לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון
Summary
אנו תיאר תכונות מבניות של גליה-neuromuscular הסינפסות הכנה בתוך-out רקמת הרומן של זחלי זבוב חי באמצעות צבעי ניאון עם מיקרוסקופיה confocal. אנחנו שכותרתו מסופי נוירון לחיות עם נוגדנים העיקרי ניאון HRP, וגם דמיינו את החלל perisynaptic עם Dextrans ניאון.
Abstract
הפרויקט שלנו זיהו מבנים GFP גליה שכותרתו בבית סינפסה בפיתוח לטוס הזחל neuromuscular. כדי להסתכל על ההתפתחות של עצב גליה-שרירים וסינפסות לחיות, פיתחנו הכנה רקמות הזחל כי היו תכונות של זחלים חיים שלמים, אך גם תכונות אופטיות טובות. זו הכנה החדשה אפשרה גישה של perfusates כדי הסינפסה. השתמשנו זחלי זבוב, טובל אותם hemolymph מלאכותי, רגוע הצירים הרגילים שלהם על ידי גוף קצבית מצמררת אותם. לאחר מכן ניתחנו את פלחי האחורי של כל חיה עם סיכה חרקים בוטה דחף את חלקי הפה לאחור דרך חלל הגוף. זה everted הקיר גוף הזחל, כמו הפיכת גרב מבפנים החוצה. סיימנו את דיסקציה עם Ultra-בסדר מספריים לנתיחה וחשוף ולכן הצד הקרביים של שרירי הגוף הקיר. המבנים גליה ב NMJ הביע GFP קרום ממוקד בשליטת היזמים ספציפי גליה. הממברנה הפוסט סינפטית, SSR (Reticula Subsynaptic) בשריר הביע ממוקד synaptically dsRed. היינו צריכים בחריפות התווית מסופי הנוירון המוטורי, החלק השלישי של הסינפסה. כדי לעשות זאת אנחנו מוחלים נוגדנים העיקרי HRP, מצומדות כדי flurophore מרחיקות אדום פולטות. כדי לבדוק תכונות דיפוזיה צבע לחלל perisynaptic בין מסופי הנוירון המוטורי ואת SSR, אנו ליישם פתרון של מולקולות גדולות dextran מצומדות כדי flurophore מרחיקות אדום פולטות ותמונות שנאספו.
Protocol
Discussion
הליך זה מאפשר לטווח ארוך הדמיה של חלבונים שכותרתו לחיות תהליכים בתא. הכנה ברקמות באתרו שתיארנו יש CNS שלם ומתפקד, PNS ומעגלים רפלקס. זו הכנה רקמה יש יתרונות על פני תקן הזחל שריר פרוטוקולים לעוף, שבו השריר הזחל קיר הגוף נמתח (כאשר הוא ניצח בחוץ). מתיחה יכול לעוות מורפו?…
Acknowledgements
פרויקט זה מומן על ידי CIHR ו NSERC. ברצוננו להודות Jusiak ברב לתרום ליצירת זני לטוס להביע SSR שכותרתו dsRed (קו ב"ג), ואת מתקן ביו הדמיה UBC.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium. | Reagent | NA | NA | 5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma). 2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph. References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004 |
| Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | D34680 | Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low |
| Anti-HRP-CY5 conjugate (goat) | Reagent | Jackson ImmunoResearc | 123-175-021 | Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6 |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | A10475 | We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling. |
| Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379 | Reagent | Cargill Labs | Custom Formulated | |
| Ultra Fine Forceps | Tool | Fine Science Tolls | 11252-23 or 11295-20 | |
| Spring scissors | Tool | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Perfusion Chamber RC 20 Series | Tool | Warner Instruments | 64-02222 | |
| Spinning Disc confocal | Microscope | Quorum | Quorum Wave FX | Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope |
References
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).
- Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals. Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).
- Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
