高生存率組織採取のためのげっ歯類における低侵襲脳腫瘍切除術の実施

これは、脳腫瘍の治療法に関する前臨床研究で非常に必要とされている脳腫瘍切除パラダイムです。低侵襲アプローチによる標準化された切除を可能にすると同時に、自動組織保存システムにも結合されています。このプロトコルは、動物が手術後に生き残ることを可能にし、したがって、同じ動物での治療後の病状の変化を理解するのに役立ちます。

これは、シーケンシャルおよびタイムラプス治療アプリケーションに役立ちます。この手法を使用して、病気の生物学を評価し、その後の管理を計画することができます。これは、創薬と新規治療法において重要な意味と機会を持っています。

標準化された切除、低侵襲アプローチ、および自動組織保存の概念は、肝腫瘍や頭頸部がんなど、さまざまな臓器系の他のタイプの腫瘍に拡張できます。プロトコルはシンプルで、システムはユーザーフレンドリーです。必要なすべての手順とトラブルシューティングを含む公開プロトコルを読むのが最善です。

つま先をつまんでマウスの鎮静を評価することから実験を開始します。角膜の乾燥を避けるために眼科用軟膏を目に塗ります。次に、定位フレームにマウスを置きます。

前の手術からステープルを取り除き、クロルヘキシジンまたはベタインベースのスクラブとアルコールの交互のサイクルで皮膚を消毒します。次に、滅菌メスを使用して、前の外科的瘢痕に沿って1センチメートルの縦正中線切開を作成します。MIRSハンドピースをステージアダプターを介して定位アームに取り付けます。

MIRSマシンをセットアップするには、背面パネルにセットされている電源コードを電源コードレセプタクルに挿入します。0 と 1 を切り替えて、システムの電源をオンまたはオフにします。窒素ホースの一方の端をコンソールの背面パネルのオスフィッティングに挿入します。

接続ナットを時計回りに回して締めます。供給圧力が100PSIGを超えないことを確認し、ホースを窒素供給に取り付けます。漏れを防ぐために、真空ポートの蓋を密閉してください。

コンソール前面の吸引ノブが100に設定されていること、吸引システムに漏れがないこと、および窒素入力供給圧力が正しいことを確認してください。灰色のフットペダルコネクタを、カチッと音がするまで灰色のレセプタクルに挿入します。同様に、青いハンドピースコネクタを青いレセプタクルに挿入します。

滅菌液をチューブとハンドピースを介して開口部に吸引し、次にキャニスターに吸引して、各ハンドピースをプライミングし、チューブとハンドピースの内部が潤滑されていることを確認します。コンソールのフロントパネルで吸引モードを選択し、フットペダルの使用を開始します。23 G MIRSカニューレをバリ穴に2.5ミリメートルの深さまで挿入します。

カニューレに接続されたフットペダルを押して切除プロセスを開始します。ハンドピースのコントロールノブを使用して、切除の全サイクルを実行します。切除プロセスの後、23ゲージのMIRSカニューレを引き出し、5ミリリットルの1X PBSを追加してチューブを洗い流し、残留破片を取り除きます。

次に、ホッチキスで傷を閉じ、マウスを定位フレームから取り外します。マウスをケージに戻す前に、マウスを加熱パッドに戻して麻酔から回復します。実験後、冷やした培地と空気でカニューレをパージして、切除したすべての組織を収集キャニスターに押し戻します。

システムから収集キャニスターを取り外し、キャップを取り付けます。次に、カニューレの遠位先端を3%過酸化水素に入れ、吸引を適用して吸引ラインを吸引収集キャニスターに戻します。60〜90秒間放置し、断続的に空気と媒体をパルスして洗い流します。

腫瘍サンプルをRBC溶解培地を含む組織培養皿に室温で5分間浸します。次に、70ミクロンのフィルターを50ミリリットルの円錐形のチューブに置き、シリンジプランジャーを使用して腫瘍サンプルをフィルターに通します。トランスファーピペットでは、RPMI 1640培地を使用して、細胞と組織塊をフィルターに通します。

摂氏4度で428倍Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、各サンプルを5ミリリットルの調製RPMI 1640培地に再懸濁します。サンプルをシェーカーインキュベーターに200°C、200RPMで37分間入れます。

インキュベーション後、サンプルを428倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。単一細胞を70ミクロンのセルストレーナーでろ過し、摂氏4度で274倍Gで3分間遠心分離します。トリパンブルーと血球計算盤で細胞生存率分析を行います。

MIRSを使用したマウスの外科的切除は、腫瘍量が大きいグループと小さいグループの両方の平均ベースライン生物発光シグナルの減少によって示されるように、腫瘍量の有意な減少を引き起こしました。切除前の腫瘍MRI画像と比較して、切除後のスキャンでは、切除腔は腫瘍接種部位の大きな丸い低信号領域として識別できます。H&E染色切片では、血液製剤、炎症、および残存腫瘍細胞の縁を有する透明な円形切除腔が観察された。

切除開口を2回転させると切除量が有意に増加し,腫瘍量に応じた切除量を最適化できた。未治療の腫瘍を有するマウスとMIRSによる腫瘍の切除を受けたマウスにおける生存率の比較は、小腫瘍群において16日から22日への生存の増加を示した。同様に、腫瘍量が多いグループでは、生存期間の中央値が12日から19日に増加しました。

組織保存システムから採取されたサンプルの光学顕微鏡画像は、0日目に組織のいくつかの小さな塊が存在する単一細胞として現れました。7日後、MIRSで採取した細胞は浮遊培養でニューロスフェア形成を示し、腫瘍開始の可能性を示しました。システムの詰まりを防ぐために、手順の直後にチューブシステムをパージしてフラッシュすることが重要です。

この手順に続いて、低侵襲切除システムによる外科的切除後の生き残った動物に、治療法の有効性研究および診断および予後マーカーの研究を使用できます。