Name: 精密切断肺スライスを利用して気道・肺内動脈平滑筋の収縮調節を研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶ精密切断肺スライス法によるマウス気道・肺動脈平滑筋収縮の評価。生体内環境を保持したエクスビボモデルで、呼吸器疾患の病態解明と治療薬開発に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、NIH grants, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A) によってサポートされています。

すべての動物ケアは、マサチューセッツ総合病院の施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに従っていました。野生型C57/B6雄マウス(8週齢)を本研究に使用した。
1. 実験準備
<ol><li>作業ソリューションを準備します。<ol>
<li>1x ハンクス平衡塩溶液(HBSS、Ca2+およびMg2+ 、およびpHを20mM HEPESと平衡、 材料表を参照)を調製する。HBSS ソリューションを使用して、PCLS を準備および処理します。PCLSを準備するときは、氷上でHBSS溶液を冷たく保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ダルベッコ改変イーグル培地およびF-12(DMEM-F12)に抗生物質 - 抗真菌剤(1:100容量比、 材料表を参照)を添加して、PCLSの培養培地を調製する。</li>
	<li>1.5%アガロースおよび6%ゼラチン溶液を調製する。<ol>
<li>低融点(LMP)アガロースまたはゼラチン粉末( 材料表を参照)とHBSS溶液を15 mL滅菌遠沈管(溶液容量が10 mLの場合は50 mLチューブ)で最終濃度まで別々に混合します(または、溶液容量>10 mLの場合は50 mLチューブ)。 注:アガロース溶液の全体積= 5mL/マウス×マウス数;ゼラチン溶液=2mL/マウス×マウス数。</li>
		<li>粉末が完全に溶解するまで、溶液チューブを沸騰水中で加熱する。アガロースとゼラチンの両方の溶液を42°Cの水浴中に保管してください。 注:解剖テーブルの加熱ランプは、動作環境を暖かく保ち、マウス肺に注入される前にアガロース溶液が固化するのを防ぐのに役立ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一対の解剖はさみ、2対の湾曲した微小解剖鉗子、および一対の止血鉗子を含むすべての解剖ツールを、滅菌のために少なくとも20分間、70%エタノール溶液に沈める。</li>
	<li>ビブラトームを準備して( 材料表を参照)、肺組織を薄いスライスに分割します。</li>
	<li>CCDカメラを備えた倒立位相差顕微鏡を気道または血管収縮応答を評価し、カスタムメイドのレーザー走査共焦点顕微鏡( 材料表を参照)を使用して肺SMCのCa2+ シグナル伝達を評価します18。</li>
</ol>2.アガロースおよびゼラチン溶液によるマウス肺の膨張
<ol><li>マウスを安楽死させる。<ol>
<li>マウスを5%イソフルランを含むプラスチックチャンバー(約750cm3)に入れます。マウスが少なくとも1分間呼吸を停止するまで、マウスをチャンバー内に保持します。 注:ケタミン(240 mg/Kg)およびキシラジン(32 mg/Kg)19 またはペントバルビタール(0.3 mL)20の腹腔内注射などの他の一次安楽死方法は、吸入イソフルランの代替として適用することができます。</li>
		<li>マウス本体を離剖ボードの上に置き、仰臥位に置きます。尾、前足、および頭を25Gシリンジ針で固定して体を所定の位置に固定し、70%エタノールスプレーで体を消毒します。</li>
		<li>マウスの腹部を外科用ハサミ(切開、長さ約2cm×幅2cm)で切り開きます。その後、腹部大動脈を切り取って血液量を枯渇させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>以下の手順に従って肺葉を膨らませます。<ol>
<li>胸骨と横隔膜の上の両側下胸郭に沿って胸腔を注意深く開き、胸腔が開いたときに肺葉が崩壊するのを観察します。</li>
		<li>両側腹側胸郭の一部を取り外して心臓を露出させます。鋭いはさみの先端を肺組織から遠ざけることによって肺の損傷を避けてください。</li>
		<li>鉗子を使用してマウス首の胸腺と軟部組織を分離し、気管を露出させます。</li>
		<li>気管の上端に小さな穴(直径1.2mm)を切断し、20G Y字型のIVカテーテルの先端を通過させます( 材料表を参照)。</li>
		<li>Y字型カテーテルの一方のアダプターポートを0.5 mLの空気でプレフィルされた3 mLシリンジに接続し、もう1つのポートを2 mLの温かい1.5%アガロース溶液(42°C)でプレフィルした3 mLシリンジに接続します。</li>
		<li>アガロース溶液を注入してカテーテルを満たし、カテーテルを予め切断された開口部から気管内に5〜8mmの長さで押し込む。</li>
		<li>アガロース溶液を約1mL/5秒でゆっくりと注入する。肺は近位から遠位軸に沿って拡張します。各肺葉の縁が膨らんだら注射を停止します。 注:肺を過度に膨らませないでください, これはそれを破裂させる可能性があるため、.若年成人マウスの肺全体を膨張させるアガロース溶液の体積は、約1.3±0.1mLである。</li>
		<li>他のシリンジから0.2〜0.3mLの空気を注入して、カテーテル内の残留アガロースおよび導電性気道を遠位肺胞空間に押し込む。</li>
		<li>クリップは、一対の湾曲した止血鉗子で気管を閉じます( 材料表を参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>肺血管系を充填する。<ol>
<li>1mLのシリンジに暖かい6%ゼラチンを充填する。針頭皮静脈カテーテルに接続し、カテーテルにゼラチン溶液を充填し、下壁に近い右心室を針で穿刺する。</li>
		<li>針を右心室に長さ2〜3mm押し込み、針先を主肺動脈に向けます。</li>
		<li>0.2mLのゼラチン溶液を右心室および肺動脈血管にゆっくりと注入する。 注:肺葉は、適切なゼラチン膨張でわずかに薄く見えます。</li>
		<li>注射後5分間針を所定の位置に保ち、氷冷HBSS溶液を心臓と肺に注いで肺葉を冷やし、解剖ボードで体を4°Cの冷蔵庫または氷の上に合計10分間置きます。</li>
		<li>はさみで周囲の結合組織からマウスの肺と心臓を取り除きます。次に、各肺葉を分離し、氷上のHBSS溶液に保管します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 肺葉を細いスライスに切断する
<ol><li>肺ローブをスーパーグルーで試料カラムの上部にトリミングして取り付け、葉の向きを合わせ(図1A、B)、切断方向がヒラから肺表面までのほとんどの気道に対して垂直になるようにします。</li>
	<li>新鮮な細いカミソリの刃でビブラトームを使用して、肺葉を150μmのスライスに切断します。冷たいHBSS溶液を予め充填した100mm滅菌ペトリ皿にスライスを集める。 メモ:スライスを開始する前に、適切なブレード移動速度と振動周波数を設定してください。圧縮トムの一般的な設定は、速度レベル4と発振レベル4です。</li>
	<li>DMEM/F-12培養液(20スライス/15mL培地/ディッシュ)を充填したシャーレにスライスを移し、実験前に37°Cのインキュベーター内で一晩維持する。 注:マウスPCLSは、気道収縮応答を失うことなく約7日間培養中に維持することができる17。肺動脈の寿命は十分に評価されていない。我々の観察では、それらはDMEM/F12培地中で少なくとも3日間、無傷の構造および血管反応を保持する。長期保存のために、マウスPCLSを10%DMSOを含むDMEM/F12培地で満たされたクライオバイアル(バイアルあたり1mL培地中に5スライス)に入れ、-80°Cのイソプロピルアルコール充填容器で一晩凍結し、液体窒素中で数週間から21ヶ月間凍結保存することができる。</li>
</ol>4. 肺内気道・動脈の収縮応答の解析
<ol><li>PCLSをHBSS充填24ウェル培養プレートに各ウェルに1つずつ入れます。ウェルの中央にあるPCLSの位置を確認し、ピペットでHBSS溶液を取り出します。</li>
	<li>顕微鏡下でスライス内のターゲット気道と血管を見つけ、ターゲット領域を露出させるために予めカットされた中央穴(直径2〜3mm)を備えたナイロンメッシュを使用してスライスを覆います。</li>
	<li>メッシュの上に中空の金属ワッシャーを置き、スライスを所定の位置に保持します(図2A)。</li>
	<li>600 μLのHBSS溶液を加えてPCLSを沈めます。スライスを10分間休ませてから、気道または血管のベースライン画像を記録します。</li>
	<li>空のHBSS溶液をピペットで慎重に吸引し、1μMのメタコリン(MCh)または10nMのエンドセリンなどのアゴニストを含む600μLのHBSSを添加することによって、気道または血管収縮を誘導する( 材料表を参照)。 注:ツールセット標準としてのKCl刺激は、メタコリンまたはエンドセリン曝露の前には必要ではない。マウス気道における100mMのKCl刺激は、小さくて不規則な気道収縮(10%〜15%)を誘導するだけである20。同様に、同じアゴニスト、例えばメタコリンまたはセロトニンが、最初で反復的な曝露で同様の気道収縮を引き起こすことを確認したので、プライミングメタコリン刺激は義務ではない20,22。</li>
	<li>内腔領域の変化が平衡状態に達するまで顕微鏡下で反応を観察し、気道または血管画像を記録して分析します。</li>
	<li>ピペットでMChまたはエンドセリン溶液を除去し、同じアゴニスト濃度および弛緩剤を有する新しい600μL HBSS溶液を加える。気道または血管の弛緩を観察し、記録する。</li>
	<li>以下のステップに従って気道または血管反応を定量化する。<ol>
<li>NIHが後援するフリーソフトウェアFIJIに画像をロードします。</li>
		<li>ツールバーの 「ポリゴン選択」 を選択して、各フレームの気道または血管内腔の輪郭を描きます。</li>
		<li>[分析] を選択 >、面積>測定値を設定します。</li>
		<li>[分析>測定] を選択して、対象領域を定量化します。結果は、統計分析のために別のウィンドウに表示されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 気道または血管SMCのCa2+ シグナル伝達の解析
<ol><li>Ca2+色素ローディングバッファーを用意する。<ol>
<li>Ca2+染料、オレゴングリーン488 BAPTA-1-AM(材料表を参照)、50μg(バイアル1本)、10μLのDMSOで溶解する。</li>
		<li>0.2gのプルロニックF-12粉末( 材料表を参照)を1mLのDMSOに溶解し、20%プルロニック溶液を生成する。</li>
		<li>10 μL の 20% プルロニック溶液と 10 μL のCa2+ 色素-DMSO 溶液を混合します。</li>
		<li>200 μM のスルホブロモフタレインを含む 2 mL の HBSS 溶液に 20 μL の混合物を加えて、Ca2+ 色素担持バッファーを作ります (材料表を参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2mLのCa2+ ローディングバッファーに15匹のマウスPCLSを入れ、30°Cで1時間インキュベートする。次いで、スライスを100μMのスルホブロモフタレインを含む2mLのHBSS溶液に、室温で蛍光色素脱エステル化のためにさらに30分間移動させる。</li>
	<li>SMCのCa2+ シグナリングを検出します。<ol>
<li>Ca2+染料を装填したスライスを大きなカバーガラスの上に置きます。</li>
		<li>3mLシリンジに高真空シリコーングリースを充填します。グリースを 18 G の鈍い針で絞って、スライスの上下のカバーガラスに 2 本の平行線を描きます。</li>
		<li>2本のグリースラインの間にナイロンメッシュを使用してスライスを覆います。メッシュの上に第2のカバーガラスを置き、側面にグリースで密封されたチャンバを発生させる(図3A)。 注:ナイロンメッシュは、スライスをボトムカバースリップに取り付けたままにし、40xオイルなどの高サイズの反転対物レンズの作動距離内にとどまるために不可欠です。</li>
		<li>HBSSまたはアゴニスト溶液を、手動または灌流システム を介して ピペッティングすることによって、一端からチャンバーに入れる。連続流体灌流の場合には、ティッシュペーパーまたは真空で他方の端から吸引することによって、チャンバから流体を除去する。</li>
		<li>PCLSチャンバーを顕微鏡ステージに置きます。SMC23のCa2+ シグナリングを、15または30 画像/秒のレーザースキャンレートを備えたカスタムメイドの共振走査型共焦点顕微鏡で検出します。 注:また、現在広く入手可能な高速市販のレーザー走査型共焦点顕微鏡を、PCLSにおける肺SMCのCa2+ シグナル伝達アッセイに適用することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>SMCにおけるCa2+ 蛍光を定量化する。<ol>
<li>記録された画像シーケンスをFIJIにロードし、 8ビットグレースケール>画像>タイプを選択します。</li>
		<li>ツールバーの [ 四角形の選択] を選択し、平滑筋セルに 5 ピクセル x 5 ピクセルの関心領域 (ROI) を定義します。</li>
		<li>[分析] >選択して、Ca2+ 蛍光強度を表す平均グレー値>測定値を設定します。</li>
		<li>SMCの収縮に伴ってROIの位置が変化する場合は、[ 分析> Ca2+ 蛍光強度をフレームごとに測定]を選択します。</li>
		<li>SMCのROIが画像のスタック内で同様の位置にとどまる場合は、[ 画像>スタック> Ca2+ 蛍光強度の測定スタック]を選択します。 メモ:カスタム記述のマクロを差し込むと、SMC内のROIがイメージスタック内で収縮しながら移動し、ROIのCa2+ 強度(グレー値)をフレームごとに自動的に測定するときに、SMC内のROIを追跡できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function%3A+implications+for+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li>
<li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension%3A+implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li>
<li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li>
<li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172(2013).</li>
<li>Bikou, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+characterization+of+pulmonary+hypertension+in+mice+using+the+hypoxia%2FSU5416+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252(2020).</li>
<li>Stenmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+diverse+changes+in+the+functional+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).</li>
<li>Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+and+Ca2%2B+signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li>
<li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca%282%2B%29+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li>
<li>Currigan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasoconstrictor+responses+to+vasopressor+agents+in+human+pulmonary+and+radial+arteries%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study.</a> Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).</li>
<li>Halayko, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+differentiation+paths+in+airway+smooth+muscle+culture%3A+induction+of+functionally+contractile+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).</li>
<li>Worth, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li>
<li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li>
<li>Placke, M. E., Fisher, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+peripheral+lung+organ+culture-a+model+for+respiratory+tract+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).</li>
<li>Fisher, G. L., Placke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+lung+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">In vitro models of lung toxicity.</a> Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).</li>
<li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2%2B+oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480(2020).</li>
<li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li>
<li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636(2020).</li>
<li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT%2C+ACH%2C+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li>
<li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li>
<li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+Ca2%2B+sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li>
<li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795(2014).</li>
<li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li>
<li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2%2B+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li>
<li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li>
<li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li>
<li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NT4%2FTrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162(2019).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lung+tissue+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li>
<li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li>
<li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li>
<li>Mondoñedo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566(2020).</li>
<li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li>
<li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li>
</ol>

著者らには開示するものは何もありません。

PCLSの準備には、いくつかの重要なステップが含まれます。まず、不均一なアガロース分布からの組織剛性の変動を避けるために、肺葉を均質に膨張させることが不可欠である。液体アガロースは、37°C未満の温度で薄いカテーテルまたは気道で急速にゲル化するので、結果として生じる遠位肺野の充填欠陥は、肺組織の硬さの格差を増加させ、ビブラトーム切片中に組織を引き裂く可能性がある。したがって、低融点アガロース溶液をウォーターバス中で42°Cに保ち、解剖テーブルで加熱ランプを使用して、迅速なアガロースゲル化を回避することができる。迅速な注射は、より高いコンプライアンスでより多くのアガロースを肺実質に押し込むことができるので、避ける必要があります。手動アガロース注射は、通常、約5〜7秒かかります。第2に、アガロース充填の最後に必要なステップは、少量の空気(〜0.2mL)を押して、アガロースを導電性気道から遠位肺胞腔に洗い流すことである。さもなければ、アガロースはゲル化し、気道収縮に抵抗するために内腔にとどまるであろう。また、肺胞内でゲル化したアガロースが所定の位置にとどまり、インキュベーター内の37°Cで再び溶けないことも注目に値します。アガロースゲルは、負...

平滑筋細胞(SMC)は、肺の主要な構造細胞型であり、主に気道および肺血管の培地壁に常在する。SMCは管腔口径を変化させるために収縮し、空気と血流を調節する 1,2.したがって、SMCの収縮性調節は、空気換気および肺循環の恒常性を維持するために不可欠である。対照的に、異常なSMC収縮性は、閉塞性気道または喘息および肺動脈性高血圧症のような肺血管疾患を引き起こす。しかしながら、肺SMCの機能評価は、肺組織、特に肺の遠位部にあるそれらの小さな気道および微小血管への限られたアクセスによって挑戦されてきた2,3。現在のソリューションは、気道狭窄を反映するためにFlexiventによって気流抵抗を測定し、肺血管収縮を評価するために右心カテーテル法によって肺動脈血圧をチェックするなどの間接アッセイに頼っています4,5。しかし、これらの間接アッセイには、構造的要因によって交絡される、肺スケール全体における気道または血管応答の空間的多様性を捉えることができない、細胞レベルでの収縮調節の機構的研究に適さないなど、複数の欠点がある。したがって、単離された初代細胞、気管/気管支筋ストリップ8、9、または大きな血管セグメント10を使用する代替アプローチが、インビトロでのSMC研究に適用されている。それにもかかわらず、これらの方法にも制限があります。例えば、培養条件11、12における初代SMCの迅速な表現型適応は、細胞培養からインビボ設定への所見を推定することを問題にする。加えて、単離された近位気道または血管セグメントにおけるSMCsの収縮表現型は、遠位肺におけるSMCsを表していなくてもよい6,7。さらに、組織レベルでの筋力測定は、収縮調節への機構的洞察に不可欠な分子的および細胞的事象から解離したままである。
生きた肺組織切片である精密切断肺スライス(PCLS)は、生体内に近い微小環境(すなわち、保存された多細胞構造と相互作用)で肺SMCを特徴付けるための理想的なエクスビボツールを提供します13。Placke博士とFisher博士が1980年代にアガロースで膨張したラットとハムスターの肺からの肺スライスの調製を初めて導入して以来、14,15、この技術はPCLSに生物医学研究のためのより高い品質と汎用性を提供するために継続的に進歩してきました。1つの重要な改善は、気管を介したアガロースによる肺膨張に加えて、ゼラチン注入による肺動脈保存の増強である。その結果、気道および肺動脈の両方が、エクスビボアッセイ16のためのPCLSにおいて無傷に保たれる。さらに、PCLSは、培養において長期間にわたって生存可能である。例えば、マウスPCLSは、培養において最低12日間、細胞生存率および代謝に有意な変化を示さず、ならびに、気道収縮性を最大7日間保持した17。さらに、PCLSは収縮およびリラクゼーションアッセイのために異なるサイズの気道または血管を保持します。さらに、SMCsの細胞内Ca2+シグナル伝達は、細胞収縮性の決定因子であり、共焦点または2光子顕微鏡13によって画像化されたCa2+レポーター色素を用いてアッセイすることができる。
肺研究におけるマウスモデルの広範な適用を考慮すると、 エクスビボ 肺研究のために無傷の気道および肺内動脈を有するマウスPCLSを調製するための詳細なプロトコルがここに記載されている。調製したPCLSを用いて、我々はその後、狭窄性または弛緩性刺激に対する気道および肺動脈応答を評価する方法を実証した。さらに、PCLSにCa2+ レポーター色素をロードし、次いで収縮性または弛緩性応答に関連するSMCのCa2+ シグナル伝達をイメージングする方法も記載されている。

<table><tbody><tr><td>1 mLシリンジ</td><td></td>BD <td>309626</td><td></td></tr><tr><td>15 mL滅菌遠心チューブ</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>3 mLシリンジ</td><td>BD</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>50 mL滅菌遠心チューブ</td><td>Celltreat</td><td>229422</td><td></td></tr><tr><td>アセチル-ベータ-メタコリン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>62-51-1</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌性</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>CCD カメラ</td><td>ニコン</td><td>ニコン Ds-Ri2 カメラ</td><td></td></tr><tr><td>カバー グラス</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td><td></td></tr><tr><td>極低温バイアル</td> フィ<td>ッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>430488</td><td></td></tr><tr><td>カスタムメイドのレーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td></td><td></td><td>参考文献の詳細 18</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>MT-10-092-CM</td><td></td></tr><tr><td>エンドセリン 1</td><td>ミリポア Sigma</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>微細解剖ハサミ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>NC9702861</td><td></td></tr><tr><td>冷凍容器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>豚皮からのゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td>14025092</tr><tr><td>止血鉗子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>16-100-117</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>高真空シリコーングリース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>146355d</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>W292907-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>金属ワッシャー</td><td>ホームデポ 製品局</td><td>800442</td><td>Everbilt平ワッシャー #10</td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>ニードル頭皮静脈セット (25 G)</td><td>EXELINT</td><td>26708</td><td></td></tr><tr><td>NOC-5</td><td>ケイマンケミカル</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ</td><td>コンポーネントサプライ</td><td>U-CMN-300</td><td></td></tr><tr><td>オレゴングリーン 488 BAPTA-1 AM</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ o-6807</td><td></td></tr><tr><td>位相差顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>ニコン エクリプス TS 100</td><td></td></tr><tr><td>プルロニック F-127</td><td>サーモフィッシャー</td><td>P-6867</td><td></td></tr><tr><td>カミソリの刃</td><td>ペルソナ</td><td></td><td>ペルソナ ダブルエッジ カミソリの刃 ホワイト ラッパー 100 カウント</td></tr><tr><td>スルホブロモフタレイン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>S0252</td><td></td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td>クレイジーグルー</td><td></td><td>クレイジーグルー、万能</td></tr><tr><td>超高純度 低融点アガロース</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>プレシナ</td><td>リーVF 310-0Z</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム チリングブロック</td><td>プレシナリー</td><td>SKU-VM-CB12.5-NC</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム 検体チューブ</td><td>精密</td><td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td><td></td></tr><tr><td>Y字型IVカテーテル</td><td>BD</td><td>383336</td><td>BD Saf-T-Intima クローズドIVカテーテル</td></tr></tbody></table>

精密切断肺スライスを利用して気道・肺内動脈平滑筋の収縮調節を研究

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

平滑筋細胞(SMC)は、気道および肺内動脈の収縮を媒介して、それぞれ気流抵抗および肺循環を変化させ、したがって肺系の恒常性において重要な役割を果たしている。SMC収縮性の調節解除は、喘息および肺高血圧症を含むいくつかの肺疾患に寄与する。しかしながら、組織アクセスが制限され、インビボSMC表現型を維持するための培養系の欠如のために、これらの疾患における制御解除されたSMC収縮性の根底にある分子機構は完全に同定されたままである。精密切断肺スライス(PCLS)は、これらの技術的困難を回避するex vivoモデルを提供します。生きた薄い肺組織切片として、PCLSは自然環境においてSMCを保持し、SMC収縮およびSMC収縮性を調節する細胞内Ca2+シグナル伝達のその場での追跡を可能にする。ここでは、無傷の気道および肺内動脈を保存する詳細なマウスPCLS調製プロトコルが提供される。このプロトコルには、肺葉をスライスする前に、気管を通る低融点アガロースで気道を膨張させることと、右心室を通して肺血管にゼラチンを充填することの2つの重要なステップが含まれます。このプロトコルを使用して調製されたPCLSは、気道および肺内動脈区画の両方におけるSMCのCa2+媒介性収縮調節を評価するためのバイオアッセイに使用することができる。呼吸器疾患のマウスモデルに適用すると、このプロトコルはSMCの機能的調査を可能にし、それによって疾患におけるSMC収縮性調節緩和の根底にあるメカニズムへの洞察を提供する。

無傷の肺内気道および動脈を保存するマウスPCLS調製物 厚さ150μmのPCLSを倒立位相差顕微鏡で観察した。マウス肺では、伝導性気道は肺内動脈を伴い、丘陵から末梢肺まで走る。マウスPCLSにおける代表的な肺気道 - 動脈束を 図2Bに示す。気道は、内腔の内面を覆う活発な繊毛拍動を有する直方体上皮細胞によって容易に同定することができる。対照的に、近くの肺動脈は、平坦な内皮によって特徴付けられる。末梢肺野に到達すると、導電性気道は呼吸管および嚢に分岐し、小さな腺房内細動脈を囲む(図2C)。
マウスPCLSを利用して肺気道と動脈収縮を評価する メタコリン(MCh、1μM)誘導気道収縮は、 図2Bに実証される。気道収縮応答は、MChばく露後の管腔面積減少の割合によって定量化される(図2D</...

本プロトコールは、マウスの精密切断肺スライスを調製し、利用して、ほぼ in vivo環境における 気道および肺内動脈平滑筋収縮性を評価することを記載している。

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

PCLSは、ほぼ無傷の組織環境における気道および血管平滑筋細胞活性の評価をサポートし、それによって肺研究のための非常に貴重なエクスビボモデルを提供する。平滑筋研究の面では、精密に切断された肺スライスは、平滑筋細胞のin vivo表現型およびそれらの周囲構造との相互作用を維持しながら、平滑筋細胞へのアクセスを可能にするが、これは細胞レベルでの機構的研究にとって重要である。まず、マウスの本体を仰臥位の解剖ボードの上に置きます。尾、前足、および頭を25Gシリンジ針で固定し、70%エタノールで体を消毒します。胸骨と横隔膜の上の両側下胸郭に沿って胸腔を慎重に開きます。次に、鋭いはさみの先端を肺組織から遠ざけ、両側腹側胸郭の一部を取り外して心臓を露出させます。胸腔が開くと肺葉が崩壊することを確認します。はさみを使用してマウス首の軟部組織を除去し、気管を露出させます。気管の上端に直径1.2ミリメートルの小さな穴を開けて、20G Y字型のIVカテーテルチップを通過させる必要があります。Y字型カテーテルの一方のアダプターポートを、0.5ミリリットルの空気を予め充填した3ミリリットルのシリンジに接続し、もう一方のポートを摂氏42度に温めた2ミリリットルの1.5%アガロース溶液を予め充填した3ミリリットルのシリンジに接続します。アガロース溶液を注入してカテーテルを満たし、次にカテーテルを開口部から気管内に5〜8ミリメートルに押し込む。アガロース溶液を5秒あたり1ミリリットルの速度でゆっくりと注入する。肺が近位から遠位軸に沿って膨張するのを観察してください。各肺葉の端が膨らんだら注射を停止します。次に、他のシリンジから0.2〜0.3ミリリットルの空気を注入し、残留アガロースを遠位肺胞腔への導電性気道に押し込む。クリップは、一対の湾曲した止血鉗子で気管を閉じた。肺血管系を充填するには、1ミリリットルのシリンジに暖かい6%ゼラチンを入れ、針頭皮静脈カテーテルに接続します。カテーテルにゼラチン溶液を充填し、下壁に近い右心室を針で穿刺する。針を右心室に2〜3ミリメートル押し込み、針先を主肺動脈に向けます。約0.2ミリリットルのゼラチン溶液を右心室および肺動脈血管にゆっくりと注入する。注射後5分間針を所定の位置に保ち、氷冷HBSS溶液を心臓と肺に注いで肺葉を冷やし、体を冷蔵庫に入れます。このステップの後、はさみで周囲の結合組織からマウスの肺と心臓を取り除きます。次に、各肺葉を分離し、氷上のHBSS溶液に保管します。肺葉をトリミングし、切断方向がヒラから肺表面までのほとんどの気道に対して垂直になるように向きます。スーパー接着剤で試料カラムの上に取り付けます。新鮮な薄いカミソリの刃でビブラトームを使用して、肺葉を150マイクロメートルのスライスに切断します。冷たいHBSS溶液を予め充填した滅菌ペトリ皿にスライスを集める。スライスをDMEM/F-12培養液で満たされたペトリ皿に移します。実験の前に一晩37°Cのインキュベーターに皿を置きます。HBSSで満たされた24ウェル培養プレートの各ウェルに単一の精密切断肺スライスを置きます。ウェルの中央にあるスライスの位置を確認し、ピペットでHBSS溶液を取り出します。顕微鏡下で、スライス内の標的気道および血管を見つけ、次に、標的気道血管領域を露出させるために、予め切断された中央穴を有するナイロンメッシュを使用してそれを覆う。メッシュの上に中空の金属ワッシャーを置き、スライスを所定の位置に保持します。次に、600マイクロリットルのHBSS溶液を加えてスライスを沈める。10 分後、ベースライン イメージを記録します。気道または血管収縮を誘導するには、HBSS溶液をピペットで慎重に除去し、アゴニストと共に600マイクロリットルのHBSSを加える。カルシウム色素ローディングバッファーを調製するには、まず、50マイクログラムの色素を10マイクロリットルのDMSOおよび0.2グラムのプルロニックF-12粉末とともに1ミリリットルのDMSOに溶解する。10マイクロリットルのプルロニック溶液と10マイクロリットルのカルシウム色素溶液を混合する。この混合物を、200マイクロモルのスルホブロモフタレインを含む2ミリリットルのHBSS溶液に加える。次いで、2ミリリットルのカルシウムローディングバッファーに15個の精密切断肺スライスを入れ、摂氏30度で1時間インキュベートし、続いて100マイクロモルのスルホブロモフタレインを含むHBSS中で30分間インキュベートした。次に、カルシウム色素を装填したスライスを大きなカバーガラスの上に置きます。高真空シリコーングリースを18G鈍針または200マイクロリットルピペットチップに取り付けられた3ミリリットルのシリンジに充填し、カバーガラスを横切ってスライスの上下に2本の平行線を引きます。2本のグリースラインの間にナイロンメッシュを使用してスライスを覆います。2 番目のカバー ガラスをメッシュの上に置き、チャンバーを生成します。HBSSまたはアゴニスト溶液をピペットで一端からチャンバーに入れる。ティッシュペーパーでもう一方の端から吸引することによってチャンバから流体を取り出す。スライスのチャンバーは、高速レーザー走査共焦点顕微鏡によるカルシウムイメージングの準備が整いました。肺気道動脈束を、位相差顕微鏡下で厚さ150マイクロメートルの精密切断肺スライスで観察した。安静状態では、近くの肺動脈を有する直方体上皮細胞によって気道が同定された。メタコリンへの曝露後、肺動脈は刺激に対する応答を示さなかったが、内腔領域は減少した。気道収縮応答は、管腔面積減少の割合によって定量化され、1日および5日間の培養において同様の用量依存性応答を示した。末梢肺野に到達すると、導電性気道は、小さな腺房内細動脈を囲む気管および嚢に分岐する。内皮に曝されると、気道および肺動脈の両方が収縮し、続いてNOC-5誘導弛緩が続く。安静状態では、カルシウム色素装填スライスは、共焦点蛍光顕微鏡下で気道および血管系の平滑筋細胞において低い蛍光を示した。アゴニストに曝露すると、カルシウム蛍光強度は細胞内で上昇し、細胞全体に伝播し、これは振動シグナルと相関した。賢明なテクニックでは、肺をアガロースで均質に膨張させ、迅速または過剰なアガロース注射を避けることが不可欠です。常に最後に空気を押して、アガロースを導電性気道から遠位肺胞空間に洗い流します。要約すると、精密切断肺スライス培養物を使用して、特別な様々な肺平滑筋機能を提供し、インビトロで平滑筋調節解除をモデル化することができる。また、novo血管拡張薬または気管支拡張薬をスクリーニングするための理想的なプラットフォームを提供します。

utilizing-precision-cut-lung-slice-to-study-contractile-regulation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

低酸素肺血管収縮(HPV)は、肺胞低酸素肺灌流で換気に一致する重要な生理学的現象である。HPVに寄与する主要な血管セグメントは、口腔内動脈である。ここでは、直径20~100μmのマウス肺血管のHPVの分析プロトコルについて説明します。...

マウス精密切り出肺スライスを用いた低酸素肺血管収縮のビデオモルフォメトリクス解析

我々は、精密カット肺スライス（PCLS）を生成し、肺における種々の免疫細胞型の局在を可視化するために、それらを免疫染色するための方法を記載しています。我々のプロトコルは、種々の条件下で多くの異なる細胞型の位置と機能を可視化するために拡張することができます。...

精密カットライブ肺樹状細胞を可視化するために、マウスの肺スライスを

ここに提示されるPCLSマウス肺組織の血管収縮性を維持するためのプロトコルは、多数の手順に影響を受けやすい最大10日間保存することができる肺血管構造および気道の洗練された3次元画像をもたらす。...

前生体肺の構造と収縮性研究のための効率的なツールとしての精密切断肺スライス

動脈肺循環の血管応答は、肺内動脈(IPA)および血管平滑筋細胞(VSMC)を使用して探索できます。本研究では、IPAの分離と、生理学的刺激に応答した血管弛緩の調査に使用されるプロトコルについて詳しく説明します。...

血管応答を調べるための肺内動脈および平滑筋細胞の分離

ランダムドットkinematogramsとコンピュータで生成された無脊椎動物のビデオ再生を採用したオペラント条件づけパラダイムを使用して、トカゲの視覚感度のテスト。...

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

モデルとしてジャッキー竜を使用して作られた刺激。...

コンピュータによって生成された動物モデルの刺激

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

このビデオでは、マウスでは閉塞性気道疾患（OAD）の開発を研究するには、2つの実験モデル、異所および同所性気管移植モデルを示し、比較します。...

閉塞性気道疾患の発生研究のモデルとして使用されるマウスにおける異所性と同所性気管移植

臍帯は、異なる方法で平滑筋細胞を単離するために使用されています。本研究では孤立した平滑筋細胞への酵素処理を使用していました。...

ヒト臍帯動脈平滑筋細胞の単離（HUASMC）

テロメラーゼの触媒サブユニットを分離するための努力、TERTは、構造的な研究のための十分な量で、10年以上の限られた成果しかされています。ここで、我々は組換えコクヌストモドキTERT（単離するための方法を提示...

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

学ぶ精密切断肺スライス法によるマウス気道・肺動脈平滑筋収縮の評価。生体内環境を保持したエクスビボモデルで、呼吸器疾患の病態解明と治療薬開発に有用です。

精密切断肺スライスを利用して気道・肺内動脈平滑筋の収縮調節を研究

さらに動画を探す