Name: 単一核RNAシーケンシングとATACシーケンシングの組み合わせ、およびバルクメタボロミクスのための凍結非ヒト霊長類胎児膵島の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T12:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 39 s
Description: 学ぶ凍結非ヒト霊長類胎児膵島からの核分離法。RNAシーケンスとATACシーケンス、バルクメタボロミクスを同時に実施し、代謝とゲノムの相互作用を包括的に解析する革新的プロトコルです。

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<meta charset="utf8"></head><body>RNAから代謝物へ:非ヒト霊長類胎児膵島のマルチオミクスプロファイリング

<ol><li>Christensen, A. A., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+cell+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Diab+Rep%22%5BJournal%5D)">The beta cell in type 2 diabetes.</a> Curr Diab Rep. 19 (9), 81(2019).</li>
<li>Elsakr, J. M., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+programming+of+the+pancreatic+islet+by%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental programming of the pancreatic islet by.</a> Trends Dev Biol. 10, 79-95 (2017).</li>
<li>Salzberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+and+lifestyle+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Prim+Care%22%5BJournal%5D)">Risk factors and lifestyle interventions.</a> Prim Care. 49 (2), 201-212 (2022).</li>
<li>Pound, L. D., Kievit, P., Grove, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+non-human+primate+as+a+model+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Endocrinol+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">The non-human primate as a model for type 2 diabetes.</a> Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 21 (2), 89-94 (2014).</li>
<li>Kang, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA+sequencing+of+human+pancreatic+islets+identifies+novel+gene+sets+and+distinguishes+%CE%B2-cell+subpopulations+with+dynamic+transcriptome+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes β-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles.</a> Genome Med. 15 (1), 30(2023).</li>
<li>Basile, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single-nucleus+RNA-sequencing+to+interrogate+transcriptomic+profiles+of+archived+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Using single-nucleus RNA-sequencing to interrogate transcriptomic profiles of archived human pancreatic islets.</a> Genome Med. 13 (1), 128(2021).</li>
<li>Cabé, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+brain+and+bone+marrow+nuclei+preparation+for+single+nuclei+multiome+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-quality brain and bone marrow nuclei preparation for single nuclei multiome assays.</a> J Vis Exp. (202), e65715(2023).</li>
<li>Nuclei from embryonic mouse brain for single cell multiome ATAC + gex sequencing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com">https://www.10xgenomics.com</a> (2022).</li>
<li>Elsakr, J. M., Deeter, C., Ricciardi, V., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+non-human+primate+pancreatic+islet+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of non-human primate pancreatic islet oxygen consumption.</a> J Vis Exp. (154), e60696(2019).</li>
<li>Chromium next gem single cell multiome ATAC + gene expression reagent kits user guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com">https://www.10xgenomics.com</a> (2022).</li>
<li>Maruyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+aqueous+metabolites+from+cultured+adherent+cells+for+metabolomic+analysis+by+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis by capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (148), e59551(2019).</li>
<li>Ooga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+anatomy+of+an+animal+model+revealing+homeostatic+imbalances+in+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia.</a> Mol Biosyst. 7 (4), 1217-1223 (2011).</li>
<li>Ohashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depiction+of+metabolome+changes+in+histidine-starved+Escherichia+coli+by+CE-TOFMS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS.</a> Mol Biosyst. 4 (2), 135-147 (2008).</li>
<li>Chiou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+identifies+pancreatic+islet+cell+type%E2%80%93+and+state-specific+regulatory+programs+of+diabetes+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility identifies pancreatic islet cell type– and state-specific regulatory programs of diabetes risk.</a> Nat Genetics. 53 (4), 455-466 (2021).</li>
<li>Pang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaboanalyst+6.0%3A+Towards+a+unified+platform+for+metabolomics+data+processing%2C+analysis+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Metaboanalyst 6.0: Towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation.</a> Nucleic Acids Res. , 253(2024).</li>
<li>Willency, J. A., Lin, Y., Pirro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics+in+human+and+animal+biofluids+and+tissues+using+liquid+chromatography+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics in human and animal biofluids and tissues using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry.</a> STAR Protoc. 5 (1), 102884(2024).</li>
<li>Behnke, J. -S., Urner, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+mass+spectrometry+detergents+for+membrane+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Emergence of mass spectrometry detergents for membrane proteomics.</a> Anal Bioanal Chem. 415 (18), 3897-3909 (2023).</li>
<li>Ouimet, C. M., D'amico, C. I., Kennedy, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+capillary+electrophoresis+and+the+implications+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in capillary electrophoresis and the implications for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 213-224 (2017).</li>
<li>Alexandrov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+metabolomics+and+imaging+mass+spectrometry+in+the+age+of+artificial+intelligence%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Data+Sci%22%5BJournal%5D)">Spatial metabolomics and imaging mass spectrometry in the age of artificial intelligence.</a> Annu Rev Biomed Data Sci. 3, 61-87 (2020).</li>
<li>Ewald, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+multi-omics+integration+using+the+analyst+software+suite%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Web-based multi-omics integration using the analyst software suite.</a> Nat Protoc. 19, 1467-1497 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>33 G ラット脳カニューレ注射器</td><td>プロテック インターナショナル</td><td>8IC315IS5SPC</td><td>管カニューレ挿入および膵臓拡張用</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>フィッシャー</td><td>15-140-122</td><td>RT メディア用</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ミリポア/シグマ</td><td>F4135-500ML</td><td>RT メディア用</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-875-135</td><td>RT メディア用</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ P</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>11213865001</td><td>膵臓の消化用</td></tr><tr><td>ウシ Dnase I</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>11284932001</td><td>RT培地および単離用</td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>フィッシャー</td><td>D16-1</td><td>最終濃度は2.8 mM</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>フィッシャー</td><td>C4901-500G</td><td>最終濃度は0.5 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>最終濃度は 10 mM</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA) フラクション 5</td><td>研究製品 国際</td><td>A30075100</td><td>最終濃度は 0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイド イーグル ミディアム</td><td>ギブコ</td><td>11966025</td><td>ハンドピッキング用 膵島</td></tr><tr><td>20x Nuclei バッファー</td><td>10X Genomics</td><td>2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>ジジトニン (5%)</td> サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BN2006</td><td>ジギトニンは65°Cに温める必要があるかもしれません。Cは、白い沈殿物</td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers(30&micro;M)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSAストック溶液(10%)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>i8896</td> MilliQ水Trizma塩酸塩溶液、pH 7.5 Sigma Aldrich T2319-1L<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム溶液、5 M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6546-1L</td><td></td>を使用して10%ストックを調製します</tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液、1 M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Protector Rnase 阻害剤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Research Products International</td><td>D11000-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-Free 使い捨てペレット乳棒</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td>MilliQ ウォーター</td></tr>ヌ<tr><td>クレアーゼフリーウォーター</td><td>Promega</td><td>PR-P1193</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind チューブ (5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials (1.5 mL)</td><td>VWR</td><td>20170-225</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click Tubes (0.6 mL)</td><td>Denville</td><td>C-2177</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0.4%)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T-10282</td><td></td></tr><tr><td>デュアルチャンバーセルカウンティングスライド</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1450011</td><td></td></tr><tr><td>MiiliQ 超純水システム</td><td>ミリポア/シグマ</td><td>7003/05/10/15</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa カットオフフィルター</td><td>HMT メタボロームテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ 内部標準</td><td>HMT メタボロームテクノロジー</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>P10、P20、P200、P1000 ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>2231000602</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、10 & マイクロ;L</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、1000 &micro;L</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21-236-2A</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、20 & マイクロ;L</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-404</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、200 & マイクロ;L</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>位相差顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>BX41-PH-B</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 自動セルカウンター</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30R 遠心分離機</td><td>Beckman-Coulter</td><td>B06315</td><td></td></tr><tr><td>RNase-ZAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2020</td><td></td></tr></tbody></table>

単一核rnaシーケンシングとatacシーケンシングの組み合わせ、およびバルクメタボロミクスのための凍結非ヒト霊長類胎児膵島の調製

Preparation of Frozen Non-Human Primate Fetal Islets for Combined Single Nuclei RNA-Sequencing and ATAC-Sequencing, and Bulk Metabolomics

シーケンシング出力の品質は、核入力の品質に大きく依存します。核のブレブや外側の核膜の損傷により、分析中に周囲のRNAとDNAが汚染され、データにノイズが入ります。純粋な核抽出物は、細胞質成分でカプセル化された核の証拠が最小限であること(図2A)または核の破裂によって証明される過剰消化(図2B)の証拠が少なくなります。理想的な核インプットには、無傷の原子核が含まれます(図2C)。
単一核のRNAおよびATACシーケンシングデータの解析の詳細は、他の場所で広く提供されている5,14。胎児のNHP核調製物からの細胞集団の代表的なクラスターは、図3AのUMAPを介して示されています。メタボロミクスのデータは、前述の15のように、オープンソースのソフトウェアを用いて容易に解析することができる。生成されたスペクトルを視覚化し、WSD給水ダムからの胎児膵島内の濃縮代謝物をCD給餌ダムからの代謝物と比較できます(図3B-F)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66849/66849fig01.jpg"> 図1:核および細胞質画分の単離のためのプロトコールの概要。 胎児の膵島は、アッセイの日まで-80°Cでバンクされ、保存されました。核を単離し、単一核RNAおよびATACシーケンシングに利用しました。核単離の最初の洗浄後の細胞質画分は、キャピラリー電気泳動-質量分析のために保持されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66849/66849fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66849/66849fig02.jpg"> 図2:単一核マルチオミクスアッセイへの適切な核インプットのデモンストレーション。 (A)細胞質によってカプセル化された核、(B)核膜が損なわれた破裂性核、および(C)丸みを帯びた形態の無傷の核の例。スケールバー:10μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66849/66849fig02large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66849/66849fig03.jpg"> 図3:単一核マルチオミクスとバルクメタボロミクスを組み合わせた代表的なデータ。 (ア) 遺伝子発現に基づく単離された胎児NHP膵島内の細胞サブタイプのUMAPクラスタリング。単離された胎児NHP島からの細胞質画分中の解糖代謝産物、(B)ジヒドロキシアセトンリン酸および(C)グリセロール-3-リン酸の定量的推定 ダムにWSD(mWSD)またはCD(mCD)が供給された場合。母親の食事療法はまた、(D)クエン酸回路(2-オキソグルタル酸)、(E)アミノ酸代謝(クレアチン)、および(F)胎児膵島の細胞酸化還元状態(グルタチオン)を変更することにより、代謝を異なる方法で調節する可能性があります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66849/66849fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:核を単離するための緩衝液の組成。 核、溶解、溶解希釈、および洗浄バッファーの詳細な成分が示されています。必要に応じて、バッファーを調製する前に試薬をストック濃度まで希釈してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66849/66849_Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

単一核RNAシーケンシングとATACシーケンシングの組み合わせ、およびバルクメタボロミクスのための凍結非ヒト霊長類胎児膵島の調製

One challenge in studies using tissue collected from multiple cohorts is avoiding batch effects when preparing for large-scale multi-omic experiments, ...

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