+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples.</a> EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).</li>
<li>Kloner, R. A., Darsee, J. R., DeBoer, L. W., Carlson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+pathologic+detection+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early pathologic detection of acute myocardial infarction.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 105 (8), 403-406 (1981).</li>
</ol>

著者らは、利益相反はないと宣言している。

IR後の心臓の準備は、血液心臓動脈の再閉塞および非リスク領域からのリスク領域の識別のための青色色素の灌流から始まる。メチレンブルーまたはエバンスブルー染料は、この目的のために最も頻繁に使用されます2。過度に高い圧力は心臓弁を損傷し、したがって、リスクのある領域を部分的または完全に染色する可能性があるため、ランゲンドルフ装置または静水圧システム搭載シリンジまたはポンプの簡略化されたバージョンなどの圧力制御システムで心臓を灌流する方がよい。制御された灌流は生理学的圧力を確保し、色素は通常心臓の閉塞領域に入らない。流速制御技術と圧力制御技術の両方が、オーバーステインに対する保護手段です。
生存可能な組織処理における最も重大な間違いの1つは、染色前に組織を長期間冷凍庫に保管することです。凍結は、研究者がIR実験の翌日以降に心臓染色を行いたいため、主に使用されています。さらに、凍結は心臓の切断を容易にするために使用されます。我々は、心臓を5〜10分間まで短期間凍結することは、心臓組織の完全性に無視できるほど影響し、組織(特にマウス心臓の場合)を薄いスライスに切断することを容易にすることを見出した。しかし、長期間凍結すると膜が損傷し、細胞の生存率とミトコンドリア機能が低下します13。その結果、機能しているミトコンドリアのTTC染色が冒され、壊死組織と生存組織の境界がほとんど線引きされない(ぼやけている)。全体として、ラットハートの凍結は避けるべきであり、マウスの心臓の短期的な凍結のみがより簡単な切断のために使用することができる。
次のステップは、37°Cの1%TTC溶液中での組織染色である14。染色液は、脳スライスの染色に特に重要である、予め温めておくべきである。予温した溶液を使用する場合、心臓スライスの最適な染色時間は10分です。より長いインキュベーションまたは37°Cより高い温度は、心臓組織の茶色の着色をもたらす。標本の適切な染色と一貫した赤色の強度は、さらなる画像解析にとって重要です。写真撮影前の最終ステップでは、組織スライスを冷たいPBSまたは同様の緩衝液で2〜3回すすぎ、溶液からTTCおよび過剰なメチレンブルーを除去し、写真の青色キャストを回避する。心臓のスライスは、最高の画質を得るために染色直後に撮影する必要があります。心臓染色は、低温(+4°C)PBS中で最大60分間保存した場合、良質のままである。染色された脳スライスおよび大動脈組織は、通常、4%中性ホルムアルデヒド溶液に保存され、1週間良好な品質を保持する。ホルマリン(+4°C)での脳組織の一晩保存は、正常組織の発色強度を損なわず、画像取得に許容される。しかし、ホルマリンは心臓スライスの腫脹および脱染を誘発する。したがって、ホルマリン中の心臓組織の保存は推奨されない。
次のステップは画像取得です。多くの研究室では、デジタルカメラや照明設定に代わる画像取得ツールとしてフラットベッドスキャナを使用しています。スライスのスキャンは十分な画像解像度と色分解を提供しないため、心臓スライスのイメージングには適していないと判断しました。特に、スキャナの解像度はマウスの心臓には不十分であり、メチレンブルーのレンダリングが悪いことに気付きました。対照的に、スキャナは、TTCまたは他の単一の染料のみで染色された脳スライスを撮像するためのフォトカメラの代替物であり得る。組織スライスのスキャンには、一定の露出設定を保証するスキャンソフトウェアが不可欠です。全体として、フラットベッドスキャナは能力が低く、ほとんどのイメージングアプリケーションでデジタルカメラを置き換えることはできません。
標本の背景も重要です。理想的には、トレイの底部は染色された標本に存在しない色であるべきです。例えば、メチレンブルーおよびTTC(赤)染色の面積を自動または半自動の方法で定量化するために、白、赤、青、黄、および茶色の背景は避けるべきである。したがって、緑色の背景が好ましいでしょう。それにもかかわらず、色の選択は、画像を後処理するオペレータの好みに依存する。多くの科学者は、白い背景を画像の後処理で削除して完全に白に変換できるため、白い背景を好みます(RGB白色コード255,255,255)。次に、半自動分析に使用される選択した色のリストから完全に白を除外し、露出過多でなければ完全に白くない淡い壊死領域のみをカウントする必要があります。青と緑の背景は、脳のスライスや大動脈の写真撮影に適しています。
組織写真に最適な撮像ツールは、互換性のあるマクロレンズを備えた一眼レフまたはミラーレスレンズ交換式デジタルカメラです。非常に小さなオブジェクトをキャプチャするには、カメラと顕微鏡の組み合わせが必要になる場合があります。それにもかかわらず、マクロレンズは、通常、マウス心臓の詳細な画像を得るのに十分な(少なくとも1:2の)倍率を有する。多くのメーカーは、高解像度と高倍率の写真を得るために手頃な価格のデジタルカメラとマクロレンズを提供しています。すべての最新のデジタルカメラは、スタンドにマウントする可能性、ピクセル数が多い(通常>20 Mpx)、ライブビュー、ミラーロックアップ、タイムラプス機能、リモートシャッター、カメラパラメータを手動で設定する機能など、マクロ撮影に必要な特性と機能を備えており、一定のシャッタースピード、絞り、ホワイトバランス、ISO設定を保証します。上記の機能とレンズ倍率が少なくとも1:2のコンパクトカメラは、マクロ撮影にも使用できます。レンズの特性のため、一部のコンパクトカメラは物体のすぐ近くに配置する必要がありますが、実験者はカメラ本体が試料の照明に影響を与えないようにする必要があります。
レンズ交換式カメラでのマクロ撮影には、高倍率(1:1-1:2)のマクロレンズが必要です。フルフレーム(24 mm x 36 mm)センサーでは、焦点距離が50 mm~100 mmまたは同等のマクロレンズを使用することをお勧めします。小型のセンサーカメラではセンサーサイズが異なるため、それに応じて倍率を再計算する必要があります。心臓のスライスを撮影する場合、100mmのマクロレンズフロントエレメントから被写体までの人間工学に基づいた距離は約150mmです。この設定により、オペレータはすべての機器をテーブル上に保持し、カメラコントロールに簡単にアクセスできます。1枚の写真ですべてのスライスを取得するには、より広い視野が必要であるため、脳スライスなどの大きな物体の写真撮影には50mmのマクロレンズが考慮されるかもしれません。
高解像度で鮮明な画像を得るには、カメラを頑丈なスタンドに取り付ける必要があります。カメラをスタンドとリモート(有線またはワイヤレス)トリガーに取り付けると、手ぶれがなくなり、ターゲットから一定の距離が確保されます。被写体平面に対して約30〜60°の角度で、両側からの2つの一定の光源を備えたカメラ照明設定は、試料の十分な照明を確保し、同時に反射を避けるのに役立ちます。カメラは、センサーが被写体平面に平行になるように正確に取り付ける必要があります。画像フィールドを均等に照らすには、両方のランプを均等に向き、被写体から同じ距離に配置する必要があります。被写体からさまざまな距離に置かれた光源は、不均一な照明を引き起こします。さらに、点滅する光源は、画像露光の変動の理由である。全体として、カメラと光源を正確に配置して、十分に照らされた標本の画像を正確に取得することが重要です。
組織サンプルは光を反射し(キラキラ)、画像内に白い斑点として現れる。これらの光反射スポットには有用な色情報が含まれていないため、画像のこれらの部分は画像の正確な定量分析には使用できません。組織スライスからの光反射は、様々な方法によって除去することができる。最も効率的なのは、生理食塩水またはPBS溶液を含む容器に組織サンプルを完全に浸漬することです。同様のアプローチは、ガラス板の下(または間)の組織スライスの挿入である。この方法は、反射に対して効率的です。ただし、画像解像度は浸漬組織の写真の解像度よりも低くなる可能性があります。
レンズに取り付けられた偏光フィルターを使用して、光の反射を排除することもできます。円偏光フィルターは広く入手可能ですが、価格によって品質がかなり異なり、安価なフィルターは画像の解像度を大幅に低下させる可能性があります。反射光は、偏光フィルタの可動部を斜めに回すことでフィルタリングすることができる。偏光フィルタの有効性は、いくつかの光源(例えば、強いLED光)によって影響を受ける可能性がある。全体として、余分な液体を除去した後、偏光フィルターは脳スライスからのすべての反射を除去することができる。しかし、バッファー溶液へのサンプル浸漬は、心臓スライスにとって最も簡単でコスト効率の高いアプローチです。
シャッタースピード、絞り、ISO、ホワイトバランスの手動設定は、イメージングプロセスを完全に制御するために重要です。光源のサンプル、背景、および特性は、自動設定のカメラ露出測光システムに影響を与えます。したがって、実験中に複数の写真間で一定の露出とホワイトバランスを維持するためには、手動設定が必要です。マクロ写真の場合、推奨される絞り設定は f/8 ~ f/16 です。絞りを小さくすると被写界深度が増加します。これは、オブジェクトが単一の平面内にない場合に役立ちます。しかし、回折は、より小さな絞りの場合、写真の総解像度を制限します。ほとんどのレンズの最適な絞りは、通常 f/10 です。これは、この設定では解像度の低下が無視でき、被写界深度で十分であるためです。通常、50 ~ 400 の範囲の ISO 値は、画像のアーチファクト (ノイズ) を最小限に抑えるのに最適です。シャッタースピードは、既存の光条件で前述の絞りとISOの設定を使用して正しい露出を得るために変更する必要があります。手動設定は、一貫した画像解析のために重要です。標準化されたイメージングにより、セグメンテーション分析を必要とするあらゆる研究全体で同じ色のしきい値設定を使用できます。たとえば、青、赤、白(+淡いピンク)の定義済みの色を持つセグメンテーションファイルに基づくImageProソフトウェアによる半自動分析は、試料画像に一貫した色、ホワイトバランス、露出がある場合、長年にわたって使用できます。
ホワイトバランス設定は、サンプルを照らすために使用される光源の色温度に応じて調整する必要があります。ホワイトバランスは、カメラ内蔵プリセットから選択することも、グレーターゲットの手動キャリブレーションを使用して選択することもできます。RAW形式での画像キャプチャの利点は、画像のソフトウェア後処理中にホワイトバランスを調整できることです。RAWファイルにはJPEGファイルよりもはるかに多くの情報が含まれているため、RAWファイルの後処理は、カラーバランスと露出の補正だけでなく、より良い画像解像度を得るための優れた機会を提供します。ほとんどのカメラは JPEG ファイルと RAW ファイルを同時にキャプチャできるため、RAW ファイルをキャプチャしてバックアップとして保存することをお勧めします。
全体として、このプロトコルは、ラットの心臓および脳組織のスライスおよび染色のための方法論を説明し、さらなる分析のための高解像度画像取得のための照明およびカメラセットアップおよび写真技術を確立するためのガイドラインを提供する。この方法は、すべての実験的小動物臓器写真に適用可能である。

何十年もの間、心臓と脳の組織標本の写真撮影と分析は、生命科学実験の重要な部分でした。科学と革新の進歩は、超解像が可能な高価な顕微鏡の開発を推進しています。顕微鏡写真は、詳細な指示に従って、十分に制御された光環境で取得されます。対照的に、マクロ写真(1:2以上の倍率で)は、不適切なイメージング設定を使用して、制御されていない光環境で頻繁に実行されます。多くの場合、サンプル調製とカメラのセットアップの手法を大幅に最適化する必要があります。その結果、限られた品質のマクロ写真が科学雑誌に広く掲載されています。不十分な画像解像度とコントラストは、IR研究における正確な画像定量化の可能性を制限します。
心筋1,2および脳3,4梗塞の実験手順が詳細に説明されている。本研究の目的は、梗塞実験後のげっ歯類の心臓および脳組織標本の撮影および標準化分析のためのシステムを構築する方法についてのステップバイステップガイドを提供することである。これには、心臓および脳サンプルの組織スライス、染色、およびマクロ写真が含まれます。組織標本の作製は実験の不可欠な部分であり、平面画像解析結果は得られた画像の品質に大きく依存します5。
これらの方法は、げっ歯類組織における測定および画像平面解析を実行するのに特に有用であり、一般的な科学的マクロ写真にとって価値がある可能性がある。さらに、画像の高品質と一貫性により、デジタル写真の自動分析を実行できるため、時間を節約し、ユーザー入力を回避し、画像分析中のエラーやバイアスのリスクを最小限に抑えることができます。これにより、堅牢で信頼性の高いデータが生成され、前臨床的発見が診療所における新しい抗虚血治療に翻訳されることが促進されます。

<table><tbody><tr><td>1 mLシリンジ</td><td>Sagimed</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>298-96-4</td><td></td></tr><tr><td>5 mL シリンジ</td><td>Sagimed</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL シリンジ</td><td>テルモ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>成体ラット 脳スライサー マトリックス</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSRAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>マウス心臓用大動脈カニューレ</td><td>ADInstruments</td><td>SP3787</td><td></td></tr><tr><td>ラット心臓用大動脈カニューレ</td><td>ADInstruments</td><td>SP3786</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物、&ge;99%</td><td>Acros Organics</td><td>207780010</td><td></td></tr><tr><td>カバー ガラス鉗子、角度付き</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11073-10</td><td></td></tr><tr><td>止血鉗子</td><td>Agnthos</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Hoya 62 mm α 円偏光子フィルター</td><td>Hoya</td><td>HOCPA62</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Penta</td><td>16330-31000</td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>SigmaAldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>マウス ハート スライサー マトリックス</td><td>Zivic Instruments</td><td>HSMS005-1</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン プラスチック チューブ</td><td>BD Intramedic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>生化学用 塩化カリウム</td><td>Acros Organics</td><td>418205000</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム、一塩基性、&ge99%</td><td>Acros Organics 205920025</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラットハート スライサー マトリックス</td><td>Zivic インスツルメンツ</td><td>HSRS001-1</td><td></td></tr><tr><td>鈍い端で湾曲したはさみ</td><td>Agnthos</td><td>14013-15</td><td></td></tr><tr><td>心臓を掃除するためのハサミ</td><td>Agnthos</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>片刃カミソ</td>ス <td>Zivic インスツルメンツ</td><td>BLADE012.1</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム生化学、99.5%</td><td>Acros Organics</td><td>447100010</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>ソニーαa6000ミラーレスデジタルカメラ</td><td>ソニー</td><td>ILCE6000</td><td>最新のデジタルカメラで再パレス可能</td></tr><tr><td>ソニーFE 90 mm F/ 2.8 マクロ G OSS</td><td>ソニー</td><td>SEL90M28G</td><td>重要、レンズはカメラと互換性があります</td></tr><tr><td>ソニー SF32UZ SDHC 32 GBクラス10</td><td>UHS ソニー</td><td>2190246141</td><td></td></tr><tr><td>外科用ブレード</td><td>ハインツ・ヘレンツ ハンブルク ドイツ</td><td>BS2982</td><td></td></tr><tr><td>サーモシェーカー</td><td>BioSan</td><td>PST-60HL-4</td><td></td></tr><tr><td>歯付き組織鉗子</td><td>Agnthos</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>心臓を洗浄するための歯付き組織鉗子</td><td>Agnthos</td><td>11023-10</td><td></td></tr><tr><td>計量トレイ、70mL</td><td>サーステッド</td><td>71,99,23,212</td><td></td></tr></tbody></table>

虚血再灌流後のデジタルマクロ写真のためのげっ歯類の心臓および脳組織の準備

Rodent Heart and Brain Tissue Preparation for Digital Macro Photography after Ischemia-reperfusion

マクロ写真は、定性的および定量的分析を行うために、高倍率で様々な組織サンプルをイメージングするために適用可能です。組織調製およびその後の画像キャプチャは、虚血再灌流(IR)実験の直後に行われるステップであり、適時に適切な注意を払って行わなければならない。心臓および脳におけるIR誘発損傷の評価のために、本稿では、2,3,5-トリフェニル-2H-テトラゾリウムクロリド(TTC)ベースの染色とそれに続くマクロ写真について記載する。科学的なマクロ写真には、制御された照明と適切なイメージング設定が必要です。標準化された方法論は、安価な最新のデジタルカメラとマクロレンズの組み合わせを使用しても、高品質で詳細なデジタル画像を保証します。サンプル調製と画像取得における適切な技術と潜在的な間違いについて議論し、正しいセットアップと誤ったセットアップが画質に与える影響の例を提供します。オーバーステイン、不適切なサンプル保管、最適でない照明条件など、一般的な間違いを回避する方法に関する具体的なヒントが提供されています。この論文では、ラットの心臓および脳組織のスライスおよび染色のための適切な方法論を示し、高解像度画像取得のための照明およびカメラのセットアップおよび写真技術を確立するためのガイドラインを提供する。

図3A は、心筋梗塞後のメチレンブルーおよびTTC染色心臓スライスの写真であり、梗塞サイズのさらなる平面分析のための十分な詳細および色情報を含む(図3B)。心臓の24時間の凍結が心臓組織の完全性にどのように影響するかを試験しました(図3C)。長期間(&gt;1時間、 図3C)の凍結はミトコンドリア機能を低下させる。したがって、心臓のTTC染色は赤色ではなく淡いピンク色であり、壊死組織と生存組織の境界はぼやけている(図3C)。
また、試験片における反射の低減について2つの方法を比較した。浸漬は最も効率的な方法であり、コントラストの良い詳細な画像を生成します(図4A)。第2の方法は、レンズに取り付けられた偏光フィルタの使用である。偏光フィルターも効果的です。ただし、フィルタは画像の解像度とマイクロコントラストをわずかに低下させます(図4B)。浸漬またはフィルターのないハートスライスの例の画像(図4C)には、多くの反射が含まれており、さらなる分析には適していません。
脳スライスは、スライス管理 (フローティング) の問題のために浸漬されません。平面解析では、脳の罹患していない(健康な)側(図5A)と脳卒中の罹患側(図5B)を比較することが重要です。脳のスライスは乾いたプレートやトレイで管理しやすく、偏光フィルターを使用して反射を除去します。青い背景のトレイは、脳のスライス写真撮影に使用されます(前述の背景選択5)。
手動カメラ設定を使用して、露出とホワイトバランスを完全に制御しました。カメラの設定は、使用可能な光源に従って、実験の前または開始時に調整する必要があります。これにより、すべての画像の最適な露出とホワイトバランスが確保され、均一な解析が可能になります(図6A)。カメラの自動設定は完璧ではなく、カメラパラメータが変化し、不適切な結果を引き起こし、画像間の変動を引き起こす可能性があります。
図6は、心臓スライスの露出過多画像(図6B)および露出不足画像(図6C)の例を示す。カメラのホワイトバランス設定には、カメラライトの設定で使用される特定の光源に合わせて十分な注意を払う必要があります。ホワイトバランスの設定を誤ると、画像が青または黄色(図6D)およびマゼンタまたは緑(図6E)にシフトすることがあります。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig03.jpg"> (A)フレッシュハートスライスを、カラーセグメンテーション(B)を用いてImageProPlus 6.3ソフトウェアで分析した。(c)TTC染色は、凍結心臓スライス(24時間凍結)における生存組織と壊死組織とをほとんど区別しない。略語:TTC = 2,3,5-トリフェニル-2H-テトラゾリウムクロリド。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig04.jpg"> 図4:反射を減らすためのテクニック。 PBSに浸漬して撮影したラット心臓スライス画像(A)及び偏光フィルター(B)を用いた。(C)浸漬もフィルターも使用しない場合の反射を伴うハートスライス。略称=PBS=リン酸緩衝生理食塩水。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig05.jpg"> 図5:ラットの脳スライスの画像。 ラット脳を7つのスライスに切断し、虚血再灌流後にTTCで染色した。偏光フィルタを使用すると、反射のない画像が得られます。(A)損傷を受けていない半球からのスライス;(B)ストロークの影響を受けた半球からのスライス。略語:TTC = 2,3,5-トリフェニル-2H-テトラゾリウムクロリド。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig06.jpg"> 図6:ラットの心臓スライス画像。正しく(A)正しく(B-E)ハートスライス画像を撮影した。露出設定が正しくないと、露出過多(B)と露出不足(C)の画像になります。ホワイトバランスの設定が正しくないと、画像に黄色(D)または緑色のキャスト(E)が表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、虚血再灌流実験後のげっ歯類組織調製の標準化された方法論のためのプロトコルと、高解像度画像取得のための照明およびカメラ設定を確立するためのガイドラインを提示する。この方法は、すべての実験的小動物臓器写真に適用可能である。

Macro photography is applicable for imaging various tissue samples at high magnification to perform qualitative and quantitative analyses. Tissue ...

このプロトコルは、心臓および脳組織のスライスおよび染色のための適切な方法論を示す。また、照明とカメラの設定、および画像取得のための写真技術を確立するためのガイドラインも提供します。これらの方法は、げっ歯類組織における画像平面解析における測定を行うのに特に有用であり、一般的な科学的マクロ写真にとって価値のあるものであり得る。開始するには、クレブス-ヘンゼライト溶液で満たされたシリンジから心臓カニューレを取り外し、0.1%メチレンブルーを含む暖かいクレブス-ヘンゼライト溶液で満たされたシリンジに接続します。ラットの心臓に4ミリリットルのメチレンブルー溶液を毎分4ミリリットルの割合で灌流する。カニューレをシリンジから取り外し、カニューレから心臓を取り外した後、心臓をティッシュペーパー上で静かに転がすことによって余分なメチレンブルーを除去する。余分なメチレンブルーを除去した後、止血鉗子を開き、外科用縫合糸の周りのプラスチックチューブを取り外すことによって冠状動脈の周りの結紮を緩める。次に、染色されたラット心臓をスライス用のステンレス鋼マトリックス中に置く。心室を厚さ2ミリのスライスに切り、1匹の成体ラット心臓から6〜7枚のスライスを目指します。切断後、スライスを15ミリリットルのプラスチックチューブに移します。次いで、PBSに溶解した5ミリリットルの1%トリフェニルテトラゾリウムクロリドを心臓スライスを有するチューブに加え、5分後に穏やかに混合しながら摂氏37度の水浴中で10分間インキュベートする。インキュベーション後、心臓スライスをPBSで少なくとも2〜3回洗浄し、画像キャプチャの準備をする。頭蓋骨から脳幹を含む脳を取り除いた後、腹側を上にして脳マトリックスに置きます。動物の体重に応じて、脳のステンレス鋼マトリックスの正しいサイズを選択してください。ブレードを使用して、脳の前頭部と尾部を制限します。次に、最初のブレードと最後のブレードの間のチャネルにブレードを部分的に入れます。すべての刃を挿入して平行に配置したら、すべての刃を同時に手のひらで押し下げて、脳を2ミリメートルの冠状スライスに切断します。次に、2本の指で側面に沿ってしっかりと刃をつかみ、スライスした脳と一緒にマトリックスから取り除きます。脳のスライスをトレイに1つずつ配置し、各スライスの内面が常に上を向いていることを確認します。次に、温かい1%トリフェニルテトラゾリウムクロリド溶液とPBSを脳スライスに注ぎ、暗所で摂氏37度で8分間インキュベートする。インキュベーション後、脳のスライスを青いプラスチックトレイに移して画像をキャプチャします。脳のスライスを前頭部から尾部まで順に並べ、メスを使って矢状面の半球を分離します。染色直後の組織スライスを写真撮影する。充電済みのバッテリー、メモリーカード、付属のレンズをスタンドに取り付けて、お好みのカメラをセットアップします。使用可能な光源に応じて、カメラのマニュアルの指示に従って、適切なホワイトバランス設定を選択するか、色温度のキャリブレーションを実行します。心臓のスライスをPBSの入った容器に完全に浸します。脳のスライスをPBSまたは他の液体を含まない乾燥トレイに並べる。スライスの入ったコンテナをマクロレンズ付きのカメラの下に置きます。すべてのスライスが視野に完全に収まり、同じ平面上にあることを確認します。カメラをフルマニュアルモードに切り替え、ISO 100、絞りをF10に設定します。最適な画像露出が得られるようにシャッタースピードを調整し、カメラの焦点面がサンプルが置かれている面に平行であることを確認します。サンプル番号を撮影後、反射が消えるまで円偏光フィルターを回転させ、リモートトリガーで組織スライスを撮像し、シャッターを離したときの手振れを防ぎ、スライスを回転させて反対側から撮影します。心筋梗塞後のメチレンブルーおよびトリフェニルテトラゾリウムクロリド染色心臓スライスのこの写真には、梗塞サイズのさらなる平面分析のための十分な詳細および色情報が含まれている。心臓組織の24時間の凍結は完全性に影響を及ぼし、ミトコンドリア機能を低下させる。したがって、心臓のトリフェニルテトラゾリウムクロリド染色は赤色ではなく淡いピンク色であり、壊死組織と生存組織との間の境界がぼやけている。試料の反射を低減するために比較された2つの方法のうち、浸漬は最も効率的な方法であり、良好なコントラストを有する詳細な画像を生成する。偏光フィルターも効果的ですが、画像の解像度とマイクロコントラストをわずかに低下させます。浸漬またはフィルターのないハートスライスの画像には多くの反射が含まれており、それ以上の分析には適していません。平面分析では、脳の罹患していない側を脳卒中の影響を受けた側と比較する必要があります。手動カメラ設定により、すべての画像の最適な露出とホワイトバランスが確保され、均一な分析が可能になります。心臓スライスの露出過多および露出不足の画像の例をここに示します。さらに、ホワイトバランスの設定が正しくないと、画像が青または黄色、マゼンタまたは緑のキャストにシフトします。科学的なマクロ写真には、制御された照明と適切なイメージング設定が必要です。標準化された方法論により、高品質で詳細なデジタル画像が保証されます。この方法は、全ての実験小動物臓器撮影に適用可能である。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

外科手術による外傷、炎症反応を誘導する。サイトカイン、内因性リガンドは、虚血再灌流後に心筋梗塞サイズを調節することが知られています。我々は、開胸の影響を最小限に抑えるためにぶら下がって重みを使用してマウスの虚血再灌流の変更されたクローズド·胸のモデルを提示します。...

心筋虚血再灌流障害のマウスクローズド胸モデル

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脳卒中後の脳骨髄細胞の特徴づけは、光分留法を用いて、立体解析によって行う、または脳白血球懸濁液のフローサイトメトリー分析により得ることができる。両方は、虚血性脳に見出さ主骨髄細胞サブセットの正確な表現型の区別を行うために有用な技術である。...

一時的または恒久的な脳虚血モデルにおける白血球亜集団の立体解析とフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

孤立したラットの心臓は、虚血再灌流障害の永続的なモデルです。ここでは、ラットからin...

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私たちは、シリコーンコーティング縫合糸を使用して、中大脳動脈の閉塞によって誘発される脳卒中のマウスモデルを記述します。このプロトコルは、永久的な閉塞または一時的な虚血を誘発し、続いて再灌流を誘発するために適用することができます。...

梗塞エリアの中央動脈閉塞技術と可視化を使用したマウスにおける虚血性脳卒中および虚血 - 再灌流の誘導

げっ歯類の心筋梗塞(MI)の死後評価は、染色された心臓切片の梗塞の定量化に基づいています。本稿では、採取したラットの心臓の基部から頂点までの系統的サンプリングと、三色染色された組織切片の画像解析を用いて、梗塞の大きさを定量化する正確な方法を説明します。...

ラットにおける慢性心筋梗塞の組織学的定量

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無傷心膜虚血性げっ歯類モデル

現在のプロトコルは、損傷を引き起こすことなく脳血管の解剖学的構造を保存する中大脳動脈閉塞/再灌流のラットモデルを記述しています。...

脳血管の解剖学的構造を損なうことなく中大脳動脈閉塞・再灌流のラットモデル

この研究では、体液が異常なラットの心筋虚血再灌流障害(MIRI)に対する、ウイグルの伝統的なハーブ製剤であるMunziqの心臓保護効果を調査しています。包括的な実験方法を通じて、NF-κBシグナル伝達経路を抑制することによりMIRIを軽減するMunziqの可能性を実証します。...

Herbal Munziqは、炎症を抑制することにより、心筋虚血-再灌流障害を改善します

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一過性限局性虚血と組み合わせた急性高血糖によって誘発される出血性形質転換のマウスモデル

ラット のin vivo モデルは、虚血性脳卒中の病態メカニズムと治療標的を調査するために不可欠なツールです。この研究では、ラットの中大脳動脈閉塞 (MCAO)...

虚血性脳卒中のラットモデルにおける免疫蛍光法による細胞死シグナル伝達の評価

学ぶ虚血再灌流後のげっ歯類心臓・脳組織の標準的なスライス作成と染色法。メチレンブルーとトリフェニルテトラゾリウム塩化物を用いた高解像度デジタルマクロ写真撮影技術を確立し、梗塞サイズの平面計測分析を正確に行う方法を解説します。

虚血再灌流後のデジタルマクロ写真のためのげっ歯類の心臓および脳組織の準備

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