Name: クライオ電子顕微鏡による微小管-タンパク質複合体の研究のための哺乳類細胞からの修飾微小管抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶ哺乳類細胞からの修飾微小管抽出法。HCT116細胞を用いて超遠心分離とGTP・パクリタキセル処理により微小管を重合させ、クライオ電子顕微鏡解析に適した高品質サンプルを調製する手法を解説。

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Sixma、Brummelkamp、Perrakisグループのすべてのメンバーの実りある科学的議論と快適な作業環境の提供に感謝し、特に、 図3Cに示されているタンパク質濃度の決定を支援してくれたJan Sakoltchik(「人2」)に感謝します。また、NKIクライオEM施設とライデン大学のオランダ電子ナノスコピーセンター(NeCEN)の支援にも感謝します。この作業は、T.R.B.に授与されたNWO Vici助成金016.Vici.170.033によってサポートされました。A.P.とT.R.B.はオンコード調査員であり、NWO ENW(OCENW.L.L.はオーストリア科学基金(FWF JB4448-B)から資金提供を受けました。この研究は、オランダ癌協会とオランダ保健福祉スポーツ省の制度的助成金によって支援されました。

注意: このプロトコルで使用されるすべての材料と機器に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. 細胞培養
注:すべての細胞培養は、滅菌層流フードで行う必要があります。
<ol><li>このプロトコルに従うには、まず凍結細胞のバイアルを37°Cの水浴中で解凍します。ここでは、3つの既知の脱チロシン化酵素であるVASH1、VASH2、およびMATCAPを欠く遺伝子組み換えHCT116細胞株を使用して、チロシン化チューブリンを作成します。</li>
	<li>10 mLの適切な細胞培養培地を含むØ10 cmプレートを準備します。 注:このプロトコルでは、10%v / v FCS(ウシ胎児血清)およびペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質(培養培地)を添加したDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)を遺伝子組み換えHCT116細胞株に使用しました。</li>
	<li>細胞をカウントし、準備した10 cmプレートに~2.5×10個の6 個の生細胞(~20%コンフルエント)を播種します。プレートを軽く振って、細胞を均等に分散させます。細胞が80%〜90%のコンフルエントに達するまで、5%(v / v)CO2 でガス化された37°Cの細胞培養インキュベーターで皿をインキュベートします。 注:通常、HCT116細胞の場合、これには3日かかりますが、時間は特定の播種密度と使用する細胞株に依存する可能性があります。</li>
	<li>ピペットまたは真空アスピレーターを使用して細胞培養培地を廃棄し、皿2 x 5 mLのPBSを洗浄します。 注意: PBSをセル単層に強く分注しすぎると、セルがプレートから剥がれる可能性があるため、注意してください。</li>
	<li>1〜2 mLのトリプシンを加え、インキュベーター内で細胞を2〜5分間インキュベートして細胞を剥離します。</li>
	<li>プレートに2 mLの培養液を加えて、トリプシンをクエンチします。</li>
	<li>細胞懸濁液を3〜5等分し、それらを再播種して、6〜12個のコンフルエントな15 cmプレートが得られるまで培養液中の細胞を拡張します。</li>
</ol>2.収穫
<ol><li>10 mLのPBS(1x)で細胞を穏やかに洗浄し、細胞培養培地を除去します。</li>
	<li>5 mM EDTA(滅菌/ろ過)を添加した3 mLの氷冷PBSを用いて室温で5分間細胞をインキュベートし、続いてセルスクレーパーを使用して、細胞をプレートから剥離します。</li>
	<li>氷上で50 mLチューブに細胞を集め、スピンダウンします(10分、250 × g)。<ol><li>採取した細胞の体積を50 mLチューブ上の容量スケールでメモします。 注:予想される容量は、~0.5mLから4mLの間の任意の場所にあります。一時停止ステップ:LN2中のセルペレットをフラッシュ凍結し、使用するまで-20°Cで保存します。セルペレットは数週間または数ヶ月間しか保存できないことに注意してください。ペレットをより長く保持すると、収量が低下したり、微小管がまったくなくなったりする可能性があります。</li>
	</ol></li>
</ol>3.微小管抽出
注意: 手順3.1〜3.5のすべてを氷上に置いてください。ステップ3.6以降のすべては暖かく保つ必要があります(30-37°C)。
<ol><li>100 mMパイプ/KOH(pH 6.9)、2 mM EGTA/KOH、1 mM MgCl2、1 mM PMSF、および1つのプロテアーゼ阻害剤錠剤(ミニ)を含む10 mLの氷冷溶解バッファーを調製します。</li>
	<li>採取した細胞ペレットを1:1 v/v溶解バッファーに再懸濁します(正確な量に疑問がある場合は、溶解バッファーを増やすのではなく、少なくします)。</li>
	<li>超音波処理によって細胞を溶解する:15秒オン、45秒オフ、アンプ30、4サイクル(実験的に条件を決定し、超音波処理器に応じて変更)。<ol><li>超音波処理後、SDS-PAGE分析のためのサンプルを収集します:ライセート2μL+ 水18μL+ 5x SDSサンプルバッファー5μL。 注:細胞が実際に完全に溶解したかどうかを標準の光学顕微鏡で確認してください。</li>
	</ol></li>
	<li>溶解した細胞を遠心チューブにピペットで入れます。超遠心ローターで4°Cで100,000 × g で1時間回転し、ライセートを除去します。 注意: 遠心分離機の正しいバランスを確保するために、ローターのすべてのポケットが乾いていて清潔であることを確認してください。</li>
	<li>注射器を使用して、クリアしたライセートを取り出します。ペレットと上部の浮遊層を乱さないように注意してください。<ol><li>透明化したライセートのサンプルを収集します:ライセート2 μL+水18 μL+ 5 μLの5x SDSサンプルバッファー。</li>
		<li>ペレットを注意深くすすぎ、ペレットを通してP10ピペットチップを回転させてペレットを少しすくい上げます。200 μLの水と50 μLのSDSバッファーを加えます。</li>
	</ol></li>
	<li>前のステップの上清に1 mM GTPと20 μMパクリタキセルを補充して微小管を重合します。1 mLの容量の場合、10 μLの2 mMパクリタキセルと10 μLの100 mM GTPを追加します。 注意:パクリタキセルは、皮膚の炎症、深刻な目の損傷、呼吸器の炎症、遺伝的欠陥、胎児の損傷、および臓器の損傷を引き起こす可能性があります。.長期または反復暴露は臓器に損傷を与えます。いかなる方法でも、物質を吸い込んだり、スプレーしたり、ほこりを払ったりしないでください。皮膚との接触を防ぐためにゴム製のニトリル手袋を着用してください。</li>
	<li>GTP/パクリタキセルを添加した上清を37°Cで30分間インキュベートし、微小管を組み立てます。</li>
	<li>このインキュベーションステップでは、ローターと超遠心分離機を30°Cまで温めます。</li>
	<li>クッションバッファーの調製:0.4 mLの溶解バッファーに0.6 mLのグリセロールを加え、混合物に20 μMのパクリタキセルを補充します。クッションバッファーを37°Cに予熱します。</li>
	<li>800 μLのクッションバッファーを超遠心チューブに加えます。GTP/パクリタキセルを添加したライセートをクッションバッファーの上に注意深くピペットで留めます。 注意: 非常に穏やかにピペッティングすることにより、クッションバッファーとライセートの混合を防ぎます。</li>
	<li>超遠心ローターで30°C、100,000 × g で30分間回転します。遠心分離チューブの外向きの端に印を付けて、微小管ペレットが形成される場所を簡単に認識できるようにします。</li>
	<li>微小管ペレットを乱さないように注意しながら、ピペットを使用してクッションバッファーを慎重に取り除きます。<ol><li>クッションバッファーのサンプルを収集します:2 μL + 18 μLの水+ 5 μLの5x SDSサンプルバッファー。</li>
	</ol></li>
	<li>ペレットを温かい溶解バッファーで3回注意深く洗浄し、グリセロールを除去します。ペレットの横にある温かいバッファーを静かに分注し(液体をペレットに直接流さないでください)、チューブを数回回転させてペレットとチューブの壁からできるだけ多くのグリセロールを除去してから、吸引して繰り返します。 注:グリセロールが適切に洗い流されない場合、グリッドは電子照明の下で非常に急速に溶けます。これは、粒子の動きが大きく、ぼやけた画像を作成することで証明される可能性があります。</li>
	<li>100 mMパイプ/KOH(pH 6.9)、2 mM EGTA/KOH、および1 mM MgCl2の成分を含む再懸濁バッファーを調製し、バッファーを37°Cに温めます。</li>
	<li>洗浄したペレットをカットチップで~50 μLの予温した再懸濁バッファーに穏やかに再懸濁し、チューブを37°Cに保ちます。<ol><li>再懸濁ペレット画分のサンプルを収集します:2 μL + 18 μLの水+ 5 μLの5x SDSサンプルバッファー。 先端:カットチップは微小管の破損を防ぎます。金属製の加熱ブロックを37°Cに用意し、サンプル管を室温まで冷却せずに簡単に輸送できるように、ポリスチレンボックスに保管してください。</li>
	</ol></li>
</ol>4. クライオ電子顕微鏡グリッドの準備
<ol><li>吸い取り紙を取り付けて、プランジフリーザー装置を準備します。プランジフリーザーを30°Cまで温め、加湿を100%に設定します。温度と湿度を平衡化するために~30分待ちます。</li>
	<li>プランジフリーザーの設定を2つのアプリケーションに準備し、プログラム全体を一度実行して、設定が正しく設定されていることを確認します。最初のアプリケーションの力が10、2秒のブロット時間、および0秒の待機時間であり、2番目のアプリケーションの力が10、6.5秒のブロット時間、および10秒の待機時間であることを確認します。</li>
	<li>クライオEMグリッドを30mAで60秒間グロー放電します。</li>
	<li>LN2でポリスチレン容器アセンブリを冷却し、エタンガスを冷たい金属カップに凝縮して金属カップで液体エタンを準備します。</li>
	<li>100 mM PIPES/KOH (PH 6.9)、2 mM EGTA/KOH、および 1 mM MgCl2 の成分を含む希釈バッファーを準備し、37 °C に温めます。</li>
	<li>微小管相互作用タンパク質をグリッドに適用する直前に希釈バッファーで1:1 v/vに希釈して、塩濃度を確実に下げます(最終塩濃度50 mM NaClを使用しました)。混合物を37°Cに保ちます。</li>
	<li>プランジピンセットでグロー放電グリッドをつかみ、プランジフリーザーにクリックします。</li>
	<li>液体エタンの入ったポリスチレン容器をプランジフリーザーに入れ、準備したプログラムを実行します:最初に3.5 μLの微小管溶液をグリッドに塗布し、プランジフリーザーでグリッドを吸い取り、次にすぐに3.5 μLの新たに希釈したタンパク質を塗布し、最後にプランジャーを吸い取り、液体エタンでグリッドを急落凍結させます。</li>
	<li>グリッドをグリッドストレージボックスに移し、イメージングするまでLN2デュワーに保管します。</li>
</ol>

<ol><li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li>
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<li>Maurer, S. P., Fourniol, F. J., Bohner, G., Moores, C. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBs+Recognize+a+nucleotide-dependent+structural+cap+at+growing+microtubule+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EBs Recognize a nucleotide-dependent structural cap at growing microtubule ends.</a> Cell. 149 (2), 371-382 (2012).</li>
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<li>Kellogg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+model+of+microtubule-tau+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Near-atomic model of microtubule-tau interactions.</a> Science. 360 (6394), 1242-1246 (2018).</li>
<li>Brotzakis, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+ensemble+of+a+Tau-microtubule+complex+reveals+regulatory+Tau+phosphorylation+and+acetylation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">A structural ensemble of a Tau-microtubule complex reveals regulatory Tau phosphorylation and acetylation mechanisms.</a> ACS Central Science. 7 (12), 1986-1995 (2021).</li>
<li>Kellogg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+distinct+mechanisms+of+action+of+taxane+and+non-taxane+microtubule+stabilizers+from+cryo-EM+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insights into the distinct mechanisms of action of taxane and non-taxane microtubule stabilizers from cryo-EM structures.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (5), 633-646 (2017).</li>
<li>Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+assembly+purification+of+microtubules+without+assembly-promoting+agents+and+further+purification+of+tubulin%2C+microtubule-associated+proteins%2C+and+MAP+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments.</a> Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).</li>
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</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

この方法では、細胞株から内因性チューブリンを迅速に抽出し、その後、それらの微小管をクライオEMグリッド上に装飾する方法を説明しています。微小管は温度に敏感です。それらは寒い環境で解重合し、暖かい環境で重合します31。したがって、チューブリンを可溶化するために、4°Cで超音波処理およびクリアランススピン(ステップ1.1-1.5)を実行することが重要です。このステップで解重合しないほど微小管を安定化させる要因がある場合、これらの微小管と安定化因子は、最初のクリアランススピン後にペレットに廃棄されます。微小管を(再)重合した後は、重合した微小管を含む溶液を常に保温することが重要です。VASH1、VASH2、およびMATCAPタンパク質が不足しているHCT116細胞から微小管を抽出しました。組織と同様に他の細胞株を使用して微小管を抽出することができます29が、汚染物質、チューブリンアイソタイプ、および収量は、ここに記載されているものとは非常に異なる場合があります。修飾酵素を含む過剰発現プラスミドは、特定のチューブリン修飾を導入するためにも使用できます。
他のプロトコル18、27、28、29、30は、微小管の重合および解重合の複数サイクルを使用して、他の相互作用タンパク質の空隙微小管を得る。ここでは、これらのプロトコルを簡素化し、微小管を一度だけ重合しました。この単一の重合のために、これらの微小管は他の微小管相互作用タンパク質と共沈降する可能性があります。しかし、このプロトコルは、クライオEMの目的で十分に純粋な微小管を提供することを発見しました。特定のアッセイでより純粋なサンプルが必要な場合は、重合と解重合の追加のサイクルでより純粋なサンプルが得られる可能性がありますが、これは微小管の収量を犠牲にする可能性があります。このプロトコルでは、パクリタキセルを使用して微小管を重合しました。しかし、パクリタキセルは微小管格子を特定のねじれと上昇に偏らせる可能性があり、目的のタンパク質の微小管親和性を妨げる可能性があります。パクリタキセルが不適切な場合は、他の微小管安定化試薬を使用できます。これらの試薬の例は、ペロルシドなどの非タキサン分子またはGMPCPP17,32などの非加水分解性GTP変異体である。
クライオEMグリッド上の微小管に結合するタンパク質を構造的に調べるには、目的のタンパク質を微小管に十分な量結合させる必要があります。一般的に発生する問題は、溶液中で安定なタンパク質複合体がグリッド上でバラバラになることです。グリッド上にタンパク質複合体を形成するためには、まず微小管を層状にし、次に低塩濃度の微小管結合タンパク質を微小管被覆グリッドに適用し、タンパク質複合体をグリッド上で直接組み立てることが重要でした。他の人も同様に、微小管装飾を成功させるための低塩33,34プロトコルおよび2段階適用34,35,36プロトコルを報告している。塩濃度が低いと、静電荷が低下するため、タンパク質複合体がより安定した相互作用に偏る可能性があります。ただし、塩濃度が低いため、目的のタンパク質が沈殿するリスクがあります。したがって、グリッドをガラス化する直前まで、タンパク質を生理学的に関連する塩濃度またはその周辺に保つことを強くお勧めします。この2段階のアプリケーションプロトコルは、ブロッティングまたはプランジ凍結ステップ中にタンパク質複合体がバラバラになるのを防ぐ可能性があります。このプロトコルでは、Vitrobotを使用しました。ただし、より高速なガラス化法(VitroJet)またはブロットフリーグリッド(Puffalot)または両方の特性を持つデバイス(カメレオン)の使用は、2段階のアプリケーションを克服する可能性がありますが、これらは現在、テストに広く利用できません。
再構築されたクライオEM密度の最終的な分解能は、微小管に対する微小管結合タンパク質の動きや達成できる装飾のレベルなど、多くの要因の影響を受ける可能性があります。より高い微小管装飾は、3D密度再構成で得られる最終的な解像度に有益である可能性が高い。これは、微小管結合タンパク質の精製中に得られる最高タンパク質濃度、微小管相互作用タンパク質が凝集することなく耐えることができる最低塩濃度、および微小管相互作用タンパク質の結合モード(例えば、タンパク質が複数のチューブリン二量体にまたがる可能性があるため、1:1の結合比を妨げる)などのいくつかの要因によって制限され得る。クライオEM再構成の分解能は、まばらに装飾された微小管によって損なわれる可能性がありますが、計算解析は、最近報告された微小管-タンパク質複合体構造が非常にまばらに装飾されたことに代表されるように、多くの問題を回避できます8。
ここで説明するプロトコルは、クライオEMの目的に適した微小管を取得するための迅速で低コストの方法を提供します。市販のブタ脳チューブリンとは対照的に、MATCAP欠損およびバソヒビン欠損HCT116細胞由来の微小管は完全にチロシン化されています(図4)。高価な試薬である市販のHeLaチューブリンは、原則として比較的均一にチロシン化されており、グルタミル化などの他の修飾4 はほとんど含まれていませんが、バッチは異なる可能性があり、修飾は in vitroでのみ達成できました。カスタムメイドの細胞株から微小管を抽出する利点は、チューブリンデチロシナーゼなどのチューブリン修飾酵素を過剰発現または欠失させて、より均質な微小管のプールを作成する柔軟性があることです。これは、クライオEMサンプルの装飾と均一性に利益をもたらし、最終的にはこのサンプルに由来するクライオEM密度マップと分子構造の容易さと品質に利益をもたらします。

微小管は細胞骨格の重要な部分です。それらは細胞の移動や分裂などのさまざまな機能に関与していますが、細胞内の組織化にも貢献しています。微小管は、さまざまな機能的運命に適応するために、さまざまな微小管関連タンパク質(MAP)や酵素などのタンパク質と相互作用し、これらを総称して「微小管相互作用タンパク質」と呼びます。これらのタンパク質の微小管結合は、一般に「チューブリンコード」と呼ばれるさまざまなチューブリン修飾によって導かれる可能性があります1。この好みの例は、p1503の有糸分裂セントロメア関連キネシン(MCAK)2およびダイニン-ダイナクチンCAP-Glyドメインであり、これらは好ましくはチロシン化チューブリンと会合し、一方、キネシンモーターセントロメア関連タンパク質E(CENP-E)4およびキネシン-25は、C末端チロシンを欠くチューブリンを好む。
微小管-タンパク質相互作用の研究にはさまざまな方法を使用できますが、クライオ電子顕微鏡(クライオEM)は、原子に近い分解能でこれらの相互作用を研究するためによく使用されます6,7。近年、クライオEM構造により、ダイニン8,9,10やキネシン11などの大きなモータータンパク質、EB312,13やMCAK 14などの+TIPタンパク質、タウ15,16などの他のタンパク質、さらにはパクリタキセル、ペロルシド、ザンパノリドなどの小分子がどのようになっているかが明らかになりました17微小管と相互作用します。微小管−タンパク質相互作用を研究するために、微小管は典型的にはブタの脳から抽出される18。これに続いて、クライオEM微小管構造を含むほとんどのin vitro研究は、ブタ脳チューブリンを使用して実施されます。したがって、これらの研究の結果は、組織と細胞型の間のチューブリン修飾19の不均一な性質の重要性を曖昧にしています。これは、微小管に結合するために特定の修飾を必要とする、または好むタンパク質を調査するときに特定の問題を引き起こします。これは、微小管デチロシナーゼMATCAPの基質であるチロシン化チューブリンで説明できます。
脱チロシン化は、α-チューブリンのC末端アミノ酸チロシンが欠損しているチューブリン修飾であり、これは有糸分裂、心臓、および神経機能に関連しています20。完全にチロシン化された微小管はMATCAPの理想的な基質ですが、この組織中のバソヒビン21,22およびMATCAP 23デチロシナーゼの機能のために、ブタの脳からの市販の微小管にはほとんど存在しません22,23,24,25,26 .市販のHeLaチューブリンは主にチロシン化微小管を含んでいますが、脱チロシン化が起こる可能性があり、したがって、このチューブリン源はクライオEM分析用の均一なサンプルを作成するのにはあまり適していません。
MATCAPの微小管への結合を刺激し、構造解析用の均質なサンプルを作成するために、完全にチロシン化された微小管の供給源を探しました。この目的のために、MATCAPおよびバソヒビン欠損細胞株が作成され、完全にチロシン化された微小管を抽出するために使用された。抽出手順は、微小管の重合と解重合の繰り返しサイクルを使用して、脳組織または細胞からチューブリンを抽出する確立されたプロトコルに基づいていました18、27、28、29、30、単一の重合ステップとグリセロールクッション上での遠心分離のみで。次に、MATCAPを例に、これらの微小管をクライオEM研究にどのように使用できるかを示します。クライオEMグリッドを調製するために、低塩濃度での2段階の適用プロトコルについて説明します。この論文の方法は、クライオEM分析を実行するのに十分な量と純度でカスタマイズ可能な微小管の抽出について説明し、これらの微小管を使用してクライオEMグリッド上にタンパク質-微小管複合体を作成する方法に関する詳細なプロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>10 cm プレート</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>15 cm プレート</td><td>Thermo FisherScientific 168381</td><td></td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>50 mL チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>62.547255</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>300メッシュ quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3</td><td>Quantifoil Micro Tools</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td>クライオ電子顕微鏡グリッド調製</td></tr><tr><td>細胞スクレーパー</td><td>ファルコン</td><td>353085</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>108418</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3899</td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>エタンガス</td><td></td><td></td><td>クライオ電子顕微鏡グリッド調製</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Serana</td><td>s-FBS-EU-015</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>VWR</td><td>24.397.296</td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>GTP</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>G8877-1G</td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO細胞</td><td>自作</td><td>野生型 HCT116細胞 RRID:CVCL_0291</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>KOH</td><td>メルク</td><td>1.05033</td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>メルク</td><td></td><td>105833 微小管抽出</td></tr><tr><td>微小管結合タンパク質</td><td>自作</td><td></td><td>クライオ電子顕微鏡グリッド調製</td></tr><tr><td>ニードル</td><td>BD マイクロランス</td><td>300600</td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>パクリタキセル</td><td>サンタクルス バイオテクノロジー</td><td>sc-212517</td><td>注意 有毒、微小管抽出</td></tr><tr><td>PBS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP399</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ペニシリンおよびストレプトマイシン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P0781-100mL</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td></td><td>パイプス メルク</td><td>P8203</td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>PMSF (EtOH中)</td> <td>ロシュ</td><td>16837091001</td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>SDS サンプルバッファー</td><td>自作</td><td></td><td>品質評価</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD プラスティパック</td><td>309658</td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>ウルトラプロテアーゼテーブル ミニ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC0975224</td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>Whatman ブロッティングペーパー</td><td>Whatman</td><td>47000-100</td><td>クライオ電子顕微鏡グリッド preparation</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow フード</td><td></td><td></td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>GloQube</td><td>Quorum</td><td></td><td>クライオEMグリッド調製</td></tr><tr><td>グリッド収納ボックス</td><td>SWISSCI</td><td>41018</td><td>クライオEMグリッド収納</td></tr><tr><td>加熱ブロック、バッファー</td><td>を温めるための</td>電気または金属 <td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター、細胞培養</td><td>NUAIR</td><td></td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>LN2デュワー</td><td></td><td></td><td>クライオEMグリッド収納</td></tr><tr><td>プランジピンセット</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>0508-L5-PS</td><td>クライオ電子顕微鏡グリッド調製、ビトロボットポリスチレンボックスに合うように上部に穴を開ける</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>バッファーを暖かく保つために</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q700</td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>標準光学顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX 41</td><td>品質評価</td></tr><tr><td>TLA 100.3 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>TLA 120.2 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>TLA 100.3 ローター用チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>326819</td><td></td></tr><tr><td>TLA 120.2ローター用微</td>小管抽出チューブ <td>ベックマン・コールター</td><td>347356</td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>オプティマ MAX-XP</td><td>微小管抽出</td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>FEI、ThermoFischer Scientific</td><td>mark IV</td><td>クライオ電子顕微鏡グリッド調製</td></tr><tr><td>Vitrobot ポリスチレン容器アセンブリ金属製エタンカップ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>200703</td><td>Cryo-EM grid preparation</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td></td><td></td><td>細胞培養</td></tr></tbody></table>

クライオ電子顕微鏡による微小管-タンパク質複合体の研究のための哺乳類細胞からの修飾微小管抽出

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

微小管は細胞骨格の重要な部分であり、細胞内の組織化、細胞分裂、および遊走に関与しています。翻訳後修飾に応じて、微小管は様々な相互作用タンパク質と複合体を形成することができる。これらの微小管-タンパク質複合体は、しばしばヒトの疾患に関与しています。このような錯体の構造を理解することは、その作用機序の解明に有用であり、クライオ電子顕微鏡(クライオEM)で研究することができます。このような構造研究のための複合体を得るためには、特異的な翻訳後修飾を含む、または欠失する微小管を抽出することが重要である。ここでは、遺伝子組み換え哺乳類細胞から内因性チューブリンを抽出するための簡略化されたプロトコルについて述べ、微小管重合とそれに続く超遠心を用いた沈降を含む。抽出されたチューブリンは、目的の精製された微小管結合タンパク質に結合した微小管を有するクライオ電子顕微鏡グリッドを調製するために使用できます。一例として、3つの既知のチューブリン脱チロシン化酵素を欠くように操作された細胞株からの完全にチロシン化された微小管の抽出を実証します。次に、これらの微小管を使用して、クライオEMグリッド上で酵素的に不活性な微小管関連チューブリンデチロシナーゼとのタンパク質複合体を作成します。

チロシン化微小管に結合したチューブリンデチロシナーゼMATCAPをクライオEMにより調べた。そのために、3つの既知の脱チロシン化酵素であるVASH1/2とMATCAPをすべて欠く遺伝子組み換えHCT116細胞株から完全にチロシン化された微小管を抽出しました。6〜12個のコンフルエントな15 cmディッシュを使用して、約0.5〜4 mLの細胞ペレットから微小管を抽出しました(図1)。第2の遠心分離ステップ(ステップ3.11)の後、これは目に見えるが小さく透明なペレットを得る(図1I)。微小管の収量は通常~75μgです。ペレットが見えない場合は、微小管重合温度の不正確さ、使用するGTPまたはパクリタキセルの品質の問題、溶解バッファーの添加が多すぎるなど、前のステップのいずれかに問題があることを示している可能性があります。抽出された微小管の品質と濃度を評価するために、クーマシー染色SDSゲル上のサンプルを分析しました(図2A)。これらの分析により、抽出された微小管は比較的純粋であることが示されました。BSA定量から得られた補間微小管濃度は~1.4 mg/mLであった。これは、分光光度計で測定された数値とよく一致します(図2B、C)。
抽出したばかりの微小管は、クライオEM用のサンプルの作成に直接使用できます。微小管は顕微鏡写真では無傷で豊富に見えるはずです。さらなるクライオEM分析では、微小管が互いに交差するのを避けるために、顕微鏡写真あたりの微小管密度を低くすることが重要です(図3A)。微小管の破損または目に見えない微小管は、微小管が低分子化(低温またはGTP加水分解など)またはブロッティングおよびプランジ凍結パラメータが正しく設定されていないことを示している可能性があります。微小管の周りの背景は密集しており、おそらく未重合チューブリンが含まれています。
MATCAPの分子量は53 kDaであり、チューブリンモノマーのサイズのすぐ下に球状触媒ドメインを持っています。したがって、微小管上のMATCAPの装飾は視覚的に検出することができました。MATCAPに結合しなかった微小管は「滑らかな」エッジを示しましたが、MATCAPを結合した微小管は、微小管表面に電子密度の高いドットを特徴とする「粗い」エッジを示しました(図3B)。MATCAP結合微小管とMATCAP非結合微小管も計算された2Dクラスで区別できますが、形状とサイズにより、他の微小管相互作用タンパク質では異なる場合があります(図3C)。密度が実際に目的のタンパク質に属することを確認するために、実験的に決定または予測された構造を利用することができます。また、比較のためだけに微小管を含むコントロールグリッドを作成することをお勧めします。これは、微小管が十分に高濃度で無傷で重合および抽出されたかどうか、およびプランジ凍結プロセスが正しく実行されたことを示します。我々は、微小管の存在量が2回目のMATCAP適用でグリッド内で減少することに気づいた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65126/65126fig01.jpg"> 図1:実験ステップの視覚的ガイダンス。 (a)溶解前の細胞ペレット;(b)遠心分離前の超遠沈管内の超音波処理された細胞;(c)遠心分離後の超遠沈管内の超音波処理された細胞;(d)透明化された上清を有するシリンジ;(e)「白色浮遊層」を含む上澄み除去後の残留ペレット;(f)SDSクーマシーゲル用の細胞破片ペレットを有するP10チップ;(G)インキュベーション前のGTP/パクリタキセル添加上清;(H)超遠心管内のグリセロールクッションの上にGTP/パクリタキセルインキュベートした上清;(i)第2遠心分離工程後の微小管ペレットを清浄化する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65126/65126fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65126/65126fig02.jpg"> 図2:微小管の純度と濃度測定 。 (A)抽出プロトコール中に採取したサンプルとBSA濃度比較を示すクーマシー染色SDSページゲル。S1及びP1は、それぞれ第1遠心分離工程後の上清及びペレットに相当する。S2及びP2も同様に、第2の遠心分離工程に相当する。(B) Aから導出された相対BSA量の非線形回帰直線。P2(微小管)レーンの約50 kDaの微小管バンドの補間は、1.42 mg/mLの最終濃度を示しています。(C)再懸濁微小管(P2)を2名で測定し、TUBA1AとTUBB3の合計吸光係数(0.971)を補正したところ、平均および標準偏差濃度は1.46 mg/mL±0.14 mg/mLである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65126/65126fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65126/65126fig03.jpg"> 図3:顕微鏡写真の例 。 (A)MATCAPに結合した微小管を示す顕微鏡写真の例。緑色のボックスで示されている微小管は無傷で装飾されており、クライオEM分析に使用できます。オレンジ色のボックスで示されている微小管は、無傷で装飾された微小管ですが、その左側の微小管の近くに配置されています。そのため、クライオ電子顕微鏡分析に含めることはあまり適していません。赤い箱の中の微小管が交差して壊れています。これらはクライオEM分析から除外する必要があります。(B)左パネルの緑色で囲まれた微小管の拡大図。赤い矢印は、MATCAPを適用した顕微鏡写真の微小管にのみ現れた黒い点を示しており、したがって、微小管に結合したMATCAPに対応する可能性があります。(C) A から選択された微小管粒子の2Dクラスは、高装飾と低装飾を示し、MATCAPによる装飾が観察されなかった別のデータセットから2Dクラスを選択した例(右端のパネル)。スケールバー=(A)50nm、(B)25nm、(C)10nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65126/65126fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65126/65126fig04.jpg"> 図4:MATCAP欠損およびVASH1/2欠損トリプルノックアウト(TKO)HCT116細胞、市販のブタ脳、およびHeLaチューブリンに由来する微小管のイムノブロット分析。 略語:TKO =トリプルノックアウト。モノクローナル抗体 = モノクローナル抗体;pAb =ポリクローナル抗体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65126/65126fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、特定の微小管修飾酵素を欠くか含む可能性のある哺乳類細胞から内因性チューブリンを抽出し、特定の修飾のために富んだ微小管を得るためのプロトコルについて説明します。次に、抽出した微小管を精製した微小管結合タンパク質で修飾して、クライオ電子顕微鏡用のグリッドを準備する方法について説明します。

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

クライオ電子顕微鏡による微小管相互作用タンパク質の構造研究は、細胞のメカニズムを理解するために重要です。クライオEMグリッド上で相互作用するタンパク質に結合した均質な微小管を調製することは、成功に不可欠です。このプロトコルはシンプルで安価であり、クライオ電子顕微鏡に十分な量と品質で翻訳後修飾を制御した微小管を調製することができます。微小管は非常に温度に敏感です。したがって、解重合を防ぐために微小管含有溶液を暖かく保つことが重要です。はじめに、遺伝子改変HCT116細胞株をDMEM細胞培養培地中で6〜12個のコンフルエントプレートが得られるまで培養する。10ミリリットルのPBSで細胞をやさしく洗浄し、細胞培養培地を取り除きます。5ミリモルのEDTAを添加した3ミリリットルの氷冷PBSを用いて細胞を室温で5分間インキュベートし、続いてセルスクレーパーを使用して、細胞をプレートから剥離する。氷上で50ミリリットルのチューブに細胞を集め、250 Gで10分間回転させます。採取した細胞の体積をチューブ上の体積スケールでメモします。採取した細胞ペレットを等量の溶解バッファーに再懸濁し、超音波処理によって細胞を溶解する。超音波処理後、SDS-PAGE分析のために、18マイクロリットルの水と5マイクロリットルの5X SDSサンプルバッファーを含むチューブに2マイクロリットルのライセートを追加します。残りの溶解細胞を遠心分離管にピペットで入れ、超遠心ローターで摂氏4度で100, 000 Gで1時間回転させて、溶解液を除去します。シリンジを使用して、ペレットと上部の浮遊層を乱すことなく、透明にしたライセートを取り除きます。2マイクロリットルの透明ライセートを、18マイクロリットルの水と5マイクロリットルの5X SDSサンプルバッファーを含むチューブに加えます。ペレットを注意深くすすぎ、P-10ピペットチップをペレットに通してペレットを少しすくい上げます。次に、200マイクロリットルの水と50マイクロリットルのSDSバッファーを追加します。採取した上清に1ミリモルのGTPと20マイクロモルのパクリタキセルを加えて微小管を重合し、摂氏37度で30分間インキュベートして微小管を組み立てます。400マイクロリットルの溶解バッファーに600マイクロリットルのグリセロールを加えてクッションバッファーを調製し、混合物に20マイクロモルのパクリタキセルを補充します。バッファーを摂氏37度に予熱します。800マイクロリットルのクッションバッファーを超遠心チューブに追加します。次に、GTPパクリタキセルを添加したライセートをクッションバッファーの上に注意深くピペットで貼り付けます。チューブを超遠心機ローターに入れて、摂氏30度で100, 000 Gで30分間回転させます。チューブの外側に面した端に印を付けて、微小管ペレットが形成される場所を簡単に認識できるようにします。遠心分離後、ペレットを乱すことなくピペットを使用してクッションバッファーを注意深く取り除きます。ペレットの隣に溶解バッファーを注意深く加え、チューブを数回回転させてペレットとチューブの壁からできるだけ多くのグリセロールを除去してから、吸引して洗浄ステップを3回繰り返します。洗浄したペレットをカットチップで50マイクロリットルの予熱した再懸濁バッファーに穏やかに再懸濁し、チューブを摂氏37度に置きます。18マイクロリットルの水に2マイクロリットルの再懸濁ペレット画分と5マイクロリットルの5X SDSサンプルバッファーを加えます。吸い取り紙を取り付けて、プランジフリーザー装置を準備します。デバイスの温度を摂氏30度に設定し、加湿を100%に設定しますデバイスを30分間平衡化させます。2つのアプリケーションのためにプランジフリーザーの設定を準備します。最初のアプリケーションでは、力を 10、2 秒のブロット時間、0 秒の待機時間に設定します。2番目のアプリケーションでは、フォースを10、6.5秒のブロット時間、および10秒の待機時間に設定します。カーボン側を上にしてグリッドを金属グローディスチャージャー車両に配置します。クライオ電子顕微鏡(EMグリッド)を30ミリアンペアで60秒間グロー放電します。ポリスチレン容器アセンブリを液体窒素で冷却し、エタンガスを冷たい金属カップに凝縮して、金属カップ内の液体エタンを準備します。微小管相互作用タンパク質を希釈バッファーで等量に希釈してから、グリッドに適用して細胞濃度を下げます。ミキサーを摂氏37度に置きます。プランジ凍結装置の近くに加熱ブロックがない場合は、絶縁ポリスチレンボックスに暖かい金属ブロックを使用してください。プランジピンセットでグロー放電グリッドをつかみ、プランジフリーザーにクリックします。液体エタンの入ったポリスチレン容器をプランジフリーザーに入れ、準備したプログラムを実行します。まず、3.5マイクロリットルの微小管溶液をグリッドに塗布します。急落冷凍庫でグリッドを吸い取ります。その後、すぐに3.5マイクロリットルの希釈タンパク質を塗布します。そして最後に、プランジャーを吸い取り、液体エタンでグリッドを急落させて凍結させます。グリッドをグリッド収納ボックスに移し、イメージングするまで液体窒素デュワーに保管します。抽出した微小管の品質と濃度をクーマシー染色SDSゲルで評価した。BSA曲線によるP2レーンの約50キロダルトンの微小管バンドの補間から導出された相対BSA量の非線形回帰直線は、ミリリットルあたり1.42ミリグラムの最終濃度を示しています。これは、分光光度計で2人で測定した数とよく一致します。新たに抽出した微小管を使用して、クライオEMサンプルを作成しました。微小管は顕微鏡写真では無傷で豊富に見えます。顕微鏡写真あたりの微小管密度は、微小管が互いに交差するのを避けるために高すぎてはいけません。微小管の破損は、微小管が解重合しているか、微小管の濃度が濃すぎることを示しています。MATCAPに結合した微小管は、微小管表面に電子密度の高いドットを特徴とする粗いエッジを有していた。MATCAP結合微小管とMATCAP非結合微小管も、計算された2Dクラスで区別できました。この方法でクライオEMグリッドを作成することで、特定の相互作用タンパク質に結合した微小管の構造を調べることができます。これは、構造細胞生物学におけるメカニズムのより良い理解につながる可能性があります。

extracting-modified-microtubules-from-mammalian-cells-to-study

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

私たちは、収集する方法のプロトコル全体ミトコンドリアのプロセス電子クライオ断層像を提示する。技術はネイティブ生体膜に大きな膜タンパク質複合体の構造、機能、および組織への詳細な洞察を提供しています。...

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

ここでは、極低温固体ミリングによって、哺乳動物細胞を破壊し、得られた細胞粉末から細胞抽出物を生成し、そして抗体結合ミクロンスケールの常磁性ビーズ上にアフィニティー捕捉により、目的のタンパク質複合体を単離するためのプロトコルを説明します。...

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

ミトコンドリアは、細菌や細胞質相手から乖離したリボソームを特化しました。HEK 細胞の彼らのネイティブのコンパートメントからの mitoribosomes の取得方法を紹介します。懸濁細胞からミトコンドリアの分離と mitoribosomes...

HEK 細胞から Mitoribosome の急速な隔離

このプロトコルは、APEX2タグ付けされた膜タンパク質を、最適に保存された細胞超構造内の透過電子顕微鏡法によって局在させることができるクライオAPEX法を記述する。...

超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオAPEX法

クライオに焦点を当てたイオンビームマイクロマシニングによる、凍結した生体試料のラメラ調製プロトコルを提示し 、その場で...

クライオ電子断層撮影のための サッカロミセス・セレビシエ の調製とクライオFIBマイクロマシニング

cryoEMを用いた高分子複合体の構造決定は、ある種のタンパク質や複合体に対して日常的なものとなっている。ここでは、このパイプラインが要約され(サンプルの準備、スクリーニング、データの取得と処理)、読者は、より困難な標本の場合に変更される可能性があり、さらに詳細なリソースと変数に向けられています。...

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

チューブリンポリマーである微小管は、真核細胞の細胞骨格成分として重要な役割を果たしており、動的に不安定であることで知られています。本研究では、微小管を分画して安定微小管、不安定な微小管、遊離管に分離し、マウスの各種組織における微小管の安定性を評価する方法を開発しました。...

マウス組織における安定微小管、不安定な微小管、遊離チューブリンを分離するための定量的微小管分画技術

本プロトコルは、Tomo5を用いた高分解能クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集と、その後のデータ処理およびemClarityを用いたサブトモグラム平均化について記述する。アポフェリチンは、2.86...

クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集とサブトモグラム平均化

このプロトコールは、 Methanocaldococcus jannaschii...

極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

このワークフローは、極低温トライコンシブイメージングプラットフォームを使用して、小さく(軸方向&lt;1μm)希少な(細胞あたり1コピー)蛍光標識された生物学的構造を標的としたラメラ生成を可能にします。このプラットフォームは、蛍光顕微鏡、集束イオンビームミリング、走査型電子顕微鏡を単一の焦点位置に統合し、ミリング中の同時蛍光顕微鏡を可能にします。...

極低温同時蛍光、電子、イオンビーム顕微鏡を用いた細胞のターゲットミリングのためのワークフロー

このプロトコルは、高圧凍結(HPF)とワッフル法、低温集束イオンビーム(cryo-FIB)リフトアウト、線量対称の並列取得を統合することで、厚組織のクライオ電子断層撮影(cryo-ET)を標準化し、マウス海馬での再現可能な 現地...

マウス海馬における厚組織のクライオ電子断層撮影ワークフロー

学ぶ哺乳類細胞からの修飾微小管抽出法。HCT116細胞を用いて超遠心分離とGTP・パクリタキセル処理により微小管を重合させ、クライオ電子顕微鏡解析に適した高品質サンプルを調製する手法を解説。

クライオ電子顕微鏡による微小管-タンパク質複合体の研究のための哺乳類細胞からの修飾微小管抽出

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