免疫適格マウスを気管内に接種するための寒天ビーズ包埋 型マイコバクテリウム膿瘍 の調製

私たちは、前臨床試験で抗生物質の有効性をテストするために、慢性マイコバクテリウム膿瘍肺感染症のマウスモデルを開発しています。最初の課題は、マイコバクテリウム膿瘍に対するマウスの固有の耐性を克服することです。2 番目の課題は、気管内感染用の寒天ビート包埋細菌の再現性のあるバッチを生成することです。私たちは、マウスで新薬をテストするために他の研究室で簡単に実装できる寒天ビートの調製と感染の詳細なプロトコルを共有したいと考えています。

遊離菌の代わりに寒天に包埋した細菌に感染すると、免疫能力のあるマウスが自発的に感染を取り除く能力が部分的に克服されます。このモデルは、マイコバクテリウム膿瘍に対する新しい抗生物質を評価するための堅牢な前臨床ツールを提供し、肺感染症に対して切望されている抗生物質の発見と開発を促進します。

[講師]まず、光学密度30に調整された指数関数的に成長するマイコバクテリウム膿瘍懸濁培養物を取得します。摂氏50度で事前に平衡化された27ミリリットルの溶融トリプティク大豆オーガーを、3ミリリットルの細菌懸濁液を含むチューブに移します。ピペッティングで懸濁液を混合します。バクテリアオーガー混合物を、フラスコに60ミリリットルの鉱物油を入れたフラスコに慎重にピペットで入れます。フラスコを二次容器に入れ、すぐに磁気攪拌バーを使用して磁気攪拌で中速で攪拌を開始します。オイルオーガー混合物に目に見える渦が形成されることを確認し、室温で6分間攪拌を続けます。氷を二次容器に入れて懸濁液を冷まします。次に、スラリー混合物を250ミリリットルの遠心分離管に移します。懸濁液を摂氏4度で3,700Gで6分間遠心分離し、最初の5サイクルでオーガービーズペレットを再懸濁します。また、漏斗セルストレーナー、コネクタリング、50ミリリットルチューブを1つのユニットに組み立てます。10回目の洗浄後、ペレットを再懸濁し、ビーズ懸濁液を4回希釈します。希釈したサンプル材料をストレーナーに加え、ビーズ懸濁液をろ過します。コネクタリングに取り付けられた30ミリリットルシリンジのピストンをゆっくりと引っ張って、吸引力を生み出し、ろ過を強化します。次に、希釈した懸濁液を1000 Gで2分間遠心分離して濃縮します。ビーズペレットを50ミリリットルのチューブに引き込んだ後、摂氏4度で最大1週間保存しますが、実験のバッチごとに新鮮なビーズを準備します。まず、カスタム設計の3次元印刷された傾斜したスタンドを使用して、鎮静剤を投与したCD1マウスを拘束します。スタンドの中央のロッドに取り付けられた縫合糸を使用して、マウスの切歯でマウスを固定します。マウスを頭を上げて腹側に横たわった姿勢にします。金属製の24ゲージの動物給餌針を、マイコバクテリウム膿瘍オーガービーズ懸濁液で満たされたガラス注射器に取り付けます。プランジャーにナイロンクリップまたはストッパーを置き、マウスあたり50マイクロリットルの接種量を制御します。次に、金属製の強制経口針をマウスの上に垂直に置きます。針を上部に慎重に挿入し、気管にさらに下にスライドさせます。ナイロンクリップまたはストッパーを取り外し、50マイクロリットルのマイコバクテリウム膿瘍オーガービーズ懸濁液をゆっくりと肺に分配します。マウスを5分間休ませます。次に、接種手順を 2 回繰り返して、完全な接種物が肺に深く再現性のある沈着することを確認します。マイコバクテリウム膿瘍を含むオージェビーズは、mCherry赤色蛍光タンパク質を発現し、サイズは約70〜250マイクロメートルまでさまざまでした。6つの独立したビーズ調製物にわたる細菌負荷は、高い再現性を示しました。ガラス注射器を通過する前後の細菌計数では、細菌負荷の有意な損失は見られませんでした。気管間接種法は、感染後 24 時間の肺 CFU 数で示されるように、3 つの独立したビーズ製剤にわたって再現性がありました。感染後 24 時間の肺 CFU 数がすべてのグループで一貫していたため、3 人の独立したオペレーター間の感染再現性が確認されました。